마우스 뇌 조직 절편에서 형광 표지된 성상세포의 면역염색

형광 단백질을 발현하는 성상세포의 희박한 집단을 포함하는 고정된 마우스 뇌 조직 절편을 취하십시오.

세포를 투과화하기 위해 세제 함유 완충액으로 자유 부유 섹션을 처리합니다.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 완충액에서 절편을 배양합니다.

1차 항체로 절편을 처리하고 항체가 성상세포의 형광 단백질에 결합할 수 있도록 배양합니다.

완충액을 사용하여 과도한 1차 항체를 씻어냅니다.

다음으로, 1차 항체에 결합하는 형광단 태그가 부착된 2차 항체와 함께 절편을 배양합니다.

결합되지 않은 2차 항체를 완충액으로 씻어냅니다.

절편을 완충액 탈이온수 혼합물로 옮겨 세제 잔류물을 제거합니다.

완충액 탈이온수가 들어 있는 슬라이드에 섹션을 놓습니다. 여분의 액체를 제거하고 마운팅 매체를 추가합니다. 그런 다음 커버슬립을 배치하고 고정합니다.

마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 섹션 내에서 표지된 형광 단백질 발현 성상세포를 시각화합니다.

시작하려면 10밀리리터 튜브에 10% Triton X 50밀리리터를 넣고 튜브에 TBS를 50밀리리터까지 채워 TBST의 새로운 용액을 준비합니다. 염소 혈청과 TBST를 15밀리리터 튜브에 혼합하여 각 뇌에 대해 2밀리리터의 차단 및 항체 용액을 준비합니다.

다음으로, 24웰 플레이트에 라벨을 붙여 서로 다른 행, 서로 다른 용액, 서로 다른 열에 서로 다른 샘플을 배치합니다. 그런 다음 'Wash 1', 'Wash 2' 및 'Wash 3'으로 표시된 처음 세 컬럼에 TBST 1밀리리터를 추가하고 네 번째 컬럼에 차단 용액 1ml를 추가합니다.

분젠 버너를 사용하여 5.75인치 파스퇴르 피펫의 끝을 작은 후크에 녹여 유리 픽을 준비합니다. 그런 다음 픽을 사용하여 12웰 플레이트에서 24웰 플레이트의 'Wash 1' 컬럼으로 조직 절편을 옮깁니다. 그런 다음 유리 픽을 사용하여 한 웰에서 다음 웰로 절편을 옮기고 세척 1, 2 및 3 웰에서 각각 10분 동안 절편을 세척한 다음 차단 용액에서 1시간 동안 절편을 배양합니다.

다음으로, 1차 항체의 절편을 섭씨 4도에서 2-3일 밤 동안 쉐이크하면서 배양합니다. 1차 항체 배양 후, 세척 웰에서 1일차 TBST를 흡인합니다. 그런 다음 각 세척 우물에 새 TBST 1밀리리터를 추가하고 섹션을 첫 번째 세척 우물로 옮깁니다.

다음으로, 2차 항체에서 절편을 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 2차 항체 배양 후, 세척 웰에서 2일차 TBST를 흡인합니다. 그런 다음 각 세척 우물에 새 TBST 1밀리리터를 추가하고 섹션을 첫 번째 세척 우물로 옮깁니다.

최종 세탁 중에 마운팅 미디어를 섭씨 4도에서 꺼내 실온으로 데우십시오. 그런 다음 탈이온수에 TBS의 2:1 혼합물을 준비하고 페트리 접시에 첨가합니다. 다음으로, 탈이온수에 2:1 혼합물의 TBS 혼합물 800마이크로리터를 표면에 첨가하여 현미경 슬라이드를 준비합니다.

'Wash 3' 웰의 섹션을 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 미세한 붓을 사용하여 페트리 접시에서 슬라이드의 액체로 한 번에 하나씩 섹션을 옮깁니다. 그런 다음 붓을 사용하여 슬라이드 위에 평평하게 되도록 섹션을 조심스럽게 배열합니다. P1000 피펫을 사용하여 슬라이드에서 과도한 액체를 조심스럽게 제거한 다음 진공 흡인합니다.

슬라이드에서 여분의 액체를 모두 제거한 후 전사 피펫을 사용하여 즉시 각 섹션에 장착 매체 한 방울을 추가하고 슬라이드 위에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 마운팅 매체를 몇 분 동안 퍼뜨린 다음 진공 흡인으로 커버슬립 아래에서 나오는 여분의 마운팅 매체를 제거합니다. 그런 다음 커버슬립의 네 가장자리를 모두 투명한 매니큐어로 밀봉합니다.