인간 사후 소뇌 조직에서 Purkinje 세포를 분리하기 위한 레이저 캡처 미세해부

푸르킨제 세포, 과립 및 분자 세포층을 포함하는 인간 사후 소뇌 조직을 취하십시오.

부분적으로 동결된 포매 배지가 들어 있는 극저온 조절기 샘플 홀더에 놓습니다.

미디어가 완전히 얼어서 조직을 고정합니다.

이 어셈블리를 극저온 조절기 절단 암으로 옮기고 조직이 극저온 조절기 온도에 적응하도록 합니다.

조직을 칼날에 더 가깝게 옮기고 다듬어 피질층을 노출시킵니다.

블레이드 위에 롤 방지 플레이트를 놓고 소뇌 절편을 얻습니다.

이 절편을 멤브레인 슬라이드로 옮깁니다.

조직 고정 및 탈수를 위해 증가하는 에탄올 농도에서 배양합니다.

그런 다음 자일렌에서 배양합니다.

슬라이드를 건조시키고 UV 레이저 캡처 현미경 스테이지에 놓습니다.

수집 캡을 소뇌 조직 위에 놓습니다.

현미경으로 푸르킨제 세포에 초점을 맞춥니다.

레이저를 사용하여 추가 분석을 위해 푸르킨제 세포를 캡처하고 수집합니다.

먼저, 절편을 위해 작은 조직 조각을 잘라서 절편이 약 95%가 소뇌 피질인지 확인합니다. 나머지 조직은 드라이아이스나 섭씨 영하 80도의 냉동실에 다시 넣습니다. 그런 다음 천천히 원을 그리며 척 위에 OCT를 천천히 추가하기 시작합니다. 척을 덮는 약 3mm 높이의 마운드가 생길 때까지 OCT 층을 쌓습니다.

OCT가 부분적으로 얼었지만 중앙에 약간의 액체가 남아 있으면 마운드 위에 티슈를 놓습니다. 완전히 얼 때까지 조직을 OCT 위에 1-2분 동안 놓습니다. 그런 다음 냉동 OCT와 조직이 있는 척을 극저온 조절기 절단 암으로 옮깁니다. 절단 날과 같은 높이가 되도록 조직을 조정하고 조직을 절단 암에 20분 동안 앉혀 새로운 온도에 적응시킵니다.

가장 중요한 단계는 조직이 필요한 만큼 오랫동안 극저온 조절기 절단 암에 적응하도록 하는 것입니다. 조직이 파편 찢어지면 푸르킨제 세포 시각화가 매우 어려울 것입니다. 조직이 더 빨리 적응할 수 있도록 더 작고 얇은 조직 조각을 사용하는 것이 좋습니다.

그런 다음 조직을 날에 더 가깝게 천천히 이동합니다. 조직이 칼날에 도달하면 트리밍 과정을 시작합니다. 피질층이 보일 때까지 조직을 2-3회 다듬습니다.

그런 다음 극저온 조절기 블레이드 바로 위에 롤 방지판을 놓고 정렬합니다. 두께가 14마이크로미터인 4-6개의 섹션을 절단하고 적절하게 절단된 섹션은 안티롤 플레이트 아래에서 평평합니다. 절단 섹션을 극저온 조절기 스테이지를 가로질러 수평으로 정렬합니다.

슬라이드의 각도를 조정하여 모든 조직 조각을 동시에 집습니다. 조직을 절편한 직후, 슬라이드를 70% 에탄올이 담긴 슬라이드 홀더에 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 슬라이드를 얼음 위에 95% 에탄올이 담긴 슬라이드 홀더에 45초 동안 옮깁니다.

그런 다음 슬라이드를 100% 에탄올이 담긴 슬라이드 홀더에 실온에서 2분 동안 놓습니다. 실온에서 자일렌 번호 1이 들어 있는 슬라이드 홀더에 슬라이드를 3번 담그십시오. 그런 다음 슬라이드를 실온에서 자일렌 2가 담긴 슬라이드 홀더에 5분 동안 놓습니다. 슬라이드를 깨끗한 연기에 세우고 최소 30분 동안 자연 건조시킵니다.

먼저, 오염을 제거한 RNase를 사용하여 캡 수집 암의 현미경 스테이지를 청소합니다. 장갑을 낀 손으로 슬라이드를 현미경 위에 놓고 수집 암에 500마이크로리터의 불투명 캡을 놓습니다. 낮은 배율로 불투명 캡을 소뇌 조직 위에 정렬하여 캡이 접안렌즈에 보이는 전체 영역을 덮

5배에서 10배 대물렌즈를 사용하여 소뇌층을 시각화합니다. 분자층과 과립세포층이 교차하는 부분 위에 커서를 놓습니다. 40배 배율로 이동하여 푸르킨제 세포를 시각화합니다. 그런 다음 캡처를 시작합니다.