0 조회수 • 3:55 분 • July 8th, 2025
냉동 쥐 뇌 조직의 일부를 해동합니다.
버퍼를 넣고 조직을 다지십시오. 그런 다음 완충액이 들어 있는 튜브에 옮기고 혼합합니다.
혼합물을 원심분리하고 상층액을 버립니다.
단백질 분해 효소 용액을 조직에 추가하고 대구경 피펫을 사용하여 재현탁합니다.
혼합물을 배양하여 세포외 기질을 분해하여 신경 세포를 느슨하게 합니다.
혼합물을 원심분리하고 상층액을 버립니다.
조직 조각을 냉각된 완충액에 재현탁하고 반복적으로 피펫팅하여 세포를 해리시킵니다.
파편과 해리되지 않은 세포가 침전되도록 한 다음 단일 세포 현탁액을 새 튜브로 옮깁니다.
세포를 얼음처럼 차가운 에탄올에 옮기고 혼합합니다. 세포를 고정하고 투과화하기 위해 배양합니다.
현탁액을 원심분리하고 상청액을 버립니다.
추가 분석을 위해 신경 세포를 차가운 완충액에 재현탁합니다.
조직을 다지려면 샘플을 1-2방울의 완충 A 용액으로 덮기 전에 차가운 유리판에서 1분 이상 해동하지 마십시오. 그런 다음 면도날을 접시에 완전히 수직으로 잡고 각 직교 방향으로 조직을 100번 다집니다. 조직을 완전히 다지려면 완충액 A로 조직을 적시게 유지하고 지정된 다진 시간과 방향을 따르는 것이 중요합니다.
조직 해부 중에 대부분의 백질을 제거하고 조직을 완충액 A로 덮어 다진 상태로 유지하여 다진 효율을 개선하고 세포의 건강을 유지하는 것이 중요합니다.
조직이 완전히 처리되면 면도날을 사용하여 조각을 1밀리리터의 저온 완충액 A가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 3-5번 뒤집어 다진 모든 조직을 용액에 담급니다. 조직 조각을 단일 세포 현탁액으로 해리하려면 원심분리를 통해 샘플을 펠릿화합니다.
상청액을 버린 다음 미세튜브의 내벽 아래로 차갑고 갓 해동된 효소 용액 1밀리리터를 천천히 추가하고 팁 직경이 큰 피펫을 사용하여 각 펠릿 전체를 즉시 흡인하고 분배하여 다진 조직 조각을 분산시킵니다. 다음으로, 펠릿이 튜브 바닥에 달라붙는 것을 방지하기 위해 마이크로튜브를 빠르게 반전시키고 섭씨 4도에서 30분 동안 종단 간 혼합으로 샘플을 배양합니다.
소화가 끝나면 튜브를 다시 원심분리하고 0.6밀리리터의 저온 완충액 A를 세포에 첨가합니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 즉시 펠릿을 흡인하여 5회 분배한 다음 1.3mm 유리 피펫을 선택하여 샘플을 10회 부드럽게 적정합니다.
샘플을 얼음 위에 2분 동안 놓아 파편과 해리되지 않은 세포가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 그런 다음 상청액을 새 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 수집된 상청액의 첫 번째 튜브에서 800마이크로리터의 세포를 처음 두 개의 에탄올 튜브 각각으로 옮깁니다.
튜브를 뒤집어 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 15분 동안 놓고 5분마다 반전하여 혼합합니다. 배양이 끝나면 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 마이크로튜브의 벽만 만지고 마이크로피펫을 사용하여 각 상청액의 마지막 50마이크로리터를 제외한 모든 것을 천천히 제거합니다.