마우스 뇌 조직에서 세포막 단백질의 팔미토일화 상태 평가

마우스 뇌 조직에서 세포막 단백질을 채취합니다.

이 단백질은 시스테인 잔기에 부착된 지방산인 팔미토일 그룹으로 번역 후 변형을 나타냅니다.

환원 완충액을 첨가하고 고온에서 배양하여 팔미토일화되지 않은 시스테인 사이의 결합을 끊어 노출시킵니다.

노출된 시스테인에 결합하는 차단 시약과 함께 배양하여 팔미토일화된 시스테인만 반응성을 남깁니다.

용액을 옮기고 클로로포름, 메탄올, 탈이온수와 혼합한 후 원심분리하여 단백질을 침전시키고 불순물을 제거합니다. 다음으로, 메탄올을 넣고 원심분리하고 남아 있는 오염 물질을 버립니다.

완충액을 추가하고 초음파 처리하여 펠릿을 가용화 한 다음 원심 분리하여 불용성 물질을 제거합니다.

절단 시약을 적용하여 팔미토일화된 시스테인에서 팔미토일 그룹을 제거합니다.

클로로포름-메탄올 침전을 반복하고 불순물을 제거합니다.

차단되지 않은 시스테인에 결합하는 폴리머와 함께 배양하여 팔미토일화된 단백질을 식별하는 데 도움이 됩니다.

클로로포름-메탄올 침전을 반복하고 결합되지 않은 폴리머를 제거합니다.

분리된 단백질의 팔미토일화 상태를 추가로 분석하기 위해 펠릿을 재현

먼저, 가용화된 단백질을 섭씨 55도에서 60분 동안 25마이크로리터의 TCEP에 배양하여 이황화 결합을 파괴합니다. 그런 다음 용액을 12.5마이크로리터의 NEM 원액과 함께 실온에서 3시간 동안 배양하여 유리 시스테인을 차단합니다.

다음으로 클로로포름-메탄올 침전 과정을 시작합니다. 단백질 용액을 1.5밀리리터 튜브에서 스윙 버킷 로터에서 적당한 속도로 원심분리할 수 있는 폴리프로필렌 또는 유리 튜브로 옮깁니다. 메탄올 2밀리리터를 넣고 잠시 소용돌이치십시오. 클로로포름 1밀리리터를 넣고 잠깐 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 1.5밀리리터의 탈이온수를 넣고 다시 잠시 소용돌이치

필요한 경우 튜브를 뒤집어 완전히 혼합되도록 합니다. 스윙 버킷 로터에서 3,000배 G 및 섭씨 25도에서 30분 동안 샘플을 원심분리합니다. 튜브에 용액의 상상을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 메탄올 1.5밀리리터를 첨가합니다. 불투명한 단백질 팬케이크가 깨지지 않도록 주의하면서 튜브를 부드럽게 뒤집어 부드럽지만 철저하게 섞습니다.

윙 버킷 로터에서 3,000배 G 및 섭씨 25도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 단백질 팬케이크를 방해하지 않고 용액의 최상을 최대한 제거합니다. 펠릿을 메탄올 1밀리리터로 조심스럽게 헹구고 최소 10분 동안 자연 건조시킵니다.

클로로포름-메탄올 침전이 완료되면 단백질 침전물을 125마이크로리터의 완충액 A에 재현탁시켜 팔미토일 티오에스테르 결합의 절단을 시작합니다. 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 잠시 초음파 처리한 후 13,000배 G 이상, 섭씨 25도에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 제거한다.

가용화된 단백질을 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 375마이크로리터의 완충액 H 또는 완충액 T를 첨가합니다. 샘플을 실온에서 60분 동안 배양한 후 클로로포름-메탄올 침전을 반복합니다. 보호되지 않은 시스테인에 mPEG를 추가하려면 먼저 10밀리몰 TCEP를 포함하는 100마이크로리터의 완충액 A에 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 현탁액을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 25마이크로리터의 스톡 mPEG 5k 용액을 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. 끝 회전과 함께 실온에서 배양합니다. 배양 60분 후, 클로로포름 메탄올 침전을 다시 수행하여 통합되지 않은 mPEG 5k를 제거합니다.

13,000배 G 이상, 섭씨 25도에서 10분 동안 원심분리합니다. 두꺼운 응집성 팬케이크를 피하면서 이전과 같이 상부를 조심스럽게 제거합니다. 메탄올 1밀리리터를 넣고 부드럽지만 철저히 섞습니다. 13,000배 G 이상, 섭씨 25도에서 10분 동안 원심분리합니다.

상청액을 조심스럽게 제거하고 1밀리리터의 메탄올로 펠릿을 헹굽니다. 다시 말하지만, 13,000배 G 이상, 섭씨 25도에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 공기 건조시킨 후 TCEP 또는 환원제 없이 50마이크로리터의 완충액 A에 재현탁합니다.