분리된 미토콘드리아의 칼슘 보유 능력의 결정

JoVE Encyclopedia of Experiments

신경과학

0 조회수 • 2:42 분 • July 8th, 2025

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신경모세포종 세포에서 분리된 미토콘드리아를 막 불투과성, 칼슘 결합 형광 염료가 포함된 완충액에 넣습니다.

미토콘드리아가 완충액에서 안정화될 수 있도록 배양합니다.

칼슘 함유 완충액을 첨가하고 진영하면서 배양합니다.

칼슘 이온은 염료 분자에 결합하여 형광을 일으

킵니다.

형광 분광계를 사용하여 염료의 형광을 실시간으로 모니터링합니다.

이제 칼슘 함유 완충액을 일정한 간격으로 주입하십시오.

칼슘 농도가 증가하면 미토콘드리아 칼슘 흡수가 촉진되어 염료에 결합할 수 있는 유리 칼슘 이온이 감소하여 형광이 감소합니다.

미토콘드리아가 최대 칼슘 저장 용량에 도달하면 추가 칼슘 첨가로 인해 미토콘드리아 투과성 전이 기공(mPTP)이 열립니다.

이 기공 개구부는 미토콘드리아에서 완충액으로 칼슘을 방출하여 염료에 결합하여 형광을 증가시킵니다.

미토콘드리아 칼슘 보유 능력을 반영하는 mPTP 개방을 유도하는 데 필요한 칼슘의 총량을 결정합니다.

염화칼륨 배지를 준비하고 실험 전에 칼슘 결합 녹색 형광 염료를 최종 농도 0.5마이크로몰로 첨가합니다. 미토콘드리아 칼슘 보유 용량을 결정하기 위해, 먼저 0.5마이크로몰 칼슘 결합 녹색 형광 염료를 함유하는 염화칼륨 배지에서 분리된 미토콘드리아 1밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 옮깁니다.

실온에서 6웰 플레이트의 칼슘 결합 녹색 형광 염료에서 미토콘드리아를 배양합니다. 1분 동안 주변광으로부터 보호하십시오. 배양 후, 자동 분배 설정을 사용하여 미토콘드리아 단백질 밀리그램당 200나노몰의 칼슘을 도입하기 위해 6웰 플레이트의 각 웰에 20밀리몰 염화칼슘 용액 4마이크로리터 분취량을 추가합니다.

형광 분광계를 사용하여 여기 파장은 506나노미터, 방출 파장은 531나노미터로 2분 동안 3초마다 형광 변화를 모니터링합니다. 플레이트에는 소프트웨어로 제어되는 판독 사이에 3초 동안 600RPM에서 흔들리는 기능이 있습니다. 각 웰에 20밀리몰 염화칼슘 용액의 4마이크로리터 분취량을 추가한 다음 2분 동안 3초마다 형광 변화를 모니터링합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026