0 조회수 • 5:13 분 • April 28th, 2025
어둡게 적응하고 마취되고 형질전환된 흰 눈의 파리를 예로 들어 보겠습니다.
파리는 눈의 광수용체에서 eGFP 태그가 지정된 TRPL 이온 채널을 발현합니다.
어둠 속에서 TRPL은 광수용체의 미세융모인 횡문막의 막에 국한됩니다.
압축 공기를 사용하여 플라이를 머리부터 피펫 팁에 밀어 넣습니다.
팁을 자르고 플라이를 뒤로 밉니다.
다시 다듬고 머리만 튀어나올 때까지 플라이를 앞으로 밉니다.
슬라이드에 부착된 모델링 점토로 팁을 고정하고 눈이 현미경 대물렌즈를 방사형으로 향하도록 형광 현미경 스테이지에 놓습니다.
대물렌즈에 물 한 방울을 넣은 다음 눈에 닿을 때까지 내립니다.
광수용체의 이미지를 캡처합니다.
횡문, 세포체 및 배경의 형광 강도를 측정합니다.
주황색 빛으로 파리를 비추어 세포체로의 TRPL 전좌를 유도합니다.
이미징 및 형광 측정을 반복합니다.
이미지를 비교하여 조명 후 감소된 횡문맥 형광을 관찰하여 TRPL이 세포체로 전좌되었음을 나타냅니다.
치명적이지 않은 변형으로 파리를 준비하려면 얼음 마취된 파리를 머리부터 200마이크로리터 피펫 팁으로 옮기고 압축 공기로 플라이를 팁 쪽으로 조심스럽게 밀어냅니다. 그런 다음 메스를 사용하여 머리 바로 앞의 피펫 팁을 잘라냅니다. 그리고 핀셋을 사용하여 플라이를 피펫 팁에 몇 밀리미터 조심스럽게 밀어 넣습니다.
피펫 팁을 다시 잘라냅니다. 그리고 압축 공기로 플라이를 팁 쪽으로 뒤로 밀어 플라이의 머리만 피펫 팁에서 튀어나오도록 합니다. 플라스틱 조각을 물체 슬라이드에 붙인 후 왼쪽 또는 오른쪽 눈이 위를 향하도록 피펫 팁을 누릅니다. 현미경 아래에서 눈의 방향이 올바른지 확인하십시오. 이미지 획득을 위해 수침 대물렌즈를 선택하십시오.
치명적이지 않은 변이의 경우 실험실 피펫을 사용하여 많은 양의 냉각수를 침수 대물렌즈의 밑면에 부착합니다. 준비된 플라이가 있는 물체 슬라이드를 현미경 스테이지에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 수면에 닿거나 파리의 눈이 물방울에 닿을 때까지 수침 대물렌즈를 수동으로 내립니다.
그런 다음 현미경 카메라로 빛의 경로를 전환하고 라이브 이미지를 생성합니다. 카메라의 초점을 재조정하고 눈이 현미경 대물렌즈를 방사형으로 향해야 한다는 점을 고려하여 눈의 방향을 평가합니다. 조회 테이블 소프트웨어를 사용하여 과포화를 감지합니다.
색소가 묻지 않은 파리의 경우 가장 밝은 픽셀이 모든 이미지의 채도 한계 바로 아래에 오도록 노출 시간을 조정하십시오. 이미지를 기록하고 원시 파일로 저장하여 녹음의 모든 해당 메타데이터를 보관합니다. 그런 다음 이미지를 도트 TIFF 형식으로 내보냅니다.
침수 현미경 사진의 횡문에서 상대적인 EGFP 형광을 정량화하려면 분석을 클릭하여 ImageJ 설정을 조정하십시오. 그런 다음 측정값을 설정하고 평균 회색 값 확인란만 선택합니다. 파일을 클릭한 다음 열기를 클릭하여 도트 TIFF 이미지를 가져옵니다. 초점이 맞춰진 이미지의 대표적인 영역을 선택하고 Control과 Plus를 함께 반복해서 눌러 200%에서 300%로 확대합니다.
그런 다음 타원형 도구를 선택합니다. 그리고 Shift 키를 누른 상태에서 형광 횡문렌즈 하나보다 훨씬 작은 원형 선택 영역을 이미지에 생성합니다. 그런 다음 ImageJ 기본 창의 도구 모음 아래에 표시된 정확한 크기를 찾습니다. 원형 선택 영역 내에서 형광 강도를 측정하려면 키보드의 화살표 키를 사용하여 원을 첫 번째 횡문식으로 이동하고 분석을 클릭한 다음 측정을 클릭합니다.
측정된 회색 값을 나열하는 결과 창이 나타납니다. 횡문근 2에서 6까지의 측정을 계속하고 배경 신호도 측정합니다. 색소가 없는 파리의 경우 해당 세포체 영역을 추가로 측정하십시오. 두 개의 옴마티디아의 형광을 더 측정하여 세 번의 기술적 복제를 생성합니다. 연필 도구를 사용하여 분석된 ommatidia를 표시하고 문서화를 위해 이 이미지를 저장합니다.
결과 창에서 측정된 회색 값을 선택하여 복사하고 추가 계산을 위해 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다. 형광 강도 값을 원산지에 따라 범주의 횡문체, 세포체 및 배경으로 정렬하고 각 범주의 평균 강도를 계산합니다. 그런 다음 색소가 없는 눈의 경우 첫 번째 공식을 사용하고 색소 침착된 눈의 경우 두 번째 공식을 사용하여 횡문에 존재하는 EGFP의 상대적 양을 계산합니다.