Neurodegenerative Protein Overexpression을 이용한 효모 세포의 히스톤 변형 검출(Detecting Histone Modifications in Yeast Cells with Neurodegenerative Protein Overexpression)

신경퇴행성 질환과 관련된 단백질을 과발현하는 효모 세포의 현탁액으로 시작합니다.

이 과발현된 단백질은 DNA 포장 단백질 또는 화학 부분이 있는 히스톤의 변형을 담당합니다.

수산화나트륨과 베타-메르캅토에탄올을 첨가한 다음 얼음 위에서 배양합니다.

수산화나트륨과 베타-메르캅토에탄올은 세포를 용해하여 히스톤을 포함한 세포내 단백질을 방출합니다.

용해물을 원심분리하여 단백질을 수집합니다. 상청액을 버리십시오.

단백질 펠릿에 로딩 염료를 첨가하고 가열하여 변성시킵니다.

이 변성 단백질과 단백질 마커를 겔에 로드하고 전기영동하여 크기별로 분리합니다.

단백질을 멤브레인에 전기전달하고, 세척하고, 비특이적 결합을 방지하기 위해 차단 완충액을 추가합니다.

변형된 히스톤에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 추가합니다.

세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 1차 항체에 결합하는 형광 2차 항체와 함께 배양합니다.

뚜렷한 형광 밴드는 히스톤 변형을 확인하여 신경퇴행성 단백질의 과발현을 나타냅니다.

웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 용해하려면 효모 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동한 후 100마이크로리터의 증류수에 재현탁합니다. 각 세포 샘플에 300마이크로리터의 0.2몰 수산화나트륨과 20마이크로리터의 2-메르캅토에탄올을 첨가합니다. 그리고 피펫팅으로 펠릿을 재현탁합니다.

얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고 샘플을 100마이크로리터의 로딩 염료에 재현탁합니다. 그런 다음 가열 블록에서 샘플을 10분 동안 끓입니다. 샘플이 용해되는 동안 두 개의 젤을 겔 홀더에 넣고 내부 챔버를 상단까지 러닝 버퍼로 채우고 외부 챔버를 2개의 젤 라인 표시까지 채웁니다.

샘플이 준비되면 각 세포 용해 용액 15마이크로리터를 10웰 12% 폴리아크릴아미드 겔의 각 웰에 로드하고 단백질 사다리 레인 웰에 5마이크로리터의 단백질 사다리를 추가합니다. 150볼트에서 약 45분 동안 또는 로딩 염료 전면이 젤 바닥에 도달할 때까지 젤을 실행합니다.

겔이 작동하는 동안 겔당 2개의 섬유 패드를 전사 완충액에 담그고 겔당 폴리비닐리덴 플루오라이드 또는 PVDF 멤브레인 1개를 메탄올에 담그십시오. 겔이 준비되면 멤브레인을 헹구고 완충액을 옮깁니다. 그리고 반건식 전사 장치 셀의 바닥에 미리 적신 섬유 패드 하나를 놓고 PVDF 멤브레인, 젤 및 두 번째 미리 적신 섬유 패드를 놓습니다.

그런 다음 1시간 동안 전력을 150밀리암페어로 설정합니다. 단백질 전달이 끝나면 증류수로 잠시 헹구기 위해 전달 장치에서 멤브레인을 제거합니다. 헹군 멤브레인 단백질 면을 작은 염색 상자에 넣고 멤브레인을 트리스 완충 식염수 또는 TBS 차단 완충액으로 덮어 실온에서 부드럽게 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.

차단 배양이 끝나면 섭씨 4도에서 TBS에서 항효모 히스톤 및 변형 특이 항체 및 적절한 핵 로딩 제어 항체와 함께 멤브레인을 밤새 배양합니다.

다음날 아침, 0.1% 폴리소르베이트 20을 보충한 TBS에서 멤브레인을 4회 세척하고 세척할 때마다 실온에서 흔들면서 5분 동안 세척합니다. 마지막 세척 후, 블롯을 적절한 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한 후 TBST에서 5분 세척 4회, 흔들면서 TBS 단독에서 5분 세척 1회

그런 다음 형광 웨스턴 블롯 이미징 시스템에서 2분 동안 블롯을 이미지