ELISA를 사용하여 신경퇴행성 질환 관련 단백질 α-Synuclein 검출

신경퇴행성 질환과 관련된 잘못 접힌 신경 단백질인 돌연변이 α-시누클레인을 과발현하는 형질전환 마우스의 뇌 조직을 고염 완충액에 담그는 것으로 시작합니다.

큰 유봉으로 조직을 균질화한 다음 작은 유봉으로 조직을 파괴하고 α-시누클레인을 포함한 세포내 단백질을 방출합니다.

균질을 튜브로 옮기고 원심분리합니다. 단백질 함유 상청액을 수집하여 완충액으로 희석합니다.

이 상청액을 비특이적 결합을 방지하기 위해 차단제로 전처리된 α-시누클레인 특이적 항체 코팅 마이크로플레이트에 첨가합니다.

교반과 함께 배양하여 정상 및 돌연변이 α-시누클레인이 결합할 수 있도록 합니다.

플레이트를 세척한 다음 돌연변이된 α-시누클레인에 특이적인 검출 항체를 추가하고 교반하면서 배양합니다.

다시 세척하고 효소 결합 항체를 첨가한 다음 교반하면서 배양합니다.

기질을 첨가하고 교반하면서 어두운 곳에서 배양합니다. 기질은 효소와 반응하여 색상 변화를 일으킵니다.

산과의 반응을 중지하고 흡광도를 측정하여 돌연변이된 α-시누클레인을 정량화합니다.

뇌 균질체를 준비하려면 아래 표와 같이 해부된 뇌 영역에 적절한 양의 HS 완충액을 추가하여 예상 % 균질체에 도달합니다. 붕규산 유리관과 두 개의 유봉 A와 B로 구성된 조직 분쇄기를 사용하여 분쇄할 뇌 영역을 튜브에 붓습니다. 그런 다음 유봉 A를 사용하여 조직을 10번 균질화하여 해리시킵니다.

그런 다음 유봉 B로 전환하고 추가로 20회 균질화합니다. 이송 피펫을 사용하여 균질액을 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 나머지 뇌 샘플로 균질화를 반복합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 1,000g에서 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 수집하여 200마이크로리터 분취량으로 나눕니다.

100마이크로리터의 항체 코팅 용액으로 96웰 마이크로플레이트의 웰을 코팅하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날 300마이크로리터의 PBST를 웰에 추가하고 플레이트 와셔를 사용하여 플레이트를 5회 세척합니다. 실온에서 작업하면서 앞으로 각 웰에 200마이크로리터의 T20 PBS 차단 완충액을 추가하고 PBST를 사용하여 플레이트를 5회 세척하기 전에 플레이트를 150RPM에서 1시간 동안 흔듭니다.

BSA의 1%인 PBST를 사용하여 여기에 나열된 지침에 따라 뇌 균질체를 희석합니다. 그리고 각 우물에 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 PBST를 사용하여 플레이트를 5회 세척하기 전에 실온 및 150RPM에서 2시간 동안 배양합니다.

최종 세척 후, 텍스트 프로토콜의 표 2에 나열된 대로 PBST 및 1% BSA로 희석된 필요한 알파 시누클레인 검출 항체를 추가합니다. 실온과 150RPM에서 1시간 동안 배양한 후 플레이트를 이전과 같이 5회 세척합니다.

다음으로, PBST, 1% BSA에서 1 내지 8,000으로 희석된 항마우스 또는 항토끼 IGG HRP 접합체를 첨가합니다. 그리고 플레이트를 5회 세척하기 전에 1시간 동안 150RPM에서 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 TMB 용액을 첨가하고 어두운 곳에서 150분 동안 150RPM으로 배양합니다. 웰당 100마이크로리터의 일반 염산 1개를 첨가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450나노미터에서 흡광도를 측정합니다.