Western Blotting을 통한 Phosphorylated Neuronal Potassium-Chloride Cotransporter 2 검출

신경 염화물 수치를 조절하는 칼륨-염화물 공동수송체 2 또는 KCC2 단백질을 함유한 세포 용해물을 섭취하십시오.

조절 부위의 인산화는 KCC2 기능을 방해하여 신경 활동을 조절합니다.

인산화된 KCC2를 표적으로 하는 항체와 접합된 비드에 용해물을 첨가합니다. 결합을 허용하기 위해 배양한 다음 세척하여 결합되지 않은 단백질과 세포 파편을 제거합니다.

고온에서 변성 완충액으로 처리하여 KCC2를 방출한 다음 원심분리하여 비드를 분리합니다.

KCC2 함유 상청액을 전기영동 젤에 로드합니다. 단백질을 밴드로 분리하여 인산화된 KCC2의 존재를 확인합니다.

밴드를 멤브레인으로 옮긴 다음 차단 용액에서 배양하여 비특이적 결합 부위를 마스킹합니다.

인산화된 KCC2를 표적으로 하는 1차 항체와 함께 배양합니다.

세척한 다음 효소 태그가 부착된 2차 항체와 함께 배양하여 1차 항체를 표지합니다.

다시 세척한 다음 효소와 반응하여 빛을 생성하는 화학 발광 기질을 추가합니다.

광도를 측정하여 용해물에서 인산화된 KCC2를 정량화합니다.

300마이크로리터의 단백질 G 세파로스를 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 용액을 500G에서 2분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버린 후 500마이크로리터의 PBS를 넣고 잘 소용돌이치십시오. 원심분리 후 상청액을 버리고 이 단계를 반복합니다.

다음으로, 1mg의 항-KCC2 트레오닌 906 및 항-KCC2 트레오닌 1007 항체를 200마이크로리터의 단백질 G 세파로스 비드와 혼합한 후 PBS로 부피를 500마이크로리터로 만듭니다. 진동 플랫폼 또는 회전 휠에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 흔든 후 PBS로 두 번 세척을 반복합니다.

세포 용해물에 대한 단백질 정량화를 수행하고 세척된 비드에 세포 용해물 1mg을 첨가하고 회전하기 전에 종단 간 회전기에서 배양합니다. 150밀리몰 염화나트륨을 함유한 PBS로 3회 세척한 후 200마이크로리터의 PBS로 3회 세척한 후 최종 펠릿을 100마이크로리터의 LDS 샘플 완충액에 재현탁합니다.

로터 셰이커에서 튜브를 실온에서 5분 동안 흔듭니다. 가열 블록에서 배양하고 겔 로딩을 위해 상층액을 사용하기 전에 원심분리합니다. 웨스턴 블롯 주조 장치를 조립하고 새로 준비한 8% 분리 젤을 부어 주조 유리 상단에서 약 2cm의 공간을 확보하여 젤을 주조합니다. 200마이크로리터의 절대 이소프로판올을 설정에 넣고 실온에서 60분 동안 그대로 둡니다.

피펫을 사용하여 이소프로판올을 제거하고 약 200마이크로리터의 증류수로 젤을 조심스럽게 헹굽니다. 새로 준비된 6% 스태킹 젤을 주조 설정에 추가한 후 웰 빗에 부드럽게 끼우고 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 주조된 젤을 전기영동 탱크에 고정합니다.

러닝 버퍼를 탱크에 부은 후 첫 번째 웰에 5마이크로리터의 분자량 마커를 로드하고 SDS-PAGE 겔의 각 웰에 동일한 양의 단백질을 로드합니다. 빈 우물을 LDS로 채우고 젤을 120볼트에서 약 90-120분 동안 실행합니다. 20% 메탄올을 함유한 전사 완충액으로 니트로셀룰로오스 멤브레인을 재수화합니다.

전사 완충액으로 젤과 멤브레인을 헹구고 준비 스택에 부드럽게 펴 바릅니다. 이송할 샌드위치를 음극, 샌드위치 폼, 여과지, 헹굼한 SDS-PAGE 젤, 헹굼한 니트로셀룰로오스 멤브레인, 여과지, 샌드위치 폼, 양극 순서로 배열합니다. 완료되면 조립된 샌드위치를 이송 탱크에 쌓고 90볼트에서 90분 동안 또는 30볼트에서 360분 동안 작동합니다.

차단 완충액을 사용하여 실온에서 1시간 동안 건조 멤브레인을 차단합니다. 막을 차단 완충액에 적절히 희석한 1차 항체 및 베타 액틴과 함께 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 TBST를 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.

세척된 멤브레인을 차단 완충액에 희석된 2차 항체와 함께 60분 동안 배양하고 TBST를 3회 세척합니다. 완료되면 세척된 멤브레인을 이미징 보드에 놓습니다. 신호를 개발하려면 이미징 보드를 이미징 시스템으로 옮기기 전에 멤브레인에 동일한 부피의 각 강화 화학발광 시약을 혼합하여 준비된 용액을 퍼뜨립니다.