Quantification of Retinal ganglion cell somas following cauterization-induced ocular hypertension(소작 유발 안구 고혈압에 따른 망막 신경절 세포 소마의 정량화)

쥐의 눈에서 분리된 화학적으로 고정된 망막을 가져 와십시오.

눈은 각막을 둘러싼 혈관망인 윤부 혈관 신경총에 열로 인한 손상을 보입니다.

이 손상은 체액 배수를 차단하여 안압(IOP)을 증가시키고 망막 신경절 세포(RGC) 변성을 유발합니다.

세포와 핵막을 투과화하기 위해 투과성 용액으로 망막을 처리합니다.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 용액을 도포합니다.

차단 솔루션을 제거합니다.

RGC에서 주로 발현되는 전사 인자를 표적으로 하는 1차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척합니다.

1차 항체에 결합하는 형광단 접합 2차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척합니다.

DNA 결합 염료로 핵을 대조염색합니다.

망막을 세척하고 적절한 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다.

현광 현미경으로 망막을 시각화합니다.

대조군에 비해 손상된 눈의 세포 밀도가 감소하면 IOP 증가로 인한 RGC 변성이 확인됩니다.

망막을 분리한 후, 망막 내부 유지를 유지하면서 1밀리리터 PBS가 들어 있는 24웰 배양 플레이트에 옮깁니다. PBS에 희석된 0.5% 비이온성 계면활성제로 세척하여 조직을 투과화합니다. 그런 다음 조직을 실온에서 부드럽게 흔들면서 1시간 동안 차단 용액에 배양합니다. 배양하는 동안 BRM 3A 1차 항체 용액을 준비하고 섭씨 4도에서 보관합니다.

조직 차단 후, 망막을 섭씨 4도에서 200마이크로리터의 1차 항체 용액에서 부드럽게 흔들면서 72시간 동안 배양합니다. 다음으로 PBS로 조직을 세척합니다. 조직을 200마이크로리터의 2차 항체 용액에 실온에서 2시간 동안 배양한 다음 형광 핵 염색을 위해 핵 대대 염색 용액과 함께 10분 동안 배양합니다.

PBS 세척 3회 후 유리체 면을 위로 유지하면서 두 개의 작은 브러시를 사용하여 망막을 유리 현미경 슬라이드에 옮깁니다. 등쪽 망막 사분면을 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 마지막으로 유리 커버슬립에 200마이크로리터의 퇴색 방지 마운팅 매체를 바르고 현미경 분석을 위해 평평하게 장착된 망막에 놓습니다. 40배 확대 대물렌즈를 사용하여 공초점 낙현형광 현미경에서 평면 마운트를 검사하여 망막 신경절 세포를 추정합니다.