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신경과학
0 조회수 • 7:03 분 • April 28th, 2025
세제, 칼슘 및 프로테아제 억제제가 포함된 완충액에 신경구 세포를 섭취합니다.
세제는 세포를 투과화하는 반면, 억제제는 프로테아제를 비활성화하여 염색질 결합 표적 단백질을 보존합니다.
뉴클레아제를 첨가하고 배양합니다. 뉴클레아제는 칼슘을 사용하여 염색질을 소화합니다.
칼슘을 킬레이트화하여 뉴클레아제를 비활성화하는 EDTA 함유 완충액을 추가합니다.
용해 완충액을 첨가하여 세포를 용해시켜 염색질을 방출합니다.
원심분리하여 상층액을 수집합니다.
표적 단백질에 특이적인 항체를 추가하고 회전하면서 배양합니다. 원심분리하여 상층액을 제거합니다.
항체를 표적으로 하는 마그네틱 비드를 도입하고 회전하면서 배양합니다.
용해 완충액을 첨가하여 비특이적으로 결합된 DNA를 분리합니다.
비드를 자기적으로 포착하고 상청액을 제거합니다.
고염 완충액을 첨가하여 비특이적으로 결합된 단백질을 분리합니다.
비드를 자기적으로 포착하고 상청액을 제거합니다.
안정화 완충액을 추가하고 비드를 자기적으로 포착한 다음 오염 물질을 제거합니다.
단백질을 소화하고 DNA를 방출하기 위해 단백질분해효소-K 완충액에 재현탁합니다.
신경구가 수확되면 5분 동안 300배g에서 면역침전당 6개의 신경구 세포에 10배 10배를 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액을 디캔팅하고 신경구 펠릿을 1밀리리터의 균형 소금 용액에 다시 현탁합니다. 현탁액을 저단백 결합 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 이전과 같이 원심분리합니다.
다음으로, 상청액을 디캔팅하고 1 x 10 x 10 대 6 세포당 프로테아제 억제제 칵테일을 보충한 95마이크로리터의 소화 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 뭉치는 것을 방지하고 기포가 생기지 않도록 세포를 즉시 위아래로 피펫팅하십시오. 그런 다음 0.1x 마이크로코쿠스 뉴클레아제 5마이크로리터와 소화 완충액 145마이크로리터를 혼합하고 6개 세포에 1 x 10당 희석된 미세코쿠스 뉴클레아제 5마이크로리터를 첨가합니다. 튜브를 넘겨 혼합하고 튜브를 섭씨 37도의 열 블록에 정확히 12분 동안 넣습니다.
염색질을 단편화하기 위한 미세코쿠스 뉴클레아제 분해가 가장 중요한 단계입니다. 적절한 염색질 단편화는 ChIP에 대한 높은 분해능을 달성하는 데 중요합니다. 이 단계가 성공적이려면 여러 샘플을 한 번에 하나씩 배양하여 과소화가 발생하지 않도록 합니다.
12분 후 10 x 10 x micrococcal nuclease stop buffer를 10 마이크로리터를 6개 세포에 추가합니다. 이 시점부터 샘플은 얼음 위에 보관해야 합니다. 마이크로코쿠스 뉴클레아제 소화 샘플의 바이오 분석기 분석은 대부분의 DNA가 모노, 디 및 트리뉴클레오솜으로 단편화되었음을 보여줍니다. 다음으로, 110 마이크로리터의 2x RIPA 완충액을 1 x 100당 프로테아제 억제제 칵테일을 6개 세포에 추가합니다.
튜브를 넘겨 혼합한 다음 섭씨 4도 및 1,700배g에서 15분 동안 원심분리합니다. 염색질이 포함된 상청액을 일반 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 프로테아제 억제제가 1 내지 1,000으로 보충된 RIPA 완충액을 사용하여 각 IP가 100 내지 200 마이크로리터의 부피를 갖도록 염색질을 희석합니다. 그런 다음 ChIP 부피의 10%에 해당하는 분취량을 입력 샘플로 제거합니다.
프로테이나제-K가 보충된 100마이크로리터의 TE 완충액을 추가하여 입력을 준비하고 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다. PCR 정제 키트로 입력을 정제한 후 마이크로 부피 분광 광도계를 사용하여 입력의 농도를 측정합니다. 결과를 노트북에 기록합니다. 각 샘플에서 수행할 IP당 10마이크로리터의 세척된 단백질 A 및 G 마그네틱 비드를 추가하고 섭씨 4도에서 20RPM으로 회전하면서 1시간 동안 배양합니다.
샘플을 마그네틱 홀더에 놓고 비드가 분리되도록 합니다. 그런 다음 필요한 양을 새 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 원하는 항체를 추가한 다음 증발을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀 필름으로 캡을 감쌉니다. 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 이전과 같이 회전시킵니다. 다음날 튜브를 2000g으로 10초 동안 회전시킵니다. 그런 다음 각 IP에 10마이크로리터의 비드를 추가하고 섭씨 4도에서 20RPM으로 회전하면서 3시간 동안 배양합니다.
그런 다음 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록 합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다. 그런 다음 프로테아제 억제제가 포함된 150마이크로리터의 RIPA 완충액을 각 IP에 첨가하고 섭씨 4도에서 20RPM에서 5분 동안 배양합니다. 배양 기간이 지나면 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록 합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다. 그런 다음 저농도의 프로테아제 억제제가 보충된 염화리튬 완충액 150마이크로리터를 각 IP에 첨가하고 섭씨 4도에서 20RPM으로 회전하면서 5분 동안 배양합니다.
잠복 기간이 지나면 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록 합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다. 그런 다음 프로테아제 억제제가 없는 150마이크로리터의 차가운 TE를 비드에 첨가하고 섭씨 4도에서 20RPM으로 회전하면서 5분 동안 배양합니다. 최종 세척 단계 후, 밀리리터당 0.5mg의 최종 농도인 TE 완충액 100마이크로리터에 샘플을 다시 현탁시키고 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다.