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신경과학
0 조회수 • 3:04 분 • April 28th, 2025
콜린 아세틸트랜스퍼라제를 발현하는 콜린성 뉴런을 포함하여 뉴런을 포함하는 고정 및 투과화된 마우스 뇌 절편을 채취합니다.
슬라이스는 콜린성 축삭에 국한된 표적 mRNA를 검출하기 위해 형광 제자리 혼성화를 거쳐 형광 현미경으로 검출되는 형광 프로브를 사용하여 증폭된 신호를 생성합니다.
단백질과 담금질제가 포함된 차단 용액을 추가합니다. 단백질은 비특이적 결합을 방지하고 담금질제는 잔류 고정제를 중화합니다.
신경 콜린 아세틸트랜스퍼라제를 표적으로 하는 1차 항체와 함께 배양합니다.
결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.
콜린 아세틸트랜스퍼라제 결합 1차 항체에 결합하는 형광단 접합 2차 항체와 함께 배양합니다.
완충액으로 세척하여 과도한 항체를 제거한 다음 증류수로 헹구어 완충액 잔류물을 제거합니다.
핵에 라벨을 붙이기 위해 핵 염색이 포함된 마운팅 매체로 슬라이스를 마운트합니다.
형광 현미경을 사용하여 슬라이스를 이미지화하여 특정 항체로 염색된 표적 mRNA 신호와 콜린성 축삭을 시각화합니다.
각슬라이스를 100-200마이크로리터의 차단 용액으로 덮고, 100밀리리터당 3밀리그램의 BSA, 100밀리몰 글리신 및 0.25% 트리톤 X-100을 PBS에 함유합니다. 각 슬라이드를 파라필름으로 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
배양 후, 슬라이드에 대한 차단 용액으로 희석된 100 내지 200 마이크로리터의 항체에서, 항-콜린 아세틸트랜스퍼라제 항체가 여기에 사용된다. 덮은 후 슬라이드를 파라필름으로 덮고 섭씨 4도에서 2일 동안 배양합니다. 뇌 조각이 마르지 않도록 하십시오. 필요한 경우 배양 후 24시간 후에 항-chAT 항체 용액을 뇌 절편에 다시 도포합니다.
슬라이드를 실온에서 5분 동안 1X PBS로 3회 세척한 후, 100-200마이크로리터의 적절한 Alexa 접합 2차 항체를 슬라이드에 추가합니다. 파라필름으로 덮고 빛으로부터 보호하면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
시간이 지나면 슬라이드를 이전과 같이 1X PBS에서 각각 5분 동안 세 번 세척한 다음 증류수로 한 번 세척합니다. DAPI가 포함된 장착 매체로 슬라이드를 장착합니다. 그런 다음 형광 현미경으로 뇌 조각을 시각화합니다.