FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

이 절차의 전반적인 목표는 일시적 수용체 전위의 약리학적 프로파일을 연구하거나 한 채널을 트립하기 위해 Flex Station 3의 적용을 입증하는 것입니다. 이것은 96년에 트립 a 1 채널을 발현하는 세포를 먼저 준비함으로써 달성됩니다. 음, 마이크로타이터 플레이트.

마이크로플레이트 세척기로 세포를 세척한 후 세포에는 칼슘에 민감한 형광 염료가 주입됩니다. 독감 오 오전 4:00 세포 로딩 기간 후에 몇 가지 추가 세척이 이어집니다. 절차의 다음 단계는 트립, 1 작용제 및 추정 트립, 1 길항제를 포함한 복합 플레이트를 준비하는 것입니다.

마지막 단계로, 소프트웨어 매개변수는 Flex Station 3 시스템에서 플레이트 판독을 위해 설정됩니다. 궁극적으로, 트립 A에 대한 용량 반응 관계를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다: 독감 음소산에 의한 1회 활성화와 길항제 화합물 A에 의한 억제, 이 방법은 칼슘 유입을 측정하여 21가지 활성화 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 칼슘에 민감한 냉동 염료 또는 말리 전위 염료를 사용하여 다른 칼슘 투과성 눈 채널 및 심층 단백질 결합 수용체의 기능을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

칼슘 이미징 및 수동 패치 매핑과 같은 기존 방법에 비해 이 전술의 주요 장점은 이 시간 절약 기술이 칼슘 공식, 철 채널 및 기타 칼슘 동원 수용체의 기능 및 조절에 대한 높은 처리량 스크리닝을 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜이 시작되기 전에, 서면 프로토콜에 기술된 바와 같이 70 - 90%의 밀도로 트립 A로 안정적으로 형질주입된 HEC 2 93 세포를 성장시킵니다. 칼슘 분석을 위한 세포 준비를 시작하려면 50마이크로리터의 폴리L 오르니틴을 각 웰에 피펫팅하여 96웰 플레이트를 코팅하고 최소 15분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.

배양 후, KO의 인산염 완충 식염수로 세포를 한 번 헹굽니다.트립신 후 HEC 2 93 세포는 원하는 양의 세포를 15ml 멸균 원추형 바닥 튜브와 원심분리기로 전달합니다. 샘플입니다. 상층액을 제거하고 생성된 세포 펠렛을 재현탁합니다.

10% 열이 주입된 DMEM 배양 배지에서 소 태아 혈청은 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 세포 현탁액을 분배합니다. 멀티채널 피펫터를 사용하여 플레이트를 후드에 최소 30분 동안 두었다가 20-44시간 동안 가습된 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 칼슘 분석 준비를 위해 먼저 서면 프로토콜에 설명된 대로 용액을 준비하십시오.

준비가 완료되면 10 마이크로 리터의 1 밀리 몰 독감 오 4 : 00 AM과 10 마이크로 리터의 오닉을 혼합합니다. F1 27, 전체 내용물을 독감 5밀리리터로 옮깁니다. 오 4 분석 버퍼는 0.1 % 소 혈청 알부민으로 보충되었습니다.

다음으로 96 년에 자란 세포를 씻습니다. 세척 후 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 웰당 80마이크로리터의 HBSS가 있는 웰 플레이트를 두 번 사용하고, 멀티 채널 피펫터를 사용하여 웰당 50마이크로리터의 flu oh 4:00 AM 로딩 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간의 세포 로딩 기간 동안 flu oh four assay buffer pipette에서 일련의 3 x 용액 3개, 길항제의 3 x 용액 시리즈 및 대용량 300 마이크로몰 작용제를 준비합니다.

300 마이크로 리터의 희석 된 화합물 용액을 96 웰 복합 플레이트에 넣습니다. 화합물의 연속 희석과 해당 양극 및 음성 대조군이 가능할 때마다 화합물 플레이트의 동일한 열에 있도록 준비합니다. Flex 스테이션 3이 한 번에 하나의 단일 컬럼을 판독한 다음, 최종 세포 준비 단계로 길항제(antagonist)를 포함하는 각 웰에 인접한 300마이크로몰 작용제 용액 300마이크로리터를 피펫팅합니다.

마지막 세척 후 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 독감 오 4산 완충액으로 장전된 세포를 세 번 세척합니다. 각 웰에 독감 오 4 개의 산 완충액 80 마이크로 리터를 남겨 둡니다. 플레이트 판독을 시작하려면 Flex Station 3 시스템을 켜고 soft max Pro 5.2 소프트웨어를 불러옵니다.

설치 시 새 파일 이름으로 실험을 저장합니다. 플렉스 모드를 선택하고 서면 절차에 나열된 대로 작용제 및 길항제 효과를 측정하기 위한 매개변수를 입력합니다. 다음으로 새 팁 상자, 복합 플레이트 및 판독 플레이트를 플렉스 스테이션의 해당 트레이에 놓습니다. 3.

Soft Max Pro 소프트웨어에서 읽기 버튼을 클릭하여 플레이트 판독을 시작하십시오. Flex Station three는 한 번에 하나의 열을 읽고 판독을 중단하지 않고 사전 프로그래밍된 시점에 화합물을 추가합니다. 실행이 완료되면 Soft Max PRO 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 직접 처리하거나 Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램에 복사하여 붙여넣을 수 있습니다.

데이터를 분석하기 위해 트립에 대한 농도 반응 곡선, 1 작용제 독감 음소산, 추정 트립에 대해 서면 절차 트립에 설명된 대로 최소 제곱 피팅을 사용하여 1 길항제 화합물 a를 생성합니다. 하나는 칼슘 투과성 양이온 채널 활성화로, 칼슘 과민성 염료 독감 오 4:00 AM에 의해 감지될 수 있는 칼슘 유입으로 이어집니다. 일련의 독감 음소 산 또는 FFA 농도에 대한 반응으로 형광 변화가 변화되는 시간의 대표적인 흔적이 더 높은 농도에서 나타납니다. FFA가 유발한 형광은 유사한 피크 형광 수준에도 불구하고 낮은 농도보다 훨씬 빠른 동역학으로 증가합니다.

이러한 차이를 구별하기 위해 농도 반응 관계는 형광 증가의 초기 속도를 측정하여 구성되었습니다. FFA의 다양한 농도를 추가했을 때, FFA의 절반 최대 유효 농도는 55.4 마이크로 몰로 결정되었다. 추정 트립에 의해 칼슘 반응을 유발한 FFA의 억제의 농도 반응 관계는 하나의 길항제 화합물 A도 화합물로 표시됩니다.

A 용량은 독립적으로 FFA에 대한 트립 A 1 세포의 반응을 4.3 마이크로몰의 절반 최대 억제 농도로 감소시켰습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 플래그 스테이션 3을 사용하여 트리플 A 1 및 관련 채널의 약리학적 프로파일을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.