FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

이 절차의 전반적인 목표는 TRP A1(transient receptor potential A1) 채널의 약리학적 프로필을 연구하기 위한 Flex Station 3의 응용 방법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 TRP A1 채널을 발현하는 세포를 준비함으로써 수행됩니다.

마이크로플레이트 워셔로 세포를 세척한 후, 칼슘 민감성 형광 염료인 Fluo-4로 세포를 로딩합니다. 세포 로딩 시간이 지나면 여러 번의 추가 세척 과정을 거칩니다. 절차의 다음 단계는 TRIP1R1 작용제와 추정 TRIP1R1 길항제를 포함하여 화합물 플레이트를 준비하는 것입니다.

마지막 단계로, Flex Station three 시스템의 플레이트 리딩을 위한 소프트웨어 파라미터를 설정합니다. 최종적으로, flu phonemic acid에 의한 trip A one 활성화와 길항제 화합물 A에 의한 억제에 대한 용량 반응 관계를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 칼슘 유입을 측정함으로써 21 활성화 메커니즘에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 칼슘 민감성 frozen 염료 또는 maly 전위 염료를 사용하여 다른 칼슘 투과성 eye 채널 및 deep 단백질 결합 수용체의 기능을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

이 방법의 기존 칼슘 이미징 및 수동 패치 매핑과 같은 방식 대비 주요 장점은, 시간 절약형 기술로서 칼슘 포뮬러, 철 채널 및 기타 칼슘 동원 수용체의 기능과 조절에 대한 고속 대량 스크리닝을 제공한다는 점입니다. 본 프로토콜을 시작하기 전, 서면 프로토콜에 기술된 대로 trip A one이 안정적으로 형질전환된 HEC 2 93 세포를 70 내지 90% 밀도로 배양하십시오. 칼슘 분석을 위한 세포 준비를 시작하려면, 96웰 플레이트의 각 웰에 poly L ornithine 50 µL를 피펫팅하여 코팅하고, 플레이트를 37 °C에서 최소 15분 동안 배양하십시오.

배양 후, KO의 인산염 완충 식염수로 세포를 한 번 헹굽니다. 트립신 처리 후, HEC 2 93 세포 중 원하는 양의 세포를 15 milliliter 멸균 원추형 바닥 튜브로 옮기고 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 생성된 세포 펠릿을 재현탁합니다.

10% 열불활성화 태아 송아지 혈청이 첨가된 DMEM 배양 배지에 96-웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 µL를 분주합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 플레이트를 후드 내에 최소 30분 동안 그대로 둔 후, 습윤한 세포 배양 인큐베이터에 넣고 20~44시간 동안 배양합니다. 칼슘 분석 준비를 위해, 먼저 서면 프로토콜에 설명된 대로 용액을 준비합니다.

준비가 완료되면, 1 mM flu oh 4:00 AM 10 µL를 onic. F1 27 10 µL와 혼합합니다. 전체 내용물을 0.1% bovine serum albumin이 첨가된 5 mL의 flu. oh four assay buffer로 옮깁니다.

다음으로, 96-웰 플레이트에서 배양한 세포를 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 웰당 80 µL의 HBSS로 2회 세척합니다. 세척 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 웰당 50 µL의 Fluo-4 AM 로딩 용액을 첨가하고, 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 1시간의 세포 로딩 시간 동안, 작용제(agonist)의 3배 농도(3x) 희석 시리즈, 길항제(antagonist)의 3배 농도(3x) 희석 시리즈, 그리고 Fluo-4 분석 버퍼에 희석된 300 µM 농도의 고용량 작용제를 피펫으로 준비합니다.

희석된 화합물 용액 300 µL를 96-웰 화합물 플레이트에 분주합니다. 가능하면 화합물의 계열 희석액과 그에 해당하는 양성 및 음성 대조군이 화합물 플레이트의 동일한 열에 배치되도록 합니다. Flex station 3는 한 번에 하나의 열만 읽으므로, 최종 세포 준비 단계로 길항제가 들어 있는 각 웰 옆에 300 µM 작용제 용액 300 µL를 피펫팅합니다.

마이크로플레이트 워셔를 사용하여 로딩된 세포를 flu oh four acid buffer로 3회 세척하고, 마지막 세척 후에는 각 웰에 80 µL의 flu oh four acid buffer를 남겨둡니다. 플레이트 리딩을 시작하려면 Flex Station three 시스템의 전원을 켜고 soft max Pro 5.2 소프트웨어를 실행하십시오.

설정 단계에서 새로운 파일 이름으로 실험을 저장하십시오. flex 모드를 선택하고, 서면 절차에 기재된 대로 작용제(agonist) 및 길항제(antagonist) 효과를 측정하기 위한 파라미터를 입력하십시오. 다음으로 새 팁 박스, 화합물 플레이트 및 측정 플레이트를 flex 스테이션의 적절한 트레이에 배치하십시오. 셋.

Soft Max Pro 소프트웨어에서 read 버튼을 클릭하여 플레이트 리딩을 시작합니다. Flex Station three는 한 번에 한 열씩 리딩하며, 리딩을 중단하지 않고 미리 프로그래밍된 시간대에 화합물을 추가합니다. 런이 완료되면 실험 데이터를 Soft Max PRO 소프트웨어를 사용하여 직접 처리하거나 Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램으로 복사하여 붙여넣을 수 있습니다.

데이터를 분석하기 위해, 서술된 절차에 따라 최소제곱법 피팅을 사용하여 TRPA1 작용제인 fluphonemic acid와 추정 TRPA1 길항제 화합물 A에 대한 농도 반응 곡선을 생성합니다. TRPA1은 칼슘 투과성 양이온 채널로, 이 채널의 활성화는 칼슘 민감성 염료인 Fluo-4 AM으로 검출 가능한 칼슘 유입을 유도합니다. 일련의 fluphonemic acid 또는 FFA 농도에 반응하여 나타나는 형광 변화의 시간 경과를 보여주는 대표적인 트레이스가 고농도에서 제시되어 있습니다. FFA로 유발된 형광 증가는 피크 형광 수준이 유사함에도 불구하고 저농도일 때보다 훨씬 빠른 역학으로 나타납니다.

이러한 차이를 구분하기 위해, 형광 증가의 초기 속도를 측정하여 농도 반응 관계를 구축하였습니다. 다양한 농도의 FFA를 첨가했을 때, FFA의 반최대 유효 농도는 55.4 micromolar로 결정되었습니다. 추정되는 TRP1 길항제인 화합물 A에 의한 FFA 유발 칼슘 반응 억제의 농도 반응 관계 또한 함께 제시되었습니다.

용량 의존적으로 trip A one 세포의 FFA 반응이 감소하였으며, 반최대 억제 농도는 4.3 micromolar였습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 flag station three를 사용하여 triple A one 및 관련 채널의 약리학적 프로파일을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.