Name: FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 학습하세요 FlexStation 3을 사용하여 TRPA1 채널의 약리학적 프로파일을 분석하는 고처리량 칼슘 분석법을. 이 방법은 이온 채널 기능 연구와 신약 개발에 활용됩니다.

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우리는 DRS 감사합니다. 존 핸콕, 레이 그릴, 앤드류 모리스과 지원 올가 Chumakova. FlexStation 3 시스템은 UTHSC Cytodynamic 이미징 시설의 일부입니다. 우리는 또한 DRS 감사합니다. 스크립스 연구소와 HEK293 - hTRPA1 안정 세포주를 제공 노바티스 연구 재단 (GNF)의 게놈 연구소에서 Ardem Patapoutian 마이클 Bandell. 연구는 NIH (MXZ에 GM081658)와 텍사스 메디컬 센터 소화기 질환 센터 (HH)을하고 미션 연결 / TIRR 재단 (HH로)에서 부여로 일부에서 지원됩니다.

1. 96 - 웰 플레이트에 셀 준비 transiently cDNA 인간 TRPA1와 trasfected HEK293 세포에 대한 <ol><li> HEK293 세포는 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 (Invitrogen, 16000-044)와 보충 4.5 MG / ML 포도당 (써모 과학, SH3002201)이있는 Dulbecco의 최소 필수 매체 1~2일 (DMEM), 50 단위 재배 / ML 페니실린 50 μg / ML 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 15140-163). transfection의 날, 세포 밀도는 70-90%에 도달해야합니다. </li><li> 각 물론 50 μl 폴리 - L - ornithine (시그마 P3655, 멸균 증류수에 20 μg / ML)를 pipetting 37에서 잠복기 ° C를 최소한 15 분에 의해 외투 96 - 웰 플레이트. Dulbecco의 인산 각각 잘 한 번 씻어도 MG이없이 살린 (DPBS)를 버퍼 + 및 CA 2 + (써모 과학, SH3002803). 번호판은 몇 시간 동안 세포 배양 후드에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트 모든 잘 들어, 1.5 ML Eppendorf 튜브 25 μl OPTI - 멤 (Invitrogen, 31985-070)의 cDNA 0.2 μg에 희석. 동일한 cDNA로 transfected 수 웰스의 숫자에 따라 비례 최대 규모. 또한 transfected하는 각 물론 25 μl OPTI - 멤 별도의 1.5 ML Eppendorf 튜브 0.4 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019)에 희석. transfected 수 웰스의 총 개수에 따라 최대이 크기. </li><li> 간단히 와동 희석 cDNA와 Lipofectamine 2000을주고 약 5 분 실온에서 앉아 보자. </li><li> 희석 cDNA, 소용돌이가 들어있는 튜브에 희석 Lipofectamine 2000의 동일한 볼륨을 전송하고 혼합물이 15 분 ~ 2 시간을 위해 실내 온도에 앉아 보자. 이 기간 동안, 49 μl에 / 잘 폴리 - L - ornithine 코팅 판에 Lipofectamine / cDNA 2,000 혼합물을 전송합니다. </li><li> HEK293 세포를 (단계 1.1) Trypsinize, hemocytometer 또는 카운테스 자동 세포 계수기 (Invitrogen, C10227)를 사용하여 셀 밀도를 계산하고, 15 ML 멸균에 (일반적으로 약 ~ 125,000-150,000 전지 / 음) 세포를 원하는 금액을 송금 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브. 5 분 1,000 X의 RPM에서 원심 분리기. 10% 열 inactivated 태아 소 혈청과 보충 DMEM 문화 매체 ~ 1,250,00-1,500,000 세포 / ML,에서하지만, 항생제없이 Resuspend 세포. </li><li> 멀티채널 pipetter 또는 MicroFill의 Microplate 디스펜서 (생물 테크)를 사용하여 cDNA - Lipofectamine 2,000 혼합을 포함하고있는 각 물론 98 μl 세포 현탁액을 분배. 접시가 humidified 세포 배양기 문화에 배치하기 전에 최소한 30 분 후드에 앉아 보자. ° C, 5 % CO 2 20-44 시간을위한 37 알을 품다. </li></ol> 안정 TRPA1을 표현하는 HEK293 세포에 대한 <ol start="8"><li> 코트 96 - 웰 플레이트 단계 1.2를 따르십시오. </li><li> inducible HEK293 - hTRPA1 셀 라인은 넉넉한 (Invitrogen, 박사 A. Patapoutian (스크립스 연구소)에 의해 제공하고 야생 타입 HEK293 세포 (단계 1.1)과 같은 매체를 유지하지만, 5 μg / ML blasticidin로 보충했습니다 A1113902) 50 μg / ML hygromycin B (Invitrogen, 10687010). 세포 밀도가 약 90 %에 도달하면, 세포를 trypsinize, 세포 밀도를 계산하고, 5 분 1000 X RPM에서 세포의 원하는 금액을 원심 분리기. doxycycline (피셔, BP265​​35, 0.25 μg / ML)로 보충 같은 문화 매체 ~ 1,000,000 세포 / ML의 밀도에 Resuspend 세포. </li><li> μl / 잘 멀티채널 pipetter 또는 MicroFill (바이오 테크)를 사용하여 100 폴리 - L - ornithine 코팅 접시에 세포 현탁액을 분배. 접시가 humidified 세포 배양기 문화에 배치하기 전에 최소한 30 분 후드에 앉아 보자. 37 품어 ° C 5 % CO 16 2-24 시간. </li></ol> 2. 솔루션 <ol><li> 행크의 버퍼 소금 용액 (HBSS)은 세포 솔루션으로 사용됩니다. 그것은 (MM)를 포함 137 NaCl, 5.4 KCl, 0.25 나 2 HPO 4, 0.44을 KH 2 PO 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 1N NaOH를 사용하여 7.4으로 조정 산도와 MgCl 2, 10 포도당, 10 HEPES). </li><li> Fluo - 4 검정 버퍼 HBSS에 probenecid이 MM이 포함되어 있습니다. 0.5 N NaOH 250 MM 주식 probenecid (시그마, P8761)을 확인합니다. 1:125의 비율로 희석 HBSS. 1 N HCL을 사용하여 산도에 7.4을 재조 정해. </li></ol> 3. Fluo - 4이라서 셀 로딩 <ol><li> 1 ㎜의 주식 솔루션을 만들기 위해 912 μl 무수 DMSO 1 MG Fluo - 4시 (Invitrogen, F14202)를 디졸브. Fluo - 4 재고 솔루션을 적어도 한 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 AM. </li><li> 10 μl 1 ㎜를 섞어 Fluo - 4 다음 10 μl Pluronic F - 127 (Invitrogen, P3000MP, DMSO의 20 % (W / V) 솔루션) 5 ML Fluo - 4 분석 완충액 (단계 2.2)로 전체 내용을 전달 AM (시그마, A9418) 0.1 % 소 혈청 알부민과 보완. </li><li> microplate 와셔 (예 : 바이오 테크에서 ELx405TM 등)를 사용하여 80 μl / 음 2 번에서 HBSS와 (단계 1.7 또는 1.10) 96 - 웰 플레이트에 성장 세포를 씻으십시오. </li><li> Fluo 추가-4는 μl / 잘 다채널 pipetter 또는 MicroFill을 (바이오 테크)를 사용하여 37에서 번호판을 품어 50 (3.2 단계) 솔루션을 로딩 AM ° C 1 시간을 위해. </li><li> ELx405TM의 microplate 와셔를 사용하여 Fluo - 4 분석 완충액 (단계 2.2.)으로 세포에게 3 번 씻으십시오. 마지막 세척 후, 각 우물에 Fluo - 4 검정 버퍼의 80 μl를 떠나. </li></ol> 4. 복합 접시의 준비 <ol><li> 1 시간 셀 로딩 기간 동안, Fluo - 4 검정 버퍼에 원하는 최종 농도의 3 배의 agonists의 3 배 dilutions (또는 antagonists)의 시리즈를 준비합니다. </li><li> 96 - 웰 복합 판으로 희석 복합 솔루션의 피펫 250-300 μl. FlexStation 3 한 번에 하나의 컬럼을 읽고 있기 때문에 그것이 가능한 때마다 복합 판의 동일한 열에있는 화합물과 해당 긍정적이고 부정적인 컨트롤의 시리얼 dilutions을 가지고 배열. </li></ol> 5. FlexStation 3 플레이트 읽기 <ol><li> (FlexStation 3, 컴퓨터, 그리고 SoftMax 프로 5.2 소프트웨어) 시스템을 켜십시오 </li><li> 새 파일 이름으로 실험을 저장합니다. 설정에서 플렉스 모드를 선택하고 다음 값을 입력합니다 : </li></ol> 프로토콜 # 1 작용제 효과 <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="표 1"> 프로토콜 # 2 길항제 효과 <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="표 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="표 2"><ol start="3"><li> FlexStation 3 해당 트레이에 새로운 팁 상자, 복합 판과 독서 접시를 놓고 버튼을 "읽기"를 클릭하십시오. FlexStation 3 한 번에 하나의 컬럼을 읽고 독서를 방해하지 않고 프로그램된 시간 지점에서 화합물을 추가합니다. 그것은 하나의 열로 표시하고 기계가 모든 열을 읽기까지로 단계 5.2 사용자에 의해 프로그램 수행 화합물 추가로 다음 칼럼을 읽고 계속을 읽는 끝내고 약 3 분 (프로토콜 # 2 5 분) 정도 소요됩니다. </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> 실험 데이터는 직접 SoftMax 프로 5.2 소프트웨어를 사용하거나 복사 및 Microsoft Excel과 같은 스프레드 시트 프로그램, 붙여넣을 처리할 수 있습니다. TRPA1 작용제의 flufenamic 수 소산​​ (FFA)의 농도 - 반응 곡선은 다음과 같은 최소 제곱 피팅 루틴을 사용하여 구성되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="방정식 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="방정식 1"> , Y가 관찰된 반응 어디에, Y 맥스가 표준 최대한의 응답이며, C는 해당 약물 농도이며, EC 50 반 최대한의 반응을 evoked 농도이며, N H는 명백한 힐 계수이다. putative TRPA1 길항제 화합물에 대한 농도 - 저해 곡선은이 FFA (100 μm의)의 고정 농도를 사용하고, 점차적으로이 다음에 맞는 최소 제곱으로 계산됩니다 화합물의 복합 A. IC 50 가치의 농도를 증가하여 얻을 수있다 방정식. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="방정식 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="방정식 2"> 어디 Y는 관찰된 반응이고 Y 최대가 최대 응답을 표준인데, [개미]에 해당 화합물의 농도이며, IC 50 FFA - evoked 응답의 절반 최대한 억제를 생산 길항제 농도이며, N H는 분명 힐입니다 계수. </li></ol> 7. 대표 결과 : TRPA1는 +에 민감한 염료 칼슘 2, Fluo - 4 (1-2)에 의해 감지 수있는 칼슘 유입에 이르게 활성화하는 칼슘 2 + - 투과 양이온 채널이다. HEK293 - hTRPA1 안정적인 세포 라인 TRPA1 agonists과 antagonists의 농도 - 반응 관계를 연구하는 데 사용되었다. 전지, Fluo - 4이라서 로드된 분석 버퍼의 80 μl에 배치하고, FlexStation 3을 사용 읽어되었습니다. 30 s에 대한 기준 형광을 기록 후, TRPA1 작용제, FFA의 시리얼 희석 40 μl, 원하는 최종 농도의 3 배 각은 fluidics 모듈의 일부로 포함 멀티 채널 pipetter을 통해 세포에 추가되었습니다 FlexStation 3. 형광 변경 사항은 추가로 180 S.에 대한 감시했다 각각 F와 F 0 관심과 독서의 시작 시점에 형광 값이다 - (F 0 F), 각 잘 대해 상대적 Fluo - 4 형광 변경 ΔF =으로 표현했다. FFA 농도의 일련의에 대한 응답으로 형광 변화 시간 코스의 대표 성분은 그림에 표시됩니다. 1. 최대한 응답 수준은 유사하지만, 활성화 반응 속도론은 낮은 FFA의 농도보다 더 높은에서 명확하게 빠른이며, 마지막 네 FFA의 농도에 대한 참고. 따라서 이러한 차이, 농도를 구별 - 반응 관계는 FFA의 다양한 농도 (그림 2)뿐만 아니라시 형광 증가의 초기 속도를 (경사) 측정에 의해 건설되었습니다. 하프 최대한의 효과FFA의 이브 농도 (EC 50) 55.4 μm의 (N = 3)으로 결정되었다. putative TRPA1 길항제를 테스트하려면 A를 화합물, 우리는 프로토콜 # 2 (2 단계)을 사용하여 비슷한 실험을 수행했습니다. 이 경우에는 길항제의 dilutions 일련의 30 S (배 원하는 최종 농도 40 μl)에 추가된 및 FFA는 (100 μm의의 최종 농도 300 μm의 60 μl) 나중에 180의 추가되었습니다. 컴파 운드 선량 - dependently 4.3 μm의의 반 최대한 억제 농도 (IC 50) (N = 3) (그림 2)와 FFA에 TRPA1 세포의 응답을 감소. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> FFA에 의해 인간 TRPA1의 그림 1. 농도 - 의존 활성화. 성분은 시간이 지남에 따라 형광의 FFA - evoked 증가 (처음 60 S에서만 응답이 더 FFA - evoked 응답의 빠른 반응 속도론을 설명하는 표시됩니다)입니다. 높은 농도의 FFA 함께 형광 증가 evoked 점에 유의하십시오 훨씬 빠른 운동 낮은 농도에서보다 정상 형광 수준과 유사했다하더라도. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2 농도 -. FFA - 유도 형광 변화와 화합물 안정 HEK293 세포에 표현 인간 TRPA1에 FFA 반응의 유도 억제를위한 대응 관계. Δ, 집중력 - FFA의 반응 관계가 FFA 농도의 변화를 추가시 표준 형광 증가의 초기 속도를 (경사) 측정에 의해 결정되었다. O, putative TRPA1 길항제에 의해 FFA - evoked 칼슘 반응의 억제의 농도 - 반응 관계, 화합물 A.

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</ol>

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세포내 칼슘 2 +과 같은 신경 전달 물질 릴리즈 (3), 심장 활동 전위 (4), 근육 세포 수축 (5), 세포 신호 전달 (6-7) 및 excitotoxic 세포 죽음 (많은 생리와 병리 학적 조건에서 중요한 역할을 담당 8). 세포내 칼슘 2 + 수준의 측정 기능 + - 투과 채널 플라즈마 막이나 세포 organelles에서 칼슘 2의 변화와 공헌을 명료하게하다하는 데 도움이 위의 프로세스 (9-13)에 CA 2 +. 분석은 또한, 그 중 많은 G - 단백질 결합 수용체의 기능을 조사 활성화에 따라, + 상점 세포내 칼슘 2 칼슘 2 +를 방출 또는 다른 칼슘 2 활성화하여 세포내 자유 칼슘 2 + 농도를 증가로 이어질하는 데 사용할 수 있습니다 + 투과 이온 채널 (14-16). FlexStat...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> 분자 장치 </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 음, FlexStation의 Pipet 도움말 </td><td> 분자 장치 </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 </td><td> 그라 이너 바이오 - 원 </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 지우기 플랫 바텀 플레이트 </td><td> 코스타 </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti - 멤 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> AM Fluo - 4 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF - 127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 - L - ornithine </td><td> 시그마 </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probenecid </td><td> 시그마 </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

flexstation 3을 사용 trp 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

분자 장치 &#39;FlexStation 3 멀티 잘 접시에 자동 형광 측정 가능한 benchtop 다중 모드 microplate 리더입니다. 그것은 학술 설정에서 중간에 높은 처리량 화면에 이상적입니다. 그것은 멀티 채널 pipetter과 기계가 형광 시약의 다양한 형광 변화를 모니터링하기 위해 한 번에 한 컬럼을 읽고 갖춘 통합 유체 전송 모듈이 있습니다. 예를 들어, FlexStation 3 + - 투과 이온 채널과 G 단백질 결합 수용체 세포 무료 칼슘 2 + 수준의 변화를 측정하여 칼슘 2의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 과도 수용체 잠재적인 (TRP) 채널은 많은 생리와 pathophysiological 기능에 중요한 역할을 nonselective 양이온 채널의 큰 가족입니다. TRP 채널의 대부분은 칼슘 투과하고 활성화시 칼슘 유입을 유도. 이 비디오에서는, 우리는 TRPA1 채널, 다양한 유해 자극에 대해 분자 센서의 약리 프로필을 공부 FlexStation 3 응용 프로그램을 보여줍니다. transiently 또는 안정 96 - 웰 플레이트에서 자란 인간 TRPA1 채널을, 표현 HEK293 세포가 + 민감한 형광 염료 칼슘 2, Fluo - 4, 이러한 세포의 실시간 형광 변경 로드된은의 적용 전과하는 동안 측정 FlexStation 3 플렉스 모드를 사용하여 TRPA1 아고 니스트. putative TRPA1 길항제의 영향도 조사했다. 데이터는 TRPA1 activators와 억제제의 농도 - 반응 관계를 구축하기 위해 SoftMax Pro 소프트웨어에서 전송됩니다.

이 동영상은 FlexStation 3을 사용 인간 TRPA1 채널의 약리 프로필을 공부에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 준비, 염료 로딩과 microplate 리더 FlexStation 3 작업의 세부 사항을 다룹니다.

FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

Molecular Devices의 FlexStation 3는 멀티웰 플레이트에서 자동 형광 측정이 가능한 벤치탑 멀티모드 마이크로플레이트 리더기입니다. 이것은...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 Flex Station three를 적용하여 transient receptor potential 또는 trip a one 채널의 약리학적 프로파일을 연구하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 96-well 마이크로타이터 플레이트에 trip a one 채널을 발현하는 세포를 준비함으로써 수행됩니다.마이크로플레이트 워셔로 세포를 세척한 후, 칼슘 민감성 형광 염료인 Fluo-4로 세포를 로딩합니다. 세포 로딩 기간이 지나면 여러 번의 추가 세척 과정을 거칩니다. 절차의 다음 단계는 TRIP1 작용제와 추정 TRIP1 길항제를 포함하여 화합물 플레이트를 준비하는 것입니다.마지막 단계로, Flex Station three 시스템의 플레이트 리딩을 위한 소프트웨어 파라미터를 설정합니다. 최종적으로, flu phonemic acid에 의한 trip A one 활성화와 길항제 화합물 A에 의한 억제에 대한 용량 반응 관계를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 칼슘 유입을 측정함으로써 21 활성화 메커니즘에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 칼슘 민감성 frozen 염료 또는 maly 전위 염료를 사용하여 다른 칼슘 투과성 eye 채널 및 deep 단백질 결합 수용체의 기능을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다.이 기법이 칼슘 이미징 및 수동 패치 매핑과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 시간 절약형 기술로서 칼슘 포뮬러, 철 채널 및 기타 ca 동원 수용체의 기능과 조절에 대한 고효율 스크리닝을 제공한다는 점입니다. 본 프로토콜을 시작하기 전, 서면 프로토콜에 기술된 대로 trip A one이 안정적으로 형질전환된 HEC 2 93 세포를 70~90% 밀도로 배양하십시오. 칼슘 분석을 위한 세포 준비를 시작하려면, 96-well 플레이트의 각 웰에 poly L ornithine 50 µL를 피펫팅하여 코팅하고, 플레이트를 37 °C에서 최소 15분 동안 배양하십시오.배양 후, KO의 인산염 완충 식염수로 세포를 한 번 헹굽니다. 트립신 처리 후, HEC 2 93 세포 중 원하는 양의 세포를 15 milliliter 멸균 원추형 바닥 튜브로 옮겨 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 생성된 세포 펠릿을 재현탁합니다.10% 열불활성화 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM 배양 배지에 세포 현탁액 100 µL를 96웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 멀티채널 피펫을 사용하며, 플레이트를 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣기 전 후드 내에서 최소 30분 동안 그대로 둡니다. 이후 20~44시간 동안 배양합니다. 칼슘 분석 준비를 위해, 먼저 서면 프로토콜에 기술된 대로 용액들을 조제합니다.준비가 완료되면, 1 mM flu oh 4:00 AM 10 µL와 onic. F1 27 10 µL를 혼합합니다. 전체 내용물을 0.1% bovine serum albumin이 첨가된 5 mL flu. Oh four assay buffer로 옮깁니다.다음으로, 96-웰 플레이트에서 배양된 세포를 마이크로플레이트 워셔를 사용하여 웰당 80 µL의 HBSS로 2회 세척합니다. 세척 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 웰당 50 µL의 Fluo-4 AM 로딩 솔루션을 첨가하고, 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 1시간의 세포 로딩 기간 동안, 효능제(agonist)의 3배 농도 용액 시리즈, 길항제(antagonist)의 3배 농도 용액 시리즈, 그리고 Fluo-4 분석 버퍼에 희석된 300 µM 효능제 대량 용액을 준비합니다.희석된 화합물 용액 300 µL를 96-웰 화합물 플레이트에 분주합니다. 가급적 화합물의 연속 희석액과 그에 해당하는 양성 및 음성 대조군이 화합물 플레이트의 동일한 열에 배치되도록 구성하십시오. Flex station three는 한 번에 하나의 열만 읽으므로, 최종 세포 준비 단계로 길항제가 들어 있는 각 웰에 인접하여 300 µM 작용제 용액 300 µL를 피펫팅합니다.마이크로플레이트 워셔를 사용하여 로딩된 세포를 flu oh four 산성 버퍼로 3회 세척하고, 마지막 세척 후 각 웰에 flu oh four 산성 버퍼 80 microliters를 남겨둡니다. 플레이트 판독을 시작하려면 Flex Station three 시스템의 전원을 켜고 soft max Pro 5.2 소프트웨어를 실행하십시오.설정 단계에서 실험을 새로운 파일 이름으로 저장하십시오. 플렉스 모드(flex mode)를 선택하고 서면 절차에 기재된 대로 작용제 및 길항제 효과를 측정하기 위한 파라미터를 입력하십시오. 다음으로, 새로운 팁 박스, 화합물 플레이트 및 리딩 플레이트를 플렉스 스테이션의 적절한 트레이에 배치하십시오. 셋.Soft Max Pro 소프트웨어의 read 버튼을 클릭하여 플레이트 리딩을 시작합니다. Flex Station three는 한 번에 한 열씩 리딩하며, 리딩을 중단하지 않고 미리 프로그래밍된 시점에 화합물을 추가합니다. 런이 완료되면, 실험 데이터는 Soft Max PRO 소프트웨어를 사용하여 직접 처리하거나 Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램에 복사하여 붙여넣을 수 있습니다.데이터를 분석하기 위해, 서면 절차에 설명된 최소제곱법(least squares fitting)을 사용하여 TRPA1 작용제인 fluphenamic acid와 추정 TRPA1 길항제 화합물의 농도 반응 곡선을 생성합니다. TRPA1은 칼슘 투과성 양이온 채널로, 이 채널이 활성화되면 칼슘 유입이 발생하며 이는 칼슘 민감성 염료인 Fluo-4 AM으로 검출할 수 있습니다. 일련의 fluphenamic acid 또는 FFA 농도에 반응하여 나타나는 형광 변화의 시간 경과를 나타낸 대표적인 트레이스가 높은 농도에서 보여집니다. FFA로 유도된 형광 증가는 낮은 농도에서와 유사한 최대 형광 수준을 보임에도 불구하고 훨씬 더 빠른 역학으로 나타납니다.이러한 차이를 구분하기 위해 형광 증가의 초기 속도를 측정하여 농도 반응 관계를 구축하였습니다. 다양한 농도의 FFA를 첨가했을 때, FFA의 반최대 유효 농도는 55.4 micromolar로 결정되었습니다. 추정되는 TRP1 길항제인 화합물 A에 의한 FFA 유발 칼슘 반응 억제의 농도 반응 관계 또한 화합물로 나타나 있습니다.용량에 따라 trip A one 세포의 FFA에 대한 반응이 독립적으로 감소하였으며, 반최대 억제 농도는 4.3 micromolar였습니다. 이 영상을 시청하고 나면, flag station three를 사용하여 triple A one 및 관련 채널의 약리학적 프로파일을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

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Bioengineering

생명공학

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER +의 적용 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

MRGPRX2 수용체를 통해 비만 세포를 활성화할 수 있는 짧은 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 기술이 기재되어 있다. 관련 기술은 쉽고 저렴하며 다른 세포 수용체로 확장 될 수 있습니다.

엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝

본 프로토콜은 고처리량 약물 스크리닝 및 독성 테스트를 위해 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)에서 유발된 세포 활성의 전광학 제어 및 관찰을 설명합니다. 시간과 공간에서의 표현형 패턴의 다중 모수적 정량화가 도시된다. 몇 시간에 걸친 약물의 장기적인 효과 또는 며칠에 걸친 순차적 측정이 입증되었습니다.

독성 테스트 및 표현형 약물 스크리닝을 위해 iPSC 유래 심근 세포에서 칼슘 신호를 고처리량 광학 제어 및 기록

이 프로토콜은 막 전위의 변화를 측정하여 전기적 막 단백질을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 상피 세포주에서 내인성으로 발현되는 여러 이온 채널의 기능적 판독을 위한 플랫폼을 제공합니다.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

이온 채널의 약리학적 표적화는 고형 종양을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 암세포에서 이온 채널 기능을 특성화하고 암 생존력에 대한 이온 채널 조절제의 효과를 분석하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

암세포의 이온 채널 스크리닝

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

학습하세요 FlexStation 3을 사용하여 TRPA1 채널의 약리학적 프로파일을 분석하는 고처리량 칼슘 분석법을. 이 방법은 이온 채널 기능 연구와 신약 개발에 활용됩니다.

FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

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