고해상도: 망막 시냅스(Retinal Synapse)에서 신경전달물질 수용체(Neurotransport Receptors)의 고해상도(High-resolution) 이미징

전자 현미경 그리드에서 마우스 망막 절편을 취하십시오. 이 섹션에는 양극성 세포에 시냅스적으로 연결된 망막 신경절 세포 또는 RGC가 포함되어 있습니다.

시냅스 전 양극성 세포는 시냅스막 근처의 리본 구조로 배열된 신경 전달 물질 소포를 포함합니다.

시냅스 후 RGC는 막에 군집된 신경 전달 물질 수용체를 표시합니다. 이 세포는 콜레라 독소 서브유닛 B 또는 CTB로 표지됩니다.

pH를 유지하기 위해 완충액으로 세척하십시오.

비특이적 결합 부위를 마스킹하기 위해 블로킹 완충액과 함께 배양합니다.

신경 전달 물질 수용체 및 CTB를 표적으로 하는 1차 항체와 함께 배양합니다.

완충액으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 pH를 유지합니다.

1차 항체에 결합하여 표적 분자를 표지하는 다양한 크기의 금 나노입자에 접합된 2차 항체와 함께 배양합니다.

결합되지 않은 항체를 제거한 다음 샘플을 자연 건조시킵니다.

거대분자를 결합하는 중금속을 적용하여 대비를 강화합니다.

전자 현미경을 사용하여 표지된 CTB를 사용하여 RGC를 식별하고 표지된 신경 전달 물질 수용체를 찾습니다.

이 단계에서는 울트라마이크로톰으로 70나노미터 두께의 초박형 절편을 절단하고 Formvar 탄소 코팅 니켈 그리드에 수집합니다. 그리드를 증류수로 한 번 세척한 다음 TBS를 세 번 세척합니다. 그런 다음 TBS에서 20마이크로리터의 5% BSA에서 그리드를 30분 동안 배양한 다음 염소 항-CTB와 하나의 NMDAR 서브유닛에 대한 항체를 포함하는 혼합물 20마이크로리터에서 실온에서 밤새 배양합니다.

그런 다음 pH 7.6에서 매번 20마이크로리터의 TBS로 그리드를 세 번 세척합니다. 그런 다음 pH 8.2의 TBS로 5분 동안 그리드를 한 번 세척합니다. 10나노미터 금 입자와 결합된 당나귀 항토끼 IgG 및 18나노미터 금 입자에 결합된 당나귀 항염소 IgG를 포함하는 20마이크로리터의 혼합물과 함께 그리드를 2시간 동안 배양합니다.

2시간 후 pH 7.6에서 20마이크로리터의 TBS로 그리드를 3회 세척한 다음 초순수로 세척합니다. 그런 다음 그리드를 자연 건조시킵니다. 그런 다음 증류수에 5% 우라닐 아세테이트로 그리드를 8분 동안 대조염색한 다음 증류수에 0.3% 구연산납을 어둠 속에서 5분 동안 대조

염색합니다.