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신경과학
0 조회수 • 2:52 분 • April 28th, 2025
발광 기질인 루시페린이 보충된 자극 용액에 부착된 재조합 포유류 세포를 포함하는 멀티웰 플레이트로 시작합니다.
루시페린이 세포에 들어갈 수 있도록 배양합니다.
이 세포는 후각 G-단백질 및 수용체 수송 단백질과 결합된 막 결합 냄새 수용체를 발현합니다.
또한 세포는 순환 AMP에 민감한 발광 단백질인 세포질 Glosensor 단백질을 발현합니다.
웰 사이의 공간에 기화성 냄새 용액을 추가하고 동일한 냄새로 미리 평형화된 발광계 기기 안에 플레이트를 놓습니다.
발광 측정을 시작합니다.
냄새 분자는 세포의 냄새 수용체에 결합하여 결합된 G-단백질을 활성화하고 G-단백질의 α 서브유닛 또는 Gα를 해리시킵니다.
해리된 Gα 서브유닛은 막 포매 아데닐레이트 시클라제 효소에 결합하여 활성화합니다. 활성화된 효소는 ATP를 순환 AMP로 전환합니다.
이러한 순환 AMP는 글로센서 단백질과 결합하여 형태를 변경하고 루시페린 결합을 가능하게 합니다.
이 상호 작용은 발광을 생성하여 냄새 수용체의 활성화를 확인합니다.
75마이크로리터의 cAMP 시약 용액을 추가합니다. 웰에서 자극 용액을 제거하고 각 웰에 25마이크로리터의 희석된 cAMP 시약 용액을 추가합니다. 96웰 플레이트를 어둡고 냄새가 없는 환경에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
먼저 냄새를 나오는 아세토페논을 미네랄 오일 10밀리리터에 1%로 희석하고 튜브의 뚜껑을 덮습니다. cAMP 시약 배양 시간이 끝나기 전에 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 25마이크로리터의 냄새 용액을 추가합니다. 그런 다음 이 냄새 플레이트를 발광계 챔버에 5분 동안 놓아 챔버를 휘발성 냄새 분자와 평형을 유지합니다. 90초 플레이트 측정의 20주기 동안 0.7초의 간격으로 0초의 지연으로 발광을 기록하도록 발광계를 설정합니다.
플레이트를 읽기 직전에 챔버에서 냄새 플레이트를 제거합니다. 형질감염된 세포가 들어 있는 96웰 플레이트에 웰 사이의 공간에 25마이크로리터의 냄새제를 추가하고 플레이트를 챔버에 빠르게 다시 넣습니다. 30분 이내에 20사이클 동안 모든 웰의 발광 측정을 시작합니다.