레이저로 유도된 뇌 손상 쥐 모델에서 혈액-뇌 장벽 무결성 평가

마취된 대조군 쥐와 레이저 유도 뇌 손상 쥐 모델을 취합니다.

오른쪽 반구에 레이저를 바르면 세포와 뇌 조직에서 혈액을 분리하는 혈액뇌장벽(BBB)이 손상되었습니다.

체순환을 통해 뇌에 도달하는 캐뉼라 모양의 꼬리 정맥에 추적 염료를 주입합니다.

염료는 혈장 단백질에 결합하고 손상된 BBB를 통해 뇌 조직으로 누출됩니다.

쥐를 안락사시키십시오.

쥐를 심장을 통해 관류하여 순환에서 염료를 제거합니다.

뇌를 추출 및 슬라이스하고 손상된 반구에서 슬라이스를 분리하여 균질화합니다.

산성 용액으로 처리하여 단백질을 변성시켜 단백질 결합 염료를 방출합니다.

염료 함유 상청액을 원심분리하여 분리합니다. 염료 형광을 강화하기 위해 알코올을 첨가하십시오.

용액을 마이크로플레이트로 옮깁니다. 흥분 시 손상된 뇌의 형광 강도가 높을수록 레이저에 의해 유도된 BBB 손상을 나타냅니다.

혈액-뇌 장벽 파손 발생률을 평가하기 위해 레이저 유발 손상 24시간 후 식염수 킬로그램당 4밀리리터로 희석한 2% Evans 청색 염료를 주사기에 넣고 캐뉼라 꼬리 정맥을 통해 부상당한 쥐와 대조군 쥐에게 용액을 정맥 주사합니다.

수술용 핀 세트와 가위를 사용하여 첫 번째 동물의 가슴을 열기 전에 용액을 1시간 동안 순환시키십시오. 우심방에서 무색 관류액이 관찰될 때까지 좌심실을 통해 냉각된 0.9% 식염수로 110 수은 의 압력으로 노출된 심장을 관류합니다.

다음으로 뇌를 채취하고 2mm 주위 꼬리 슬라이스를 얻습니다. 좌뇌 절편을 우뇌 절편에서 분리하여 손상된 반구와 손상되지 않은 반구를 별도로 평가하고 샘플의 무게를 측정합니다. 절구와 유봉을 사용하여 샘플을 균질화하고 조직 샘플을 50% 트리클로로아세트산에서 24시간 동안 배양합니다.

다음날, 균질화된 뇌 조직 샘플을 10,000배 g과 실온에서 20분 동안 원심분리했습니다. 상청액 1밀리리터와 96% 에탄올 1.5밀리리터를 1:3 비율로 혼합합니다. 그런 다음 620나노미터 여기 및 680나노미터 방출 파장에서 형광 검출기를 사용하여 혈액-뇌 장벽 파괴를 평가합니다.