내피 세포에서 밀접한 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화(Fluorescence Localization of tight junction proteins and stress fibers in endothelial cells)

혈액-뇌 장벽의 내피층 세포층을 모방한 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포(RBMEC)의 단층 배양액이 포함된 챔버 슬라이드를 가져 가십시오.

세포는 산소-포도당 결핍에 이어 재산소화로 인한 스트레스로 인해 파괴된 밀착 단백질과 액틴 스트레스 섬유를 나타냅니다.

배지를 제거하고 세포를 세척하고 고정액을 도포하여 세포 구조를 보존한 다음 과도한 고정액을 씻어냅니다.

세포막을 투과화하기 위해 세제로 처리합니다.

비특이적 결합 부위를 마스킹하기 위해 차단제와 함께 배양합니다.

밀착 접합 단백질을 라벨링하려면 특정 1차 항체와 함께 배양한 다음 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

형광단 접합 2차 항체와 함께 배양하여 1차 항체를 표지합니다.

또는 스트레스 섬유를 표지하기 위해 형광단 태그가 지정된 팔로이딘을 추가합니다.

결합되지 않은 라벨링 분자를 제거하려면 세척합니다.

챔버를 제거하고 형광 DNA 결합 염료가 포함된 마운팅 매체를 도포하여 핵을 염색한 다음 커버슬립으로 밀봉합니다.

공초점 현미경을 사용하여 형광 표지된 밀착 접합 단백질과 스트레스 섬유를 시각화합니다.

RBMEC 단층의 각 웰을 100 내지 200마이크로리터의 Opti-MEM 환원 혈청 배지에 노출시키는 것으로 시작하고 한 시간 동안 배양을 계속합니다. 그런 다음 세척당 웰당 100-200마이크로리터의 PBS를 사용하여 챔버 슬라이드를 세 번 세척합니다. PBS에 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하고 슬라이드를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그리고 이전과 같이 PBS로 세포를 세 번 씻어냅니다.

이제 PBS에 100 내지 200 마이크로리터의 0.5% Triton X-100을 각 웰에 적용하여 세포를 투과화합니다. 그리고 플레이트를 실온에서 15분 더 배양합니다. 세포가 투과화된 후 차단 용액을 도포합니다. 그리고 이것이 실온에서 한 시간 동안 세포에 작용하도록 하십시오.

다음으로, ZO-1 단백질에 대한 면역형광을 수행하거나 F-액틴을 표지합니다. ZO-1에 대한 세포의 면역형광을 수행하려면 섭씨 4도에서 밤새 1차 항체와 함께 배양합니다. 다음날, 고정액을 제거할 때와 같이 PBS에서 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 100 내지 200 마이크로리터의 FITC 태그 항토끼 2차 항체에 세포를 실온에서 1시간 동안 배양하여 세포를 로다민 팔로이딘으로 표지합니다.

차단 용액을 한 시간 동안 도포한 후, 세포를 100 내지 200 마이크로리터의 로다민 팔로이딘에 1 내지 50 희석액으로 20% BSA PBS와 함께 20분 동안 노출시킵니다. 2차 항체 또는 로다민 팔로이딘 배양 후, 이전과 같이 PBS로 세포를 다시 세 번 세척한다. 그런 다음 고무줄을 벗겨 챔버를 제거합니다. 퇴색 방지 및 DAPI가 포함된 매체를 사용하여 슬라이드 장착을 진행합니다. 60x 대물렌즈를 사용하여 단일 평면에서 공초점 현미경으로 세포를 이미지

화합니다.