$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
화학적으로 고정된 인간이 아닌 영장류 뇌 절편으로 시작합니다.
알데히드 기반 고정제는 단백질을 가교하여 조직 구조를 보존하지만 일부 반응성 알데히드 잔류물을 남깁니다.
조직 절편을 둘러싼 냉동 보호층을 제거하기 위해 세척합니다.
환원제를 첨가하여 반응성 알데히드 그룹을 중화시켜 반응 부산물을 생성합니다.
이러한 부산물과 과도한 환원제를 제거하기 위해 세척하십시오.
비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 용액을 도포합니다.
신경막의 특정 부위에서 발현되는 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 추가합니다.
결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척합니다.
1차 항체를 표적으로 하는 비오티닐화된 2차 항체를 첨가합니다.
결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척합니다.
2차 항체에 결합하는 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체와 오버레이합니다.
결합되지 않은 복합체를 제거하기 위해 다시 세척합니다.
과산화수소와 함께 발색 기질을 도입합니다. 과산화수소가 있는 경우 과산화효소 효소는 기질을 산화시켜 갈색 침전물을 형성합니다.
관심 영역을 포함하는 아크롤레인 고정 비인간 영장류 뇌의 50미크론 두께 절편을 PBS가 포함된 12웰 플레이트로 옮기는 것으로 시작합니다. 자유 부유 섹션을 실온에서 5분 동안 PBS에서 3회 세척합니다. 그런 다음 새로 준비된 수소화붕소나트륨 용액에서 실온에서 30분 동안 절편을 배양합니다. 덮개 없이 부드럽게 흔듭니다.
30분이 경과하면 수소화붕소나트륨을 흡인하고 각 웰에 PBS를 첨가합니다. 접시를 로커에 올려 놓고 10분 동안 세게 흔듭니다. 세척을 두 번 더 반복하거나 반응 가스가 남지 않을 때까지 반복합니다. 2% 정상 혈청과 0.5% 차가운 생선 젤라틴의 용액에서 배양하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 절편을 차단합니다.
배양 시간이 경과하면 실온에서 밤새 부드럽게 흔들면서 절편과 1차 항체 용액을 배양합니다. 다음날, 이전과 같이 절편을 세척한 후, 절편을 2차 항체 용액에 넣고 실온에서 1.5시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 이전과 같이 절편을 세척한 후, 아비딘 비오틴 과산화효소 또는 ABC 용액에서 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
다음으로, TBS에 희석된 0.05% 과산화수소와 함께 0.05% 3,3-디아미노벤지딘의 신선한 용액을 준비합니다. 세척 후, DAB 용액에서 절편을 부드럽게 흔들면서 3-7분 동안 배양합니다. 갈색 침전물이 원하는 색상으로 발달하면 차가운 TBS에서 빠르게 두 번 세척한 다음 일련의 시간 제한 TBS 및 PB 세척을 통해 반응을 중지합니다.