Name: Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 학습하세요 헤르페스바이러스 뉴클레오캡시드에서 고순도 바이러스 DNA를 분리하는 방법을. 초원심분리와 페놀-클로로폼 추출을 사용하여 감염 세포에서 바이러스 DNA를 정제하고, 고처리량 시퀀싱 및 형질전환에 적합한 고농도 DNA를 얻습니다.

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저자 그렉 스미스, 리사 Pomeranz, 매트 라이먼, Marlies 엘드리지, Halina Staniszewska Goraczniak하고, 조정이 프로토콜의 엔키 스트 연구실의 구성원의 기여에 감사드립니다.

1. 첫날 : 바이러스성 감염 및 버퍼의 작성 <ol><li> 감염에 대한 조직 배양 세포의 50-10 요리 (15cm 직경)를 준비, pseudorabies 바이러스 (PRV) 또는 헤르페스에 대한 베로 세포에 대한 예 : PK - 15 세포 (HSV) 바이러스를 단순. </li><li> 세포가 95 때 - 100 % 합류의 (뫄) 50-10에 그들을 감염. 이렇게하려면 강판 당 4 ML의 총 볼륨에서 바이러스 주식을 사용하여 각 접시를 예방하고 37에서 1 시간 동안 접시를 품어 ° C. 록 번호판 부드럽게 매 15 분 셀 monolayer은 바이러스에 의해 완전히 inoculum 코팅 유지할 수 있습니다. 한편, 다음 단계에 대한 매체를 따뜻하게. </li><li> 감염 한 시간 후, 접시에서 바이러스 inoculum을 대기음 따뜻한 중간 15 ML을 추가하고, 37 품어 ° C를 humidified 인큐베이터에 12~20시간하십시오. </li><li> LCM 버퍼 (표 1 참조)과 ° C 철저하게 믹싱을위한 4 박 바위를 준비합니다. (표 2 참조) 바이러스의 DNA resuspension에 대한 TNE를 준비합니다. </li></ol> 2. 둘째 날, 1 단계 : 세포 용해와 Ultracentrifugation <ol><li> 시각 그 세포의 감염이 균일한 cytopathic 효과 (CPE)를 발생했습니다 확인합니다. 모든 세포가 반올림지만, 접시에서 해제하지 않은까지 감염이 진행하도록 허용합니다. </li><li> 매체에 감염된 세포를 긁어, 50 ML 원뿔 튜브에 세포와 매체를 결합. .이 단계에 필요한 원뿔 튜브의 개수가 위의 단계 1.2 감염에 사용되는 요리의 개수에 따라 달라집니다, 예를 들어 한 50 ML 원뿔 튜브는 각 옵션 15 ML 매체 3 요리의 최대 펠렛하는 데 사용할 수 있습니다 린스 10 ML PBS와 번호판과 세포와 매체와 결합. </li><li> 원심 분리기 세포와 실온에서 2,000 상대 centifugal 힘 (RCF)에서 10 분 동안 매체는 다음 뜨는 기음과 PBS의 10 ML 각 펠렛을 resuspend. 한 바이러스 감염의 펠렛이 단계 2.2의 여러 원뿔 튜브에 퍼져 있었다면, 다음이 단계에 하나의 원뿔 관에 recombined 수 있습니다. 원심 분리와 열망을 반복 옵션 :.이 펠렛은 -20 ° C에서 보관 및 프로토콜은 나중에 계속있을 수 있습니다. </li></ol> 3. 둘째 날, 2 단계 : Ultracentrifugation 다음 단계 동안 세포 펠릿 가능한 얼음 LCM 버퍼 때마다 보관하십시오. <ol><li> 0 % 글리세롤로 β - 메르 캅 토 에탄올을 추가 - LCM 버퍼. 그것을 설정하여 초원 심 분리기 (아래 단계 3.9)을 냉각 시작 4 ° C와 진공 켜기. </li><li> 그것이 더 이상 clumpy 없을때까지 버퍼 LCM - 0 % 글리세롤 5 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend. 튜브 어떤 소화 되 다만 세포 펠렛을 해산시키기 위해 필요할 경우, 소용돌이. </li><li> 1.5 ML의 프레온 (1,1,2 - trichloro - 1 ,2,2 - trifluoroethane)을 추가하고 적극적으로 vortexing하여 압축을 풉니다. 즉시 4 ° C.의 온도에서 2000 RCF 10 분 원심 분리기 넓은 구멍 피펫 팁 (인터페이스를 피하)와 상위 레이어를 수집하고 새로운 튜브를 선택하기 위해 전송 :. 펠렛은 젤라틴 고체 경우, 신속하게 새로운 튜브로 가기 레이어를 부어 수 있습니다. </li><li> 프레온 추출을 반복하고 다시 원심 분리기. </li><li> 상단 레이어 (~ 5 ML)를 수집하고 새로운 polyallomer의 초원 심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. LCM 버퍼 - 남은 두 글리세롤로 β - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다. </li><li> LCM (중간 층), 그리고 45 % 글리세롤 2.5 ML로 다시 underlaying - - LCM (아래 층) 5 % 글리세롤 3 ML과 프레온 추출물 (상단 레이어)를 underlaying하여 polyallomer의 원심 관에 그라디언트를 준비합니다. 튜브 내용의 오버플로우를 방지하기 위해 얇은 피펫을 사용합니다. </li><li> 필요한 경우, LCM 버퍼의 동일한 비율을 사용하여 동등한 균형 튜브를 준비합니다. </li><li> 초원 심 분리기의 버킷으로 튜브를 전송합니다. 상단 레이어 (한 번에 ~ 50-100 μl)로 LCM 버퍼 - 부드럽게 추가 0 % 글리세롤을 추가하여, 서로의 0.1 g 이내에 양동이를 균형. </li><li> 수평 또는 스윙 버킷 회전자와 감기 초원 심 분리기를 사용하여 4 ° C.의 온도에서 77,000 RCF (SW41Ti의 로터 예 : 25,000 RPM)에서 1 시간 동안 균형 샘플을 스핀 </li><li> ultracentrifugation 동안 에탄올 침전 단계 (아래 4.6)에서 부동의 DNA를 캡처하는 유리 후크합니다. 유리 파스퇴르 pipet의 양쪽 끝을 잡고 불꽃을 통해 중간 부분을 일시 중지합니다. 유리의 섹션이 거의 용융되면, 유리 스트레칭 부드럽게 당겨 단단히 직각 갈고리 (&lt;90도)을 만들 수 부드럽게 구부하고 끝 봉쇄하기 위해 급격하게 당기십시오. 유리 후크의 일각이 열려 있으면 유리 그것을 가까운 정도로 녹아 있도록 불꽃 위에 팁을시오. </li><li> ultracentrifugation 후, 당신은 한 가운데에있는 어두운 장소와 얇은 불투명 펠렛 나타납니다. 조심스럽게 측면을 따라 drippings 등 관에서 액체를 대기음하지만 튜브 하단의 펠렛을 피하고. </li><li> 상온에서 0.5 ML의 TNE를 추가합니다. </li><li> 펠렛은 펠렛의 수화를 허용하도록 적어도 10 분 동안 앉아 보자. Optional : 4 보관하면 펠렛도 밤새 TNE에 resuspend 수 있습니다 ° C. </li></ol> 4. 제 일 : "유령"의 DNA 강수량 <ol><li> 작은 구멍 피펫 팁 (예 : p200 피펫 팁)로 pipetting하여 펠렛을 휴식. 바이러스 DNA가 아직도이 시점에서 capsids에 포함되어 있기 때문에,이 단계에서 전단 걱정하지 마십시오. capsids을 파괴하기 위해 상온에서 바이러스 펠렛을 포함한 튜브 다음 시약을 추가합니다 : <ul><li> 4.25 ML TNE </li><li> 0.25 ML 10% SDS </li><li> 이 MG Proteinase K </li></ul> 부드럽게 이러한 시약을 혼합하는 바위. 점성이 약간 증가가있을 것입니다. </li></ol> 에 여기에서 전단주의, 예를 들어 큰 구멍 pipettes를 사용하여 바이러스 물질에게 소용돌이하지 <ol start="2"><li> 페놀 - 클로로포름 5 ML를 추가하여 바이러스 단백질을 추출하고 즉시 유제를 유지하는 반전이나 vortexing 시작합니다. 10 초 동안 혼합 후, 실온에서 2000 RCF에서 5 분 동안 감광 유제를 원심 분리기. , 넓은 구멍 피펫 팁로 가기 레이어를 수집 인터페이스를 피하기 위해, 새로운 튜브로 전송 옵션 :.이 단계에서 사용 위상 잠금 젤 (PLG) 튜브 인터페이스에서 오염을 피할 수 있습니다. </li><li> 페놀 - 클로로포름 추출을 반복하고 다시 원심 분리기. </li><li> 두 번째 페놀 - 클로로포름 추출 후 30 ML 유리 Corex 튜브로 가기 레이어를 수집하고 10~15분위한 -20 ° C에서 튜브를 진정, 그것이 정지하지 않는주의한다. </li><li> 얼음처럼 차가운 에탄올 10 ML 추가 튜브 (맨 위에 Parafilm M의 부분을 스트레칭하여 예) 커버하고, 즉시 섞어 반전. 얇은 끈적끈적하는의 석출물로 구성되어 나타나는 DNA '유령'에 대해보세요. 부드럽게 더 섞어 쓰는 DNA 함께 클러스터 precipitates 원인 튜브를 반전. </li><li> DNA의 유령 (들)을 캡처하는 유리 후크를 사용합니다. 조심스럽게 초과 액체를 제거하기 위해 DNA를 얼룩 후, 1.5 ML 튜브에 후크를 (아래 팁) 장소 및 건조 수 있습니다. 0.25 추가 - TE 0.5 ML를 DNA의 유령을 해산합니다. 적어도 한 시간 동안 진행하는 DNA의 resuspension을 허용합니다. 4 스토어 DNA ° C. 옵션 : 1.5 ML 튜브에 유리 후크를 끊다, DNA의 수율을 최대화하려면, 유리 파편 떨어져 있도록 resuspension 시간이 지남에 계속할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 뫄 충분히 높은 통해 세포는 야생 형 PRV의 변종에 대한 ~ 18 시간 이후 감염 (hpi) 내에서 전체 CPE를 달성해야하고, 야생 형 HSV - 1 계통 (그림 1) ~ 24 hpi. 일단 감염된 세포 펠렛을 수확이고, 나머지 프로토콜 단계를 하나의 긴 하루 만에 완벽하게 하루나 이틀 (그림 2)을 통해 수행하실 수 있습니다. DNA의 귀신을 캡처하는 유리 후크를 준비하면 나중에 그것이 1.5 ML 튜브의 기초 (그림 3)에 맞게 수 있도록 후크 각도가 90도 미만이어야 수 있도록하는 것이 중요합니다. 이 후크의 팁을 밀폐하면 pipet 내부 DNA 손실을 방지할 수 있습니다. DNA의 유령은 침전 단계 중에 양식과 흰색, 끈적끈적하는 쓰레드 (그림 4)로 표시됩니다. 서로 및 / 또는 DNA를 캡처하는 데 사용되는 유리 후크 이러한 집계 및 막대기. 따라서 동일한 유리 후크는 강수량 솔루션 내에서 DNA의 여러 스레드를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 원하는 볼륨에 따라 열을 선택 : </td><td> 10 ML </td><td> 15 ML </td><td> 20 ML </td><td> 40 ML </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1.3 ML </td><td> 1.9 ML </td><td> 2.5 ML </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 1M 트리스 (산도 7.4) </td><td> 300 μl </td><td> 450 μl </td><td> 600 μl </td><td> 1.2 ML </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 μl </td><td> 75 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> 0.5 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 10 μl </td><td> 15 μl </td><td> 20 μl </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 μl </td><td> 75 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 (사용하기 전에 바로 추가) </td><td> 4.3 μl </td><td> 6.5 μl </td><td> 8.6 μl </td><td> 17.2 μl </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> 원하는 퍼센트 글리세롤 (0, 5, 또는 45 %)에 대한 비율을 사용 </td></tr><tr><td> 0 % 글리세롤 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 8.3 ML </td><td> 12.5 ML </td><td> 16.7 ML </td><td> 33.4 ML </td></tr><tr><td> 5 % 글리세롤 </td><td> 0.5 ML </td><td> 0.8 ML </td><td> 1.0 ML </td><td> 2.0 ML </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 7.8 ML </td><td> 11.7 ML </td><td> 15.7 ML </td><td> 31.4 ML </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4.5 ML </td><td> 6.8 ML </td><td> 9.0 ML </td><td> 18.0 ML </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 3.8 ML </td><td> 5.7 ML </td><td> 7.7 ML </td><td> 15.4 ML </td></tr></tbody></table> 표 1. LCM 버퍼의 준비를위한 조리법 <table border="1"><tbody><tr><td> 50 ML 량 </td></tr><tr><td> 5 ML 1M NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 ML 1M 트리스, 산도 7.5 </td></tr><tr><td> 1 ML 0.5 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr><tr><td> 41.5 ML H 2 O </td></tr></tbody></table> 표 2. TNE (; 50 MM 트리스, 산도 7.5, 10 MM 0.1 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) NaCl)의 준비 <table border="1"><tbody><tr><td> 1 L 부피에 대한 </td></tr><tr><td> 0.2 g KCl </td></tr><tr><td> 0.2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8g NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g 나 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1L로 H 2 O </td></tr></tbody></table> 표 3. PBS (; 1.5 MM KH 2 PO 4; 137 MM NaCl, 8.1 MM 2 HPO 4 나, 산도 7.0 2.7 MM KCl)의 준비 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. PK15 세포 감염 (A) 이전, 감염의 높은 다중성 후 (B) 미드웨이 감염을 통해, 그리고 (C) cytopathic 효과 (CPE)에서. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 프로토콜의 개요. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 유리 세 대표 사례는 바이러스 DNA의 유령을 수집하는 데 사용 후크. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 잘 구성된 풍부한 DNA "귀신"의 대표적인 예라고 할 수 있습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜의 일부는 원래 BSL4 조건에서 바이러스성 DNA의 격리를 위해 개발하지만, 그것은 비 - BSL 조건에 동등하게 잘 적응했다. 4 우리는 일반적으로 DNA의 genomes를 가지고있는 알파 - herpesviruses PRV과 HSV - 1에서 DNA를 분리하려면이 프로토콜을 사용 capsid와 지질 봉투에 둘러싸인 proteinaceous로 묶여. 7,8 그러나 포함 베타 및 감마 - herpesviruses과 adenoviruses, 가능성이 다른 큰 DNA 바이러스에 직접 적용할 수 있습니다. 비슷한 extractions는 일반적으로뿐만 아니라 RNA 바이러스에 사용됩니다 9. 포함되어있는 정화의 다양한 방법에서이 DNA 준비 가능성이 결과의 견고. 초기 프레온 extractions 변성의 지질 점막, 세포 구성 요소를 분리하고 또한 지질 봉투 및 herpesvirus의 capsids를 둘러싼 바깥...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 프레온 (1,1,2 - trichloro - 1 ,2,2 - trifluoroethane) </td><td> 어부 </td><td> T178 - 4 </td><td> 의 적절한 폐기에 대한 지침 프레온 함유 폐기물에 대한 기관에 확인하거나, 멘데즈 외를 참조하십시오. 잠재 프레온 대안. 9 </td></tr><tr><td> 위상 잠금 겔 튜브, 헤비 15ml 용량 </td><td> 5 PRIME </td><td> 2,302,850 </td><td> 옵션 </td></tr><tr><td> Polyallomer의 초원 심 분리기 튜브 </td><td> 베크맨 * </td><td> 331,372 * </td><td> 자신의 초원 심 분리기에 적합 * 선택 튜브는, 이들은 한 예로 포함됩니다 </td></tr><tr><td> NP - 40 / IGEPAL </td><td> 시그마 </td><td> I - 3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK - 15 세포 </td><td> ATCC </td><td> CCL - 33 </td><td></td></tr><tr><td> 베로 세포 </td><td> ATCC </td><td> CCL - 81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

nucleocapsids에서 바이러스성 dna의 준비

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

바이러스는 세포 의무 기생충이며, 따라서 그들의 DNA의 연구는 거리 숙주 세포 오염 물질과 DNA에서 바이러스 물질을 격리가 필요합니다. 여러 다운 스트림 응용 프로그램이 프로토콜에 의해 제공됩니다 순수 바이러스 DNA의 다량을 필요로합니다. 이러한 응용 프로그램은 바이러스성 게놈 호스트 DNA의 제거 바이러스는 시퀀스에 대한 데이터 출력을 최적화하는 데있어 매우 중요합니다 시퀀싱, 그리고 새로운 바이러스 재조합 종자의 생산, 플라스미드 및 선형 바이러스 DNA가 재조합을 용이하게 정화의 공동 transfection. 1,2를 포함 3 이 절차는 extractions와 감염된 세포에서 선형 herpesvirus nucleocapsid DNA를 정제 분리 밀도 기반 원심 분리의 조합을 활용합니다. 4,5 초기 정화 단계 extractions 및 원심 분리 단계 동안 바이러스 DNA를 포함하고 보호하는, 정화 바이러스 capsids을 분리하는 것을 목표로 세포 단백질과 DNA를 제거하는 것이. nucleocapsids의 용해 다음 바이러스 DNA를 출시, 두 최종 페놀 - 클로로포름 단계는 남아있는 단백질을 제거합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 1.90의 평균 OD 280분의 260과 고농도 순수합니다. 사용 감염된 세포, 150-800 μg 이상에서 바이러스성 DNA 범위의 수율의 수량에 따라 다릅니다. 이 DNA의 순도는 4C에서 장기 보관 동안 안정합니다. 이 DNA는 따라서 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응 및 transfections에 적합합니다. 이전 프로토콜을 처음으로, 그것은 요리 당 세포 (예 합류 15cm 접시에 8 X 10 6 PK - 15 세포의 평균) 및 바이러스 주식의 titer를 사용하는 (의 평균 숫자를 아는 것이 중요합니다 ML 당 예 : 1 X 10 8 플라크 형성 단위 -). 이들은 프로토콜에 대한 감염의 적절한 다중성을 (뫄) 계산이 필요합니다. 예를 들어 6, 뫄 5시 위 바이러스 주식과 PK - 15 세포 중 하나 15cm 접시를 감염시킬, 당신은 400 μl를 사용하는 것입니다 매체의 3.6 ML (한 15cm 플레이트 4 ML 총 접종 볼륨)로 바이러스 주식을 희석. 여러 바이러스성 DNA의 준비가 동시에 준비하실 수 있습니다. 동시 준비의 개수는 초원 심 분리기의 회전자에 의해 개최 튜브의 숫자로 제한됩니다 (바이러스 당 하나, 아래 단계 3.9 참조). 여기 한 바이러스에 완료되는 것처럼 절차를 설명합니다.

우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

바이러스는 절대 세포 내 기생체이므로, 바이러스 DNA를 연구하려면 숙주 세포의 오염 물질 및 DNA로부터 바이러스 물질을 분리해야 합니다. ...

본 영상에서는 감염된 세포로부터 고순도의 바이러스 뉴클레오캡시드 DNA를 분리하는 절차를 보여줍니다. 먼저, 이중 동결-해동 추출법을 사용하여 지질막을 변성시킵니다. 그 후, 시료를 초원심분리하여 바이러스 뉴클레오캡시드를 펠렛화하고, 상대적으로 가벼운 세포 및 바이러스 구성 성분으로부터 분리합니다.침전된 뉴클레오캡시드에서 바이러스 DNA를 방출시키기 위해 세제와 proteinase K를 첨가합니다. 그런 다음, 잔류 단백질을 모두 제거하기 위해 페놀-클로로포름 추출을 두 번 수행합니다. 마지막으로, 용액 내의 바이러스 DNA를 침전시킵니다.궁극적으로, 결과는 감염된 세포로부터 고농도의 순수한 바이러스 DNA가 분리되었음을 보여줍니다. 유리 DNA 추출이나 초원심분리를 포함하지 않는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 여기서 생성된 바이러스 DNA의 숙주 DNA 오염 수준이 매우 낮아 PCR 및 바이러스 게놈의 딥 시퀀싱과 같은 후속 공정에 이상적이라는 점입니다. 저희는 추가적인 예방 조치가 매우 중요했던 재조합 DNA 연구 초기 단계에서 이 방법을 처음으로 사용하였습니다.본 절차는 BSL 4 조건의 글로브 박스 내에서 바이러스 DNA를 분리하기 위해 개발되었습니다. 구배 형성 및 DNA 고스팅 단계는 습득하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 구배 층을 쌓을 때 매우 정교한 손놀림이 필요하며, 용액 내에 침전되는 DNA 고스트는 이전에 발견해 본 경험이 없다면 식별하기 어려울 수 있기 때문입니다.감염을 위해 지름 15 cm의 조직 배양 세포 디쉬를 5~10개 준비하여 이 절차를 시작합니다. 여기서는 PK 15 세포가 95~100% confluency에 도달했을 때 가성광견병 바이러스(pseudo rabies virus) 감염을 위해 준비하며, 배지를 바이러스가 포함된 배지 4 mL로 교체합니다. MOI 5~10에서, 습도가 유지되는 37 °C, 5% CO2 인큐베이터 내에서 15분마다 플레이트를 1시간 동안 배양합니다.세포 단층이 바이러스 접종액으로 완전히 덮여 있도록 플레이트를 부드럽게 흔들어 줍니다. 배양하는 동안 다음 단계에 사용할 배지를 가온합니다. 감염 후 1시간이 지나면 플레이트에서 바이러스 접종액을 흡입하여 제거합니다.그런 다음 15 milliliters의 따뜻한 배지를 추가하고 가습 배양기에서 37 degrees Celsius로 12~20시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 다음 날 실험을 준비하기 위해 신선한 LCM 및 TNE 버퍼를 제조합니다. NP 40을 추가하면 acquis 용액에 리본 모양의 침전물이 형성될 수 있음에 유의하십시오.준비된 용액을 4°C의 로커(rocker) 위에 올려두고 하룻밤 동안 반응시킵니다. 다음 날이 되면 용액들이 완전히 통합될 것입니다. 그 후, 디쉬를 복합 현미경의 스테이지 위에 올리고 세포 감염으로 인해 균일한 세포병변효과(cytopathic effect)가 나타났는지 시각적으로 확인합니다.모든 세포는 둥글게 변해야 하지만, 플레이트에서 떨어져서는 안 됩니다. 세포가 아직 둥글게 변하지 않았다면, 세포병성 효과가 관찰될 때까지 배양을 계속하십시오. 다음으로, 감염된 세포를 긁어 배지 속으로 모으고, 수득률을 높이기 위해 배지에 섞인 세포들을 50 milliliter 원추형 튜브에 합칩니다.플레이트를 10 milliliters PBS로 헹구고 배지 속의 세포와 합친 다음, 상온에서 2000 RCF로 10분 동안 세포와 배지를 원심분리하여 남아 있는 배지와 혈청을 제거합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 10 milliliters PBS에 재부유시킵니다. 원심분리와 흡입 과정을 반복합니다. 실험을 당일에 계속 진행하지 않을 경우, 이 섹션에 설명된 단계에 사용할 때까지 펠렛을 minus 20 degrees Celsius에서 보관하십시오.세포 펠렛과 LCM 버퍼는 가능한 한 항상 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다. 0% glycerol LCM 버퍼에 Beamer capto ethanol을 첨가하여 Beamer capto ethanol의 최종 농도가 0.043%가 되도록 하여 초원심분리 준비를 합니다. 또한 초원심분리기를 4°C로 설정하고, 기기가 냉각되는 동안 진공 상태로 설정하여 준비합니다. 0.043% Beamer capto ethanol이 포함된 0% glycerol LCM 버퍼 5 mL를 세포 펠렛에 넣고 피펫팅하여 펠렛을 재현탁합니다.필요한 경우 모든 덩어리를 확실히 풀어주십시오. 튜브를 볼텍싱하여 녹지 않은 세포 펠릿을 분쇄합니다. 다음으로 세포 및 바이러스 막을 추출하기 위해 1.5 milliliters를 첨가합니다.즉시 격렬하게 볼텍싱합니다. 4°C에서 2000 RCF로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 두 개의 층이 형성됩니다.상층의 수용액 층에는 바이러스 핵, 캡시드 및 단백질이 포함되어 있으며, 하층의 Freon 층에는 바이러스 및 세포막이 포함되어 있습니다. 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 계면을 피해 상층을 수집하고 새로운 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. Freon 층에 닿지 않도록 하여 해당 유기 용매가 새 튜브의 수용액 층으로 혼입되지 않게 하는 것이 중요합니다.원심분리 후 Freon 추출을 반복하기 위해 이전과 같이 freon을 추가하고 볼텍싱합니다. 상층액 약 5 mL를 수집하여 새로운 폴리머 초원심분리 튜브로 옮깁니다. 나머지 두 개의 glycerol LCM 버퍼에 beamr capto ethanol을 0.043%까지 추가합니다.다음으로, 폴리머 원심분리 튜브에 밀도 구배를 형성하기 위해, 얇은 피펫을 사용하여 Freon 추출물 아래에 5% glycerol LCM 3 mL를 층으로 쌓습니다. 그 후, 그 아래에 45% glycerol LCM 2.5 mL를 층으로 쌓습니다. 또한, 필요한 경우 동일한 비율의 LCM 버퍼를 사용하여 동일한 무게의 밸런스 튜브를 준비합니다.튜브를 초원심분리기 버킷에 넣고, 상층액에 0% glycerol LCM 버퍼를 한 번에 50~100 µL씩 조심스럽게 추가하여 각 튜브의 무게 차이가 0.1 g 이내가 되도록 균형을 맞춥니다. 균형이 잡힌 시료를 4 °C에서 77,000 RCF로 1시간 동안 초원심분리합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 갈고리 모양을 만들어 에탄올 침전 단계에서 부유하는 DNA를 포집합니다.피펫의 양 끝을 잡고 중간 부분을 화염 위에 띄웁니다. 유리 부분이 가열되면 천천히 잡아당겨 유리를 늘립니다. 이를 조심스럽게 구부려 90도 미만의 좁은 각도를 가진 후크 모양을 만든 후, 빠르게 잡아당겨 끝부분을 밀봉합니다.유리 갈고리의 끝이 열려 있다면, 유리가 충분히 녹아 닫힐 때까지 끝부분을 불꽃 위에 유지하십시오. 초원심분리 후에는 중앙에 어두운 점이 있는 얇고 불투명한 펠릿이 형성되며, 여기에 바이러스 핵캡시드가 포함되어 있습니다. 튜브 벽면을 따라 흐르는 액체를 포함하여 튜브 내의 액체를 조심스럽게 흡입하되, 튜브 바닥의 펠릿은 건드리지 않도록 주의하십시오.실온에서 TNE 0.5 milliliters를 첨가합니다. 펠렛이 충분히 수화될 수 있도록 최소 10분 동안 그대로 둡니다. 다음 날까지 실험을 계속하지 않을 경우, 재현탁된 펠렛을 4 degrees Celsius에 보관하십시오.P 200 팁을 사용하여 하이드레이션된 펠렛을 피펫팅하여 풀어줍니다. 이 단계에서는 바이러스 DNA가 여전히 캡시드에 포함되어 있으므로 전단 응력(shearing)에 대해 걱정하지 않아도 됩니다. 캡시드를 파쇄하기 위해 바이러스 펠렛에 TNE 4.25 milliliters, 10% SDS 0.25 milliliters 및 protein EK 2 milligrams를 상온에서 첨가합니다.부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 이 시약들을 혼합하십시오. 캡시드가 파괴되었으므로 이제 점도가 약간 증가했을 것입니다. DNA 전단(shearing)을 방지하기 위해 주의해야 하며, 와이드 보어(wide boar) 피펫을 사용하고 바이러스 단백질을 추출하기 위해 바이러스 물질을 볼텍싱(vortex)하지 마십시오.샘플을 phase lock gel 튜브로 옮기고 5 mL의 phenol chloroform을 첨가합니다. 즉시 튜브를 뒤집어 10초 이상 혼합하여 에멀젼 상태를 유지합니다. 그 다음, 실온에서 2000 RCF로 5분 동안 에멀젼을 원심분리합니다.원심분리 후, 상층액을 취해 새로운 phase lock gel 튜브로 옮깁니다. 페놀-클로로포름 추출을 반복하고, 두 번째 페놀-클로로포름 추출 후 다시 원심분리합니다. 상층액을 30 milliliter 유리 coex 튜브에 수집하고, 해당 튜브를 -20 °C에서 10~15분 동안 냉각시킵니다.얼지 않도록 주의하십시오. 10 milliliters의 차가운 에탄올을 장치에 넣으십시오. 튜브의 뚜껑을 닫고 뒤집어서 섞어줍니다.얇은 끈 형태의 침전물인 DNA 고스트(DNA ghost)가 나타나는지 즉시 확인하십시오. 튜브를 부드럽게 뒤집어 더 혼합함으로써 끈적이는 DNA 침전물들이 서로 뭉치게 합니다. 마지막으로, 유리 갈고리를 사용하여 DNA 고스트를 조심스럽게 끄집어낸 후, Kimwipe로 가볍게 두드려 과잉 액체를 제거함으로써 DNA를 블롯팅하십시오.그 다음, 훅 팁을 1.5 milliliter 튜브에 넣으십시오. DNA 수율을 극대화하려면 유리 훅을 1.5 milliliter 튜브 안에서 부러뜨려, 시간이 지남에 따라 유리 파편으로부터 재현탁이 계속될 수 있도록 합니다. 건조시킨 후 0.25 to 0.5 milliliters의 TE를 추가하여 DNA ghost를 용해하십시오.DNA의 재현탁이 최소 1시간 동안 진행되도록 하고, DNA를 4°C에서 보관하십시오. 바이러스 DNA는 이 비디오 논문에 설명된 대로 뉴클레오캡시드로부터 준비되었습니다. 여기 보이는 것은 용액 내에 침전된 선형 바이러스 게놈 DNA로 구성되어 잘 형성되고 풍부한 DNA ghost의 대표적인 예시입니다. 가닥들이 서로 뭉쳐 있으므로, Acquia 용액에 넣은 후 재수화될 때까지 시간이 필요합니다. PRV 균주 Becker Bartha 및 추가 4개 균주로부터 준비한 바이러스 DNA를 0.5% agros 겔에서 1시간 동안 전기영동하고 에티듐 브로마이드로 염색하였습니다.각 PRV 샘플에는 총 부피 250 µL의 바이러스 DNA 뉴클레오캡시드 조제물 1 µL가 사용되었으며, 이는 왼쪽에 표시되어 있습니다. lambda 박테리오파지 DNA 사다리는 제한효소로 절단되지 않은 lambda DNA의 큰 크기(48.5 kb)와 PRV 게놈 DNA의 크기(약 140 kb)를 보여줍니다.다음으로, 알려진 양의 Lambda DNA 희석 시리즈를 통해 오른쪽의 PRV 샘플 농도가 50에서 200 ng/µL 사이이며, 바이러스 DNA 분리물당 총 수율은 12에서 50 µg임을 확인합니다. 네 가지 PRV 균주로부터 준비한 바이러스 DNA 샘플을 BAM H1 또는 Kpn1으로 하룻밤 동안 제한효소 처리하였습니다. 제한효소로 분해된 DNA 샘플은 0.8% agarose 겔에서 하룻밤 동안 전기영동으로 분리한 후 ethidium bromide로 염색하였습니다.H 1 레인에는 8 µg의 바이러스 뉴클레오캡시드 DNA가 포함되며, KPN 1 레인에는 4 µg의 바이러스 DNA가 포함됩니다. 서로 다른 각 PRV 균주는 각각의 제한효소 절편 길이 다형성 패턴에 의해 구별될 수 있습니다. 이 절차 이후, 바이러스 게놈 함량에 대한 데이터를 얻기 위해 딥 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 바이러스학 분야의 연구자들이 제한효소 절편 길이 다형성(RFLPs), 서던 블로팅, 재조합 클로닝, DNA 바이러스 구축, 그리고 헤르페스 바이러스 및 기타 유형의 바이러스에 대한 기타 조작을 통해 바이러스 DNA의 특성을 규명할 수 있는 길을 열어주었습니다.fon을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 흄 후드 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 펠렛 형성 후, fon 층은 젤 형태의 반고체에서 액체로 빠르게 변할 수 있으므로, 수성 상층액을 수집하는 데 있어 따르기 또는 피펫팅 중 어떤 방법이 최선인지 결정하기 전에 각 튜브를 개별적으로 평가해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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