Name: 의 형태학의 스케일링 관계를 추정 바디 크기의 실험 조작 Drosophila /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 배우세요 Drosophila에서 영양 조작을 통한 형태학적 스케일링 관계 측정 방법을. 이 실험은 체형 크기 변화를 유도하여 날개 크기와의 스케일링 관계를 분석하고 진화생물학적 특성 발현을 이해하는 데 활용됩니다.

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본 연구에서 설명하는 연구가 WAF에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 (DEB - 0805818)에 의해 지원 되었음 : AWS와 ID는이 연구는 또한 AWS와 ID 및 IOS - 0920720로하는 AWS, IOS - 0919855로 보조금 IOS - 0845847에 의해 지원되었다 WAF

1. 신체 크기와 날개의 크기에 변화를 생산하기 위해 양육과 다이어트의 조작 합리적이고 개요. 최종 장기 및 신체 크기의 변화를 생산 개발 규제 프로세스에 스케일링 궁극적으로 관계 경첩의 표현. 이러한 프로세스는 최고의 같은 D.으로 (즉, holometabolous) 완전히 metamorphic 곤충에 회사에서 설명하는 장기 유충 11,15-17 같은 GRUB 내에 undifferentiated 'imaginal 디스크를'성장 melanogaster. Drosophila에서 최종 장기 및 신체 크기는 애벌레 단계 동안 성장에 의해 규제되며 그들이 세 번째 애벌레 instar 18 시작으로 eclosion에 대한 최소한의 가능한 중량 (MVW E)를 도달할 때까지 애벌레는 첫 번째와 두 번째 애벌레 instar을 통해 성장합니다. MVW E의 달성 전 기아 성인 eclosion을 방지합니다. 그러나, MVW E에 굶주려 아르 애벌레는 아주 작은 크기에 불구하고, 현실적인 어른을 생성합니다. 이 때문에 개발하는 동안 영양을 감소가 아니라 파리에 있지만 거의 모든 동물 19-21에서 최종 신체 장기의 크기를 줄일 수 있습니다. MVW E 후에 음식 가용성을 조종하여이 달성했지만 pupation가 발생하기 전에, 그것은 크게 변화의 다른 소스를 (예를 들어, 각각의 유전자 변형) 능가 신체 크기의 극한 phenotypic 소성을 유발 할 수 있습니다. <ol><li> 계란은 50 많이 나누어 phenotyped 수 인구의 수집 및 표준 비행 음식 10ml가 들어있는 튜브에 배치됩니다. 산란이 지속적으로 발생하기 때문에, 계란 세 나이 동료를 생산, 사흘 동안 매일 24 시간을 수집하고 있습니다. </li><li> 가장 오래된 일대가 방황하는 단계에 도달하거나 번데기가되다 시작되면, 다이어트 조작이 적용됩니다. 이 시점에서 가장 오래된 일대가 잘 MVW 전자 넘어이며, 막내 일대는 매우 MVW 전자에 인접해 있고 나머지 일대 어딘가에 이런 극단 사이에있다. 따라서이 시점에서 음식의 제거는 가장 오래된 일대에서 남은 일대에서 가장 젊은 일대와 중간 크기의 성인에서 매우 작은 어른 매우 큰 어른을 생산합니다. 40 % 자당 솔루션의 약 5ml 튜브에서 애벌레를 제거하려면 것은 모든 튜브에 추가됩니다. 애벌레를 무료로하려면, 음식은 중간 속도로 설정 흔드는 테이블에서 15~20분에 대한 흥분이다. </li><li> 부동 유충은 좋은 (00) 붓을 함께 자당 솔루션, 젖은 솜 플러그를 포함하는 튜브에 배치하고 번데기가되다 수에서 제거됩니다. 또는 유충이 같은 메틸 셀룰로오스 22로 비 소화 식품 첨가물에 배치 수 있습니다. </li></ol> 2. 신체 크기의 추정 합리적이고 개요. 이전 연구는 흉부의 길이가 전체 몸 크기가 22 이상 프록시보다 적은 것으로 나타났습니다. 대신, 우리는 신체 크기의 조치로 pupal 크기를 사용합니다. 최대 몸 크기는 pupation을 앞에 먹이의 정지에 고정됩니다. 그 결과, pupal 크기 및 성인 몸 크기 23 사이의 긴밀한 상관 관계가 있습니다. <ol><li> Pupae 유리 현미경 슬라이드에 복부 측면을 정렬하고 해부 현미경에 부착된 디지털 카메라를 사용하여 몇 군데 있습니다. 각각의 이미지는 촬영된 고유 식별 코드를 할당하고 컴퓨터에 디지털 카메라를 연결하는 생중계를 통해 컴퓨터에 전송됩니다. </li><li> 몇 군데 pupae 그 개인의 고유 코드를 표시 비행 음식 1ml를 포함하는 각각의 두 ML의 epitubes, 이동, 가스 교환을 허용하도록 airholes와 구멍이 있습니다. </li><li> Pupal 크기는 pupal 실루엣의 픽셀의 숫자로 추정된다. 기타 크기는 통계도 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 특성 (날개) 크기 추정 합리적이고 개요. 이미지 날개하기 위해, 우리는 '날개 그래버'24, 검문과 몸 살고 anesthetized 비행 직각의 날개를 보유하고있는을 사용합니다. 유리의 두 조각 사이에 누르면, 이것은 날개가 2 차원 개체로 몇 군데 수 있습니다. <ol><li> 파리는 CO 2로 가볍게 anesthetized하고 컴퓨터에 연결된 디지털 카메라가 장착되어 해부 현미경에 날개 그래버의 위치에 배치. </li><li> 날개는 개별의 고유 코드를 아래에 몇 군데와 저장됩니다. </li><li> 날개 크기는 날개 실루엣의 픽셀 개수 또는 한계 고정 명소를 circumscribes 최소 볼록 다각형을 사용하여 추정 수 있습니다. </li></ol> 4. 스케일링 관계 추정 <ol><li> 데이터는 동료를 통해 풀링하지만, 성별로 구분하고 로그 변환됩니다. </li><li> 스케일링 관계는 타입 II (즉, 감소 주요 축) 회귀 (12 리뷰를 참조) 각 그룹에 대한 예상 매개 변수를 사용하여 크기 데이터에 적합하고 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 십t "&gt; 우리의 다이어트 조작은 본체 크기 (그림 1)과 특성 크기 (그림 2)의 광범위한 생산됩니다. 서로에 대한 로그 변환 특성을 비행하는 것은 주어진 생물 학적 그룹 내에서 covariation 자신의 패턴을 공개하고 스케일링 관계를 피팅 허용 그룹 (그림 3) 설명 스케일링 관계 매개 변수. 추출하는 방법을 신체의 크기와 모양의 비늘이 그룹 전체 크기가 어떻게 형상 covaries의 비교를하실 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg"> 그림 1. 번데기 다이어트 조작을 통해 생산의 크기 분포의 극단에서 개인 MVW 전자를 달성 후. 실제 pupal 이미지는 오른쪽에 pupal 크기의 측정을 위해 해당 실루엣과 함께 왼쪽에 표시됩니다. 스케일 바 1mm입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg"> 개인 MVW 전자를 달성 후 그림 2. 날개가 다이어트 조작을 통해 생산 본문 크기 분포의 극단에서 가져온. 실제 날개 이미지는 오른쪽에 표시 날개의 크기 측정을 위해 해당 실루엣과 함께 왼쪽에 표시됩니다. 스케일 바 1mm입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg"> 그림 3. Drosophila melanogaster 섹스에 대한 윙 - 바디 크기 조절. 애벌레로 한 (회색 원) 하루나 이틀 (오픈 원)을 굶주린 완벽하게 공급 (어두운 원) 였는데 각 성별의 개인 로그인 변환 데이터입니다. 타입 II의 회귀 선은 각 섹스에 표시됩니다. 각 연령 일대 사이의 평균 날개 면적 감소 ~ 0.1mm (~ 7 %)와 ~ 0.2mm (~ 8 %), 발생 관찰 phenotypes의 전체 범위를 증가. regressions는 수컷 (경사면 1.06) 약간 hyperallometric 반면 여성이 스케일링 관계 (0.96의 기울기)에 대한 약간 hypoallometric있는 것으로 밝혀.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

형태학의 스케일링은 거의 세기 진화 생물학 강렬한 연구의 대상이되고있다. 최근 성장과 확장의 규정에 인접한 기초 개발, 생리 및 유전학 (예 : 12,15,23-25의 리뷰를 참조) 점차 중요 해지고있다. 우리의 방법은 특성과 신체 크기의 전체 범위에 걸쳐 형태학의 스케일링 관계의 추정을 수 있습니다. 특징 크기가 본문 크기 (예 : 13,14)와 선형 규모하지 않을 수 있듯이, 중요합니다. 동물에만 이상적인 실험실 조건 하에서 reared하는 경우 그러나, 이것은 명백한되지 않을 수 있습니다. 우리 프로토콜은 Drosophila의 날개 - 바디 크기 조절 관계의 추정을 허용하도록 명시적으로 개발되었지만, 그것은 파리에있는 형태학의 특성에 대한 스케일링 관계를 추정 특성 특정 수정과 함께 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 다이어트 조작 가능성이 다른 완전히 metamorphic 곤충의 특성과 신체 크기의 전체 범위를 생산하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 응용 프로그램은 단순히 MVW 전자가 달성되었을 때 알고 있으며 ontogeny에 그 시점에서 조작을 적용합니다.

의 형태학의 스케일링 관계를 추정 바디 크기의 실험 조작 drosophila</em

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

신체 부위의 스케일링은 동물 형태 1-7의 중심 기능입니다. 종 이내, 형태학의 특성이 제대로 작동하려면 유기체를위한 몸 비율이해야 할, 큰 개인은 일반적으로 큰 신체 부품과 작은 개인 일반적으로 작은 신체 부위가 있고, 그러한 것이 전반적인 몸 모양은 성인 몸 크기의 범위에 걸쳐 유지됩니다. 정확한 비율에 대한 요구 사항은 종 내의 개인은 보통 상대적인 특징의 크기에 낮은 변동을 전시 것을 의미합니다. 반대로, 상대적인 특성 크기 종 사이 크게 다를 수 있으며 형태학의 다양성을 생산하는 기본 메커니즘입니다 수 있습니다. 비교 작업을 한 세기 이상이 내부 및 이종 간의 패턴 3,4를 설립했다. 아마도 이런 변화를 설명하기 위해 가장 널리 사용되는 방법은 allometric 방정식을 사용하여 두 형태학의 특성의 크기 사이의 스케일링 관계를 계산하는 것입니다 Y = bxα, x와 y가 같은 장기 및 신체 크기 8로 두 특성의 크기가 어디 9. 모두 크기가 다양으로이 방정식은 두 특성 사이의 시간 - 그룹 (예, 종, 인구) 확장 관계를 설명합니다. 이 방정식 로그인 변화가 간단한 선형 방정식을 생성, 로그 (Y) = 로그 (B) + αlog (X)와 같은 종류의 개인 사이에 서로 다른 특성의 크기의 로그 - 로그 플롯은 일반적으로 도청과 선형 스케일링을 공개 로그 (B)와 α의 경사의 &#39;allometric 계수&#39;9,10했다. 그룹 간의 형태학의 변화는 주어진 특징 쌍을위한 확장 관계 교차 또는 경사면의 차이에 의해 설명되어 있습니다. 따라서, allometric 방정식 (B와 α)의 매개 변수의 변화는 우아하게 (11,12 참조) 이내 및 생물 학적 그룹 간의 장기 및 신체 크기의 관계에서 캡처된 형태 변화에 대해 설명합니다. 모든 특성들이 서로 혹은 따라서 신체의 크기 (예 : 13,14)와 선형 규모 아니라, 형태학의 확장 관계는 데이터가 특성 크기의 전체 범위에서 촬영한 때 가장 유익한 있습니다. 여기 우리는 다이어트의 간단한 실험 조작이 곤충의 몸 크기의 전체 범위를 생산하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이것은 크기와 생물 학적 집단 간의 스케일링 관계 매개 변수의 강력한 비교 형상 covaries하는 방법의 전체 설명을하므로 특성의 주어진 쌍을위한 전체 배율 관계의 평가를 허용합니다. 우리가 Drosophila에 초점 있지만, 우리의 방법론은 거의 모든 완전히 metamorphic 곤충에 해당한다.

형태학의 스케일링 관계는 캡처 organismal 모양을 설명합니다. 우리는 완전히 metamorphic 곤충의 몸 크기의 자연 범위에 걸쳐 형태학의 스케일링 관계를 측정하는 방법을 제시한다. 우리는 모양과 크기가 공동 다양 어떻게 정확한 설명을 허용, 특성 크기의 분포를 증가하는 간단한 다이어트 조작을 사용합니다.

의 형태학의 스케일링 관계를 추정 바디 크기의 실험 조작 Drosophila</em

신체 부위의 스케일링은 동물 형태학의 핵심적인 특징입니다1-7. 종 내에서 형태적 특성은 신체와 적절한 비율을 이루어야 하며...

다음 실험의 전반적인 목표는 발달 단계에 맞춘 먹이 가용성 조절을 통해 신체 크기의 넓은 범위를 생성하고, 이를 통해 형태적 특성 간의 스케일링 관계를 추정하는 것입니다. 먼저, 3일에 걸쳐 동일한 초파리 집단에서 알을 수집하여 세 개의 연령 코호트를 생성합니다. 가장 오래된 코호트의 유충이 팻팅(pate)을 시작하면, 모든 코호트의 유충을 먹이에서 제거합니다.이러한 식이 조절의 결과로 번데기의 크기 변이 범위가 확장됩니다. 다음으로, 모든 개체의 번데기와 성충 날개 이미지를 촬영하여 신체 크기와 날개 크기 사이의 형태학적 스케일링 관계를 추정합니다. 최종적으로 데이터에 유형 2 선형 회귀 분석을 적용함으로써, 가능한 모든 신체 크기 범위에 따라 날개 크기가 어떻게 스케일링되는지를 보여주는 결과를 얻습니다.본 연구에서는 영양 공급 시간을 발달 단계별로 조절하여 성체 초파리의 체형 변이를 실험적으로 증가시키는 방법을 사용합니다. 이를 통해 전체 체형 범위에 걸친 형태적 스케일링 관계를 추정할 수 있습니다. 이 방법은 생물군 간 스케일링 관계 파라미터 변이의 근접 원인을 규명하는 것과 같이, 형태적 스케일링의 발현 및 진화에 관한 핵심 쟁점들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.초파리 개체군을 교배 챔버로 옮긴 후 3일 동안 24시간마다 알을 수집합니다. 최종적으로 해부 현미경을 사용하여 세 개의 연령 코호트를 생성합니다. 각 코호트에서 50개의 알씩 묶어 10 milliliters의 표준 초파리 배지가 들어 있는 바이알로 옮깁니다.유충 발달에 적합한 원하는 온도에서 바이알을 배양합니다. 가장 오래된 코호트가 배회 단계(wandering stage)에 도달하면, 유충을 먹이에서 분리하여 식이 조절을 적용할 시점입니다. 이 시점에서 가장 오래된 코호트의 유충들은 폐쇄(occlusion)를 위한 최소 생존 체중을 훨씬 초과하며, 자연적인 최대 체구 크기에 근접하게 됩니다.중간 코호트의 유충은 최소 생존 체중을 초과하였으나, 가장 오래된 코호트의 유충보다 더 작은 성체를 형성하게 됩니다. 유충과 가장 어린 코호트는 최소 생존 체중에 매우 근접해 있으며, 따라서 매우 작은 성체를 형성하게 됩니다. 먹이에서 유충을 제거하십시오.바이알에 약 5 mL의 40% sucrose 용액을 넣고, 쉐이커 테이블의 중간 설정으로 15~20분 동안 교반합니다. 교반 후, 세밀한 붓을 사용하여 sucrose 용액 위에 떠 있는 유충을 건져내어 습도를 유지할 수 있도록 젖은 솜 플러그가 들어 있는 바이알에 코호트별로 옮깁니다. 번데기가 될 때까지 원하는 온도에서 배양합니다.번데기를 현미경 슬라이드 위에 복측이 위로 향하게 배치합니다. 번데기가 배치되면 현미경에 연결된 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 이때 각 번데기가 흰색 배경 위에 어두운 실루엣으로 나타나도록 설정을 구성하십시오.이미징 후, 각 번데기를 1 mL의 파리 먹이가 들어 있는 개별 2 mL 에피튜브(epit tube)로 옮깁니다. 동공 실루엣의 픽셀 수로 동공 크기를 추정합니다. 해부 현미경 하에서 길이 또는 너비와 같은 다른 크기 지표를 사용할 수도 있습니다.이산화탄소를 사용하여 초파리를 가볍게 마취시킨 후, 두 장의 유리판 사이에 날개를 고정하여 초파리의 몸과 수직이 되도록 유지하는 흡입 장치인 윙 그래버(wing grabber)를 사용하여 위치를 잡습니다. 이미징의 경우, 본 연구에서는 살아있는 초파리의 날개를 촬영하기 위해 윙 그래버를 사용하였으나, 일반적인 도구를 사용하여 날개 및 기타 형질을 해부하고 이미징할 수 있습니다. 컴퓨터에 연결된 현미경 카메라를 사용하여 날개를 촬영하고 초파리의 성별을 기록합니다. 날개 이미지를 촬영하고 저장한 후, 외곽의 고정 랜드마크를 둘러싸는 최소 볼록 다각형(minimum convex polygon)을 이용한 선형 측정 또는 날개 실루엣의 픽셀 수를 통해 날개 크기를 추정합니다. 여기서 촬영된 번데기들은 식이 조절로 인한 크기 분포의 양 극단을 보여주었습니다.번데기가 폐쇄를 위한 최소 생존 중량에 도달한 후의 모습입니다. 또한 동공 크기 측정을 위한 해당 실루엣이 함께 표시되어 있습니다. 크기 분포의 양 끝단에 위치한 동일 개체들의 대응하는 날개 이미지가 실루엣과 함께 여기에 제시되어 있습니다.날개 크기 추출의 스케일링 관계를 추정하는 데 사용되었습니다. 날개 크기가 체구 크기에 따라 어떻게 변하는지 설명하는 파라미터를 통해, 그룹 간에 전체적인 형태가 크기와 어떻게 공변하는지 비교할 수 있습니다. 여기에서는 유충 시기에 충분히 먹이를 공급받았거나, 하루 또는 이틀 동안 굶긴 각 성별 개체들의 데이터가 제시되어 있습니다.이 절차의 개별 단계들은 빠르게 진행되지만, 전체적으로는 많은 노동력이 소요될 수 있습니다. 일반적으로 알에서 성충까지 약 3,500마리의 파리를 처리하는 데 약 350인시(person hours)가 소요됩니다. 숙련도에 따라 파리 취급 시간을 크게 단축할 수 있으며, 본 절차를 통해 다른 형태학적 특성들을 측정함으로써 추가적인 형태학적 스케일링 관계(morphological scaling relationships)를 추정할 수 있습니다.

experimental-manipulation-body-size-to-estimate-morphological-scaling

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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조직 공학 실험 접근법

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의 형태학의 스케일링 관계를 추정 바디 크기의 실험 조작 Drosophila

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