Testis 캡슐의 Teratoma 생성

이 절차의 전반적인 목표는 인간 만능 줄기세포(H PSCs)를 사용하여 면역 결핍 마우스의 고환 낭 내에 기형종을 형성함으로써 만능성을 분석하는 것입니다. 우선 만능성 테스트를 진행할 H PSCs 배양물을 수확하십시오. 그 다음 수술을 통해 마우스의 고환을 노출시킨 후 고환 낭 내에 세포를 주입하십시오.

고환을 원래 위치로 되돌리고 외과적으로 봉합합니다. 6~12주 후에 결과물인 종양을 조직학적으로 검사하여 각 배엽 유래 세포의 존재 여부를 확인합니다. 궁극적으로, 면역 결핍 마우스에서 세 가지 배엽 모두의 세포로 분화할 수 있음을 보여줌으로써 HPSC 라인이 진정으로 다능성임을 입증할 수 있습니다. 최근 인간 줄기세포의 다능성을 입증하는 새로운 방법들이 보고되었지만, 테라토마 분석법은 여전히 이 분야의 골드 표준으로 남아 있으며, 본 절차는 저희 실험실 배양 담당 선임 기술자인 tron이 시연할 것입니다.

인간 다능성 줄기세포를 함께 배양한 후, Accutane을 사용하여 hPSC를 해리합니다. 세포 수를 측정하여 주입당 100만 개의 hPSC를 분주합니다. 먼저, 마취된 6주령의 면역결핍 마우스 계통 수컷 마우스의 복부를 클리퍼로 제모합니다. 복부 중앙에서 시작하여 시계 방향으로 바깥쪽을 향해 포비돈 요오드 용액으로 마우스 복부 앞벽을 세척합니다.

그 후 면도한 부위를 70%ethanol로 세척하십시오. 면봉을 매번 교체하며 이 과정을 세 번 반복합니다. 수술 절차를 수행하려면, 멸균 수술 가위가 준비된 멸균 후드 내부의 가열 패드로 동물을 옮기십시오.

포셉으로 복막을 잡은 상태에서 고관절 높이 바로 아래의 피부와 복막을 따라 1cm 길이로 세로 절개를 가합니다. 다른 멸균 포셉을 사용하여 오른쪽 고관절 방향으로 깊게 접근한 뒤, 부착된 고환과 함께 흰색 지방 조직을 끌어냅니다. 이제 주입할 hpsc를 1 CC 투베르쿨린 주사기에 채웁니다. 주요 혈관에서 떨어진 고환 낭의 중앙부에 H PSCs 20 내지 30 µL를 천천히 주입합니다.

포셉을 사용하여 세포의 역류를 방지하며 바늘을 천천히 제거합니다. 고환과 지방 조직을 복강 내 원래 위치로 되돌려 놓습니다. 흡수성 봉합사를 사용하여 복막을 2~3바늘 꿰매고, 오토 클립으로 피부를 봉합합니다.

수술 후, 필요에 따라 1일 2회 진통제를 투여하십시오. 6~12주 동안 동물의 종양이 촉진 가능한 수준으로 성장하는지 모니터링하십시오. 종양의 크기가 약 5mm가 되면, 희생된 마우스로부터 종양을 제거하여 기록하십시오.

종양을 촬영하고 크기와 무게를 모두 측정하십시오. 그런 다음 종양을 작은 조각으로 절단하여 조직 병리학적 분석을 위해 4%paraldehyde 용액에 고정하십시오. 일반적으로 6~12주 후에 기형종이 관찰됩니다.

본 예시에서는 100만 개의 인간 WA 09 만능 줄기세포를 면역 결핍 마우스의 고환 낭에 주입하였습니다. 테라토마를 정밀하게 관찰하면 예상대로 이질성과 다수의 부착된 낭종이 확인됩니다.

조직병리학적 분석 결과, 세 가지 배엽 각각에서 유래한 세포들이 존재함이 나타납니다. 이 절차를 수행할 때는 분석이 올바르게 이루어졌는지 확인하기 위해, 충분한 능력을 갖춘 것으로 알려진 양성 대조군 세포주를 반드시 포함해야 한다는 점을 기억하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, 인간 줄기세포주가 다능성(pluripotent)을 가지고 있는지 여부를 판별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.