Name: Testis 캡슐의 Teratoma 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 배우세요 면역결핍 마우스 고환캡슐에 인간 다능성줄기세포를 주입하여 테라토마를 생성하고 다능성을 평가하는 방법을. 이 기법은 줄기세포가 세 배아층으로 분화하는지 조직학적으로 확인하여 다능성을 검증합니다.

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참고 : 모든 동물의 절차 IACUC 또는 동급의 승인을 받아야합니다. 모든 수술 장비는 수술 전에 소독을해야합니다. 멸균 장갑, 커튼과 거즈를 사용해야합니다. 1. 수술에 대한 사전 준비 <ol><li> 6주 오래된 뮤스 Musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J 수컷 마우스 또는 마우스의 다른 immunocompromised 긴장을 구합니다. </li><li> 모든 수술 도구, 장갑, 그리고 거즈를 소독. </li><li> accutase로 주입되는 hPSCs을 떼어 놓다. </li><li> 세포를 세고 matrigel은 DMEM/F-12에서 1:1 희석에서 20-30 μL 당 1,000,000 세포를 resuspend. 완료하기 전까지 얼음 세포를 유지. </li><li> 종종 Trypan 블루가 주입되는 실험을 통해 실행을 할 때 유용합니다. 이것은 모든 세포가 낭비되기 전에 잠재적인 문제를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 동식물 사육장에서 해당 기관의 승인 절차에 따라 마우스를 마취. 우리의 실험에서, 우리는 anesth를 사용isoflurane과 esia 기계. 마우스는 처음 1L/min 산소와 3-4% isoflurane으로 유도 챔버에 넣어되었습니다. 일단 anesthetized, 1L/min 산소와 2-3% isoflurane과 코 콘이 사용되었습니다. </li><li> 가위로 복부를 면도하고, 복부의 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 시계 방향으로 작동, 마우스 복부의 앞부분은 벽을 청소. 처음 사용할 때 Povidone-요오드 용액 후 70 % 에탄올로 씻는다. 면봉 때마다 변화, 3 번 반복합니다. 조직 배양 또는 해부 후드 내부 동물 보온하는 가열 패드로 동물을 전송합니다. </li><li> 단지 공동 고관절의 수준 아래 무균 수술 가위로 피부와 복막을 통해 1cm 세로 절개를합니다. </li><li> 집게와 함께 복막을 누른 상태에서 다른 멸균 forcept과 오른쪽 엉덩이쪽으로 내려 도달 첨부 testes와 함께 흰색 지방 조직을 당겨. </li><li> 멸균 거즈에 testes를 놓습니다. </li><li> 투베르쿨린 또는 해밀턴 (1cc) 주사기 WI를 채우hPSCs가 주입되는 전 ... 당신 같은 WA09 (또한 H9라고도 함)로 pluripotent 알고있는 컨트롤 hPSC 라인을 포함하는 것이 좋습니다합니다. 이렇게 당신은 당신의 주입이나 수술 결함 여부를 확인하는 데 사용할 수있는 긍정적인 제어할 수 있습니다. </li><li> 천천히 고환 캡슐이 팽창하기 시작하면 중지, 주요 혈관에서 떨어져 testis 캡슐의 중심에 hPSCs (20-30 μL)을 주입. </li><li> 세포의 역류를 방지하기 위해 천천히 주사 바늘을 제거합니다. </li><li> 집게를 사용하여 복부를 원래 위치로 testes과 지방 조직을 다시 전송합니다. </li><li> 2 ~ 3 reabsorbable 봉합과 복막을 닫고 autoclips으로 피부를 닫습니다. </li><li> 그것이 복구로 1-2 일 동안 하루에 두 번 수술 후 진통제의 일부 형태 (귀하의 동식물 사육장에서 허용되는 참조) 주어진 때까지 마우스는 따뜻한 보관해야합니다. 로 마취도 진통도는 종양 발달을 방해합니다. </li><li> 일을 모니터링6-12 주 동안 종양의 성장을위한 전자 동물. 아주 드물게, 종양은 사전에 6주 주입 후의 크기가 5mm로 성장할 수 없습니다, 따라서 그것은 동물을 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 경우 동물 euthanized과 종양 처리하고 정상적으로 분석되어야한다. </li><li> 종양이 만져서 알 수있는이고 크기가 약 5mm 도달되면, 마우스를 마취 및 접수 동물 프로토콜 절차에 따라 그것을 희생. </li><li> 이에 따라 종양 및 문서 제거 - 사진, 측정 크기, 무게. </li><li> 작은 조각으로 종양을 잘라 4 % paraformaldehyde 용액에 고정시킨다. 샘플까지 4 % paraformaldehyde의 상점은 sectioning, 염색법 및 분석을 위해 병리학자로 전송됩니다. </li></ol> 2. 대표 검색 결과 : 이 프로토콜이 완료되면 같이 설명하고 주입 세포 라인 pluripotent이며, 만져서 알 수있는, 시각적으로 명백한, 종양이 가장 12 주 이내에 구성해야합니다. WA09 같은 설립 hPSC 라인을 위해, 우리는 일반적으로 볼 수육주 이내에 종양. iPSC 라인의 경우는 8-10주 내에 종양을보고 드문되지 않습니다. 그것은 절차가 올바르게 수행되었는지 확인하기 위해서는, 긍정적인 컨트롤로 pluripotent 것으로 알려져 라인 쥐 주입하는 것이 매우 중요합니다. 종양은 대개 매우 이질적인 모양과 많은 첨부된 cysts (그림 1)가. 병리학자에 의한 종양 샘플의 분석 세 배아 레이어 (그림 2)에서 차별화된 조직을 표시해야합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3177/3177fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. testis 캡슐의 일반 hPSC 파생 teratoma. 설명된 프로토콜에 따라 백만 WA09 세포 면역 훼손 마우스 testis 캡슐에 주입했다. 6 주 후 teratoma가 관찰되었다. ) Teratoma는 마우스에서 가져온. B) teratoma의 사진을 닫습니다. 이질과 낭종 구조를합니다. <img alt="그림 2" src='"/' files> 그림 2. Hematoxylin과 Eosin teratoma의 스테인드 섹션은 각 세균 층의 조직을 보여줍니다. 고정 따라 teratoma은 Hematoxylin과 Eosin으로 sectioned 및 스테인드했습니다. 병리학자에 의한 분석 3 배아 레이어 각각의 세포의 존재를 공개했다.

<ol><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-255 (1984).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154(1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).</li>
<li>Downing, G. J., Battey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+assessment+of+the+first+20+years+of+research+using+mouse+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1145 (1998).</li>
<li>Reubinoff, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18, (2000).</li>
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<li>Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+Setting+standards+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells.</a> Science. 300, 913-913 (2003).</li>
<li>Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+assays+with+human+embryonic+stem+cells%3A+a+rationale+for+one+type+of+human-animal+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera.</a> Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).</li>
<li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+development+from+human+embryonic+stem+cells+after+injection+into+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cells.+Dev%22%5BJournal%5D)">Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice.</a> Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).</li>
<li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratomas+for+the+assessment+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기에 제시된 방법은 testis 캡슐에 hPSCs에서 기형 종을 발생시키는 매우 안정적이고 직접적인 수단을 제공합니다. 이 기법의 몇 가지 중요한 매개 변수가 있습니다. 특히, 그것은 통제와 같은 pluripotent 것으로 알려져 있습니다 hPSC 세포 라인을 주입하는 것이 중요합니다. 다른 중요한 파라미터는 분사와 종양 관찰 사이의 시간 간격이 포함됩니다. WA09 같은 세포 라인의 경우, 기형 종은 6~8주에서 관찰되어야한다. 새로운 iPSC 라인의 경우 우리는 자주 10주이 필요다는 것을 찾을 수 있습니다. 또 다른 우려는 주입된 세포의 숫자입니다. 우리가 백만 세포를 주입했지만 검정은 쉽게 적은 수의 세포로 할 수 있습니다. 또한, 사출 매체는 중요하다. 우리는 PBS 또는 DMEM/F-12 반대로 세포, matrigel과 DMEM/F-12의 1:1 혼합물에 주입 때 우리가 최상의 결과를 얻을 것을 발견했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Invitrogen </td><td> A1110501 </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 113300-032 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,277 </td></tr></tbody></table>

testis 캡슐의 teratoma 생성

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Pluripotent 줄기 세포는 (PSCs)들은 세 배아 레이어의 세포로 구별 수있는 독특한 특성이 있습니다. 이것은 그들 여러 질병의 치료를 위해 잠재적으로 유용한 도구가 있습니다. 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)와 인간 배아 줄기 세포와 지속적인 연구의 출현과 함께 (hESCs) 특정 세포 라인 pluripotent임을 증명할 수있는 assays를위한 필요가있다. Germline 전송 마우스 배아의 줄기 세포 (mESC) 라인 1,2,3의 pluripotence를 시연을위한 황금 표준되었습니다. 이 분석 사용하여 연구자들은 mESC 라인이 배아 세포 네를 포함한 배아에있는 모든 세포 유형을 만들 수있다는 것을 보여줄 수있다. 인간 ESCs가 germline 전송에 대한 검사를받을 수 없기 때문에 인간의 ESC 라인 5,6의 생성을 통해 이러한 세포의 pluripotence 증명할 수있는 적절한 분석은 불분명했습니다. 대리로서 teratoma 분석은 현재 pluripot을 설명하는 데 사용됩니다인간 pluripotent 줄기 세포 ency (hPSCs) 7, 8, 9. 이 분석은 최근 주목 받고왔다하고 새로운 기술을 적극적으로 모색되고 있지만, teratoma 분석은 현재 금 본위 7입니다. 본 분석에서는 문제의 세포는 면역 손상 마우스에 주입된다. 세포 pluripotent 경우 teratoma 결국 개발되고 종양의 섹션은 3 개의 배아 층 10 일부터 조직을 보여줍니다. teratoma 분석에서는 hPSCs는 마우스의 다른 분야로 주입 할 수 있습니다. 또는 다리 중 subcutaneously 또는 intramuscularly 11로, 가장 일반적인 사출 사이트 testis 캡슐, 신장 캡슐, 간 등이 있습니다. 여기에서 우리는 종양 성장을위한 사이트로 testis 캡슐을 사용 hPSCs에서 기형종의 생​​성을위한 강력한 프로토콜을 설명합니다.

인간 pluripotent 줄기 세포 (hPSCs)은 다양한 질병을 치료하기 위해 무수히 많은 가능성이 있습니다. 이러한 세포의 유틸리티들은 신체의 모든 세포 유형으로 구별 수있다는 사실에있다. 여기 hPSCs의 pluripotence을 설명하는 데 사용됩니다 teratoma 분석을 설명합니다.

Testis 캡슐의 Teratoma 생성

다능성 줄기세포(PSCs)는 세 가지 배엽 모두에서 유래하는 세포로 분화할 수 있다는 독특한 특성을 가지고 있습니다. 이는 이들을 ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 만능 줄기세포(H PSCs)를 사용하여 면역 결핍 마우스의 고환 낭 내에 기형종을 형성함으로써 만능성을 분석하는 것입니다. 우선 만능성 테스트를 진행할 H PSCs 배양물을 수확하십시오. 그 다음 수술을 통해 마우스의 고환을 노출시킨 후 고환 낭 내에 세포를 주입하십시오.고환을 원래 위치로 되돌리고 외과적으로 봉합합니다. 6~12주 후에 결과물인 종양을 조직학적으로 검사하여 각 배엽 유래 세포의 존재 여부를 확인합니다. 궁극적으로, 면역 결핍 마우스에서 세 가지 배엽 모두의 세포로 분화할 수 있음을 보여줌으로써 HPSC 라인이 진정으로 다능성임을 입증할 수 있습니다. 최근 인간 줄기세포의 다능성을 입증하는 새로운 방법들이 보고되었지만, 테라토마 분석법은 여전히 이 분야의 골드 표준으로 남아 있으며, 본 절차는 저희 실험실 배양 담당 선임 기술자인 tron이 시연할 것입니다.인간 다능성 줄기세포를 함께 배양한 후, Accutane을 사용하여 hPSC를 해리합니다. 세포 수를 측정하여 주입당 100만 개의 hPSC를 분주합니다. 먼저, 마취된 6주령의 면역결핍 마우스 계통 수컷 마우스의 복부를 클리퍼로 제모합니다. 복부 중앙에서 시작하여 시계 방향으로 바깥쪽을 향해 포비돈 요오드 용액으로 마우스 복부 앞벽을 세척합니다.그 후 면도한 부위를 70%ethanol로 세척하십시오. 면봉을 매번 교체하며 이 과정을 세 번 반복합니다. 수술 절차를 수행하려면, 멸균 수술 가위가 준비된 멸균 후드 내부의 가열 패드로 동물을 옮기십시오.포셉으로 복막을 잡은 상태에서 고관절 높이 바로 아래의 피부와 복막을 따라 1cm 길이로 세로 절개를 가합니다. 다른 멸균 포셉을 사용하여 오른쪽 고관절 방향으로 깊게 접근한 뒤, 부착된 고환과 함께 흰색 지방 조직을 끌어냅니다. 이제 주입할 hpsc를 1 CC 투베르쿨린 주사기에 채웁니다. 주요 혈관에서 떨어진 고환 낭의 중앙부에 H PSCs 20 내지 30 µL를 천천히 주입합니다.포셉을 사용하여 세포의 역류를 방지하며 바늘을 천천히 제거합니다. 고환과 지방 조직을 복강 내 원래 위치로 되돌려 놓습니다. 흡수성 봉합사를 사용하여 복막을 2~3바늘 꿰매고, 오토 클립으로 피부를 봉합합니다.수술 후, 필요에 따라 1일 2회 진통제를 투여하십시오. 6~12주 동안 동물의 종양이 촉진 가능한 수준으로 성장하는지 모니터링하십시오. 종양의 크기가 약 5mm가 되면, 희생된 마우스로부터 종양을 제거하여 기록하십시오.종양을 촬영하고 크기와 무게를 모두 측정하십시오. 그런 다음 종양을 작은 조각으로 절단하여 조직 병리학적 분석을 위해 4%paraldehyde 용액에 고정하십시오. 일반적으로 6~12주 후에 기형종이 관찰됩니다.본 예시에서는 100만 개의 인간 WA 09 만능 줄기세포를 면역 결핍 마우스의 고환 낭에 주입하였습니다. 테라토마를 정밀하게 관찰하면 예상대로 이질성과 다수의 부착된 낭종이 확인됩니다.조직병리학적 분석 결과, 세 가지 배엽 각각에서 유래한 세포들이 존재함이 나타납니다. 이 절차를 수행할 때는 분석이 올바르게 이루어졌는지 확인하기 위해, 충분한 능력을 갖춘 것으로 알려진 양성 대조군 세포주를 반드시 포함해야 한다는 점을 기억하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, 인간 줄기세포주가 다능성(pluripotent)을 가지고 있는지 여부를 판별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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특정 세포로 hESCs의 감독 차별은 재생 의학에 많은 관심을 생성했다. 우리는 결정을위한 간결하고 단계별 절차를...

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여기서, 우리는 시판되는 마이크로웰 배양 시스템을 사용하여 고환 특이적 조직 구조를 가진 돼지 고환 오르가노이드의 재현 가능한 생성을 위한 프로토콜을 제시한다.

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Testis 캡슐의 Teratoma 생성

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