재조합 수초 희소돌기아교세포 당단백질의 분리 및 정제

MOGtag는 실험적 자가면역 뇌척수염 연구를 위해 가용화 및 정제 태그와 융합된 재조합 수초 희소돌기아교세포 당단백질입니다.

MOGtag를 분리하려면 MOGtag를 발현하는 박테리아 세포를 용해 완충액에 현탁시키고 배양합니다.

완충액의 효소와 세제는 막 지질을 파괴하고 세포벽을 분해합니다.

초음파 처리하여 세포를 추가로 용해하여 MOGtag를 포함하는 불용성 봉입체를 방출합니다.

원심분리하여 봉입체를 펠릿화합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 완충액에 재현탁한 다음 배양합니다.

구아니딘 염산염을 첨가한 다음 배양하여 MOGtag를 가용화합니다.

단백질을 하전된 니켈 수지에 옮기고, 혼합하고, 흔들면서 배양하여 MOGtag가 니켈 이온에 결합할 수 있도록 합니다.

원심분리하여 결합된 MOGtag를 펠릿화합니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 용출 완충액에 재현탁한 다음 진영하면서 배양합니다.

용출 완충액의 이미다졸은 수지에서 MOGtag를 방출합니다.

다시 원심분리하여 정제된 MOGtag 함유 상청액을 수집하여 추가 분석을 위해 보관합니다.

고속 원심분리와 호환되는 250밀리리터 병에 배양균을 고르게 분배하고 이 시점부터 병을 얼음 위에 보관합니다. 박테리아 세포를 섭씨 4도에서 15분 동안 22,000 * g으로 펠릿화합니다. 모든 박테리아 펠릿을 총 30밀리리터의 용해 완충액에 재현탁하고 결합합니다. 이 부피를 고속 원심분리가 가능한 둥근 바닥 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.

이 튜브를 섭씨 30도의 수조에 30분 동안 넣습니다. 배양 시간 동안 튜브를 두 번 흔들어 세포를 재현탁시킵니다. 배양 후, 튜브를 얼음 위로 옮기고 용액을 20 킬로헤르츠 및 진폭 70 %로 초음파 처리하여 5 펄스 동안 3 초 동안 켜고 3 초 동안 끕니다. 5 펄스의 총 6 라운드 동안 용액을 초음파 처리하여 라운드 사이에 용액이 얼음 위에서 냉각되도록 합니다.

다음으로, 용액을 섭씨 4도에서 15분 동안 24,000*g으로 원심분리한 후 펠릿을 완충액 A 30ml에 재현탁하고 용액을 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용액에 17.2g의 구아니딘-HCl을 첨가합니다. MOG 태그 단백질을 가용화하기 위해 얼음 위에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. MOG 태그 단백질을 정제하려면 가용화된 단백질의 전체 부피를 니켈 수지가 들어 있는 첫 번째 튜브로 옮깁니다. 혼합 후 튜브를 섭씨 4도의 로커 위에 1시간 동안 수평으로 놓습니다.

튜브를 섭씨 4도에서 8분 동안 4,500*g으로 원심분리한 후, 상청액을 니켈 수지의 두 번째 튜브로 옮기고 이전과 같이 배양합니다. 그 동안 첫 번째 튜브의 니켈 수지를 40밀리리터의 용출 완충액에 재현탁하고 튜브를 섭씨 4도의 로커에 5분 동안 수평으로 놓은 후 이전과 같이 원심분리합니다. 용출된 MOG 태그 단백질을 함유한 상청액을 정제된 MOG 태그 단백질로 표지된 250밀리리터 병으로 옮깁니다. 이 병은 섭씨 4도에서 보관하십시오.