Name: 강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 배우세요 생쥐 후각 감각 뉴런에서 케이지 화합물의 플래시 광분해를 이용한 후각 신호 전달 메커니즘 연구 방법을 패치클램프 기록과 자외선 광분해 기술로 신경 신호 경로를 정밀하게 제어하고 분석하는 실험 기법을 익히세요.

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<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
<li>Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-gated+ion+channels+in+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction.</a> FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).</li>
<li>Bozza, T. C., Kauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+properties+of+convergent+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).</li>
<li>Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+and+Ultrafast+Phototriggers+for+cAMP+and+cGMP+by+Using+Long-Wavelength+UV%2FVis-Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).</li>
<li>Rapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+lamp-based+irradiation+of+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flash lamp-based irradiation of caged compounds.</a> Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).</li>
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<li>Lagostena, L., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+and+photolysis+of+caged+compounds+in+olfactory+sensory+neurons+isolated+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse.</a> Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).</li>
<li>Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+adaptation+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+does+not+require+the+activity+of+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.</a> J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).</li>
<li>Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+development+of+cyclic+nucleotide-gated+and+Ca2%2B+-activated+Cl-+currents+in+isolated+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).</li>
<li>Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+jumps+reveal+dynamic+ion+selectivity+of+calcium-activated+chloride+currents+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+and+TMEM16B-transfected+HEK+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells.</a> J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).</li>
<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Responses+of+Mouse+Olfactory+Sensory+Neurons+Using+the+Air-phase+Electroolfactogram+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).</li>
<li>Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+using+a+light+emitting+diode%3A+an+efficient%2C+compact%2C+and+affordable+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution.</a> Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

패치 - 클램프 녹음과 함께 갇힌 화합물의 플래시 광분해은 생리학적으로 활성 분자 내부와 외부에서 세포 모두의 농도에 신속하고 현지 점프를 얻을 수있는 유용한 기술입니다. 갇힌 compounds1 여러 종류의 합성되었으며,이 기술이 활성화하거나 사용 가능한 갇힌 화합물 11 일부 광분해에 의해 변조된 수있는 이온 채널을 표현 교양 세포를 포함한 세포의 다양한 유형에 적용할 수 있습니다. 갇힌 화합물의 광분해은 짧은 시간에 분자의 충분한 양의 우리에서 내놓다 근처 자외선의 높은 강도의 펄스를 필요로합니다. 다양한 광원을 사용할 수 있습니다 : 지속적으로 운영 수은 또는 크세논 아크 램프 (LED 셔터에 의해 제어 및 현미경, 지논 플래시 램프, 자외선 레이저, 그리고 최근에 개발된 고전력 자외선 발광 다이오드의 epifluorescent 포트에 결합 ). 광원의 각 유형의 장점과 disadvan있다특정 응용 프로그램 및 장치의 비용에 따라 tages. 플래시...

<table border="1"><tbody><tr><th> 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 현미경으로 어댑터 모듈 플래시 램프 </td><td> Rapp 광전자 </td><td> FlashCube 70 </td><td></td></tr><tr><td> 에어 테이블 </td><td> TMC </td><td> MICRO - G 63-534 </td><td></td></tr><tr><td> 디지타이저 </td><td> 축삭 인 스트 루먼트 </td><td> Digidata 1322A </td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 소프트웨어 </td><td> 축삭 인 스트 루먼트 </td><td> pClamp 8 </td><td></td></tr><tr><td> 데이터 분석 소프트웨어 </td><td> WaveMetrics </td><td> 이고르 </td><td></td></tr><tr><td> 어댑터 모듈 미러 </td><td> Rapp 광전자 </td><td> M70/100 </td><td></td></tr><tr><td> 전극 홀더 </td><td> 축삭 인 스트 루먼트 </td><td> 1 - HL - U </td><td></td></tr><tr><td> 패러데이의 새장 </td><td> 사용자가 만든 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 필터 큐브 </td><td> 올림포스 산 </td><td> U - MWU </td><td> 여기 필터를 제거 </td></tr><tr><td> 섬광등 </td><td> Rapp 광전자 </td><td> JML - C2 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 뒤몽 # 55 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14,099 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 모세관 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> PG10165 - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 바닥 요리 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> FD35 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 조명기 </td><td> 올림포스 산 </td><td> 하이라이트 3100 </td><td></td></tr><tr><td> 거꾸로 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> IX70 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulators </td><td> Luigs &amp; 노이만 </td><td> SM I </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 풀러 </td><td> Narishige </td><td> PP - 830 </td><td></td></tr><tr><td> 모니터 </td><td> HesaVision </td><td> MTB - 01 </td><td></td></tr><tr><td> 중성 농도 필터 </td><td> 오메가 광학 </td><td> 다양 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 100X </td><td> 자이스 혈구 </td><td> Fluar 440,285 </td><td> 자이스 혈구 또는 Olympu 중의 </td></tr><tr><td> 목표 100X </td><td> 올림포스 산 </td><td> UPLFLN 100XOI2 </td><td> 자이스 혈구 또는 올림푸스 중 </td></tr><tr><td> 광학 UV 필터 shortpass </td><td> Rapp 광전자 </td><td> SP400 </td><td></td></tr><tr><td> 패치 - 클램프 증폭기 </td><td> 축삭 인 스트 루먼트 </td><td> Axopatch 200B </td><td></td></tr><tr><td> 포토 다이오드 조립 </td><td> Rapp 광전자 </td><td> PDA </td><td></td></tr><tr><td> 석영 라이트 가이드 </td><td> Rapp 광전자 </td><td> 다양 </td><td> 우리는 600 μm의 직경을 사용하여 </td></tr><tr><td> 실버 와이어 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> AGT1025 </td><td></td></tr><tr><td> 실버 지상 펠릿 </td><td> 워너 악기 </td><td> 64-1309 </td><td></td></tr><tr><td> 크세논 아크 램프 </td><td> Rapp 광전자 </td><td> XBL - JML </td><td></td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> BCMCM - 갇힌 CAMP </td><td> BioLog </td><td> B016 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 </td><td> A8806 </td></tr><tr><td> CaCl2 표준 용액 0.1 M </td><td> Fluka </td><td> 21,059 </td></tr><tr><td> 갇힌 CA : DMNP - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> D6814 </td></tr><tr><td> 시스테인 </td><td> 시그마 </td><td> C9768 </td></tr><tr><td> Concanavalin A 형 V (ConA) </td><td> 시그마 </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 시그마 </td><td> C4036 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> 시그마 </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 </td><td> E4378 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G5767 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 시그마 </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> 코이 </td><td> 시그마 </td><td> P1767 </td></tr><tr><td> 류펩틴 </td><td> 시그마 </td><td> L0649 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Fluka </td><td> 63,020 </td></tr><tr><td> Papain </td><td> 시그마 </td><td> P3125 </td></tr><tr><td> 폴리 - L - 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P1274 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S9888 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 시그마 </td><td> S5881 </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> 시그마 </td><td> P2256 </td></tr></tbody></table>

강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

갇힌 화합물의 광분해는 다양한 생리학 활성 화합물 1의 농도에 신속하고화된 증가의 생산 수 있습니다. 갇힌 화합물은 자외선의 플래시에 의해 부러진 수있는 화학 케이지에 의해 만들어진 분자 생리학 비활성됩니다. 여기, 우리는 dissociated 마우스 후각 감각 뉴런의 후각 전달의 연구 갇힌 화합물의 광분해와 함께 패치 - 클램프 녹음을 얻는 방법을 보여줍니다. 후각 전달의 과정 (그림 1) 수용체에 바인딩 odorant는 주기적 염기 - 게이트 (CNG) 채널 2를 열어 캠프의 증가로 연결 후각 감각 뉴런의 속눈썹에서 열립니다. CNG 채널을 통해 CA 항목은 CA - 활성화 망할 CIA 채널을 활성화한다. 우리는 마우스 후각 상피 3 방법에 갇힌 CAMP 4 광분해 또는 칼슘 5 갇힌하여 CNG 채널 또는 CA - 활성화 망할 CIA 채널을 활성화에서 신경을 떼어 놓다하는 방법을 보여 &lt;/&gt;를 한모금. 우리는 패치 - 클램프 녹음이 전체 셀 전압 클램프 구성 8-11에서 전류를 측정하기 위해 이동하는 동안 우리에서 내놓다 캠프 CA에 ciliary 지역 자외선 섬광을 적용하기 위해 플래시 램프 6,7을 사용합니다.

갇힌 화합물의 광분해는 다양한 생리학 활성 화합물의 농도에 신속하고화된 증가의 생산 수 있습니다. 여기, 우리는 갇힌 캠프의 광분해와 함께 또는 dissociated 마우스 후각 감각 뉴런의 후각 전달 연구를위한 CA를 갇힌 패치 - 클램프 녹음을 얻는 방법을 보여줍니다.

케이지 화합물(caged compounds)의 광분해를 통해 다양한 생리 활성 화합물의 농도를 빠르고 국소적으로 증가시킬 수 있습니다1. ...

후각은 외부 환경의 휘발성 화학 물질을 감지하고 인식할 수 있게 해줍니다. 냄새 분자는 후각 신경세포의 시냅스에 있는 수용체와 결합하여, 고리형 뉴클레오타이드 작동 통로(cyclic nucleotide gated channels)를 열고 이어 칼슘 활성 염화물 통로(calcium activator chloride channels)를 여는 신호 전달 폭포(transduction cascade)를 활성화합니다. 본 실험의 전반적인 목적은 광활성 케이지 화합물(photo-cage compounds)을 사용하여 이러한 통로를 직접 활성화하는 방법을 보여주는 것입니다. 케이지 화합물이란 화학적 케이지에 의해 생리학적으로 비활성화된 분자를 말합니다.자외선 플래시가 케이지를 파괴하여 생리적으로 활성 상태인 화합물 케이지를 방출합니다. Cycl, mp 또는 cage calcium이 세포 내 용액에 포함되어 패치 피펫을 채우고 후각 감각 신경세포의 세포질로 확산됩니다. 전체 세포 전압 클램프 구성에서 전류를 측정하기 위해 패치 클램프 기록을 수행하는 동안, Cary 영역에 울트라 플래시를 조사하여 cycling, MP 또는 calcium을 활성화합니다.안녕하세요. 오늘은 케이지 화합물의 FE 정책과 결합된 패치 클램프 기록 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 후각 센서 뉴런의 CMP 게이트 채널과 칼슘 활성 콜린 채널을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.본 실험에 사용된 패치 클램프 기록 시스템은 도립 현미경, 관류 시스템, 마이크로 조작기, 기록 전극 및 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 참조 전극으로 구성되어 있으며, 이 모든 장치는 패러데이 케이지 내부의 진동 방지 테이블 위에 설치되어 있습니다. 패치 클램프 증폭기는 데이터 수집 소프트웨어가 설치된 컴퓨터의 디지타이저에 연결되어 있습니다. 고강도 자외선 플래시를 생성하기 위해 excelon 플래시 램프를 사용합니다.광섬광은 수동으로 트리거하거나 전기생리학적 획득을 제어하는 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터로 트리거할 수 있습니다. 광학 실험에 가장 적합한 파장은 출력 슬롯이나 플래시 램프에 UV 필터를 삽입하여 선택합니다. 광섬광의 강도는 플래시 램프의 전압이나 정전용량을 변경하여 조절할 수 있습니다.플래시 램프의 두 번째 출력 슬롯에 중성 밀도 필터를 장착하여 광도를 더욱 정밀하게 제어합니다. 플래시 광은 석영 섬유 광 가이드를 통해

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

방법은 형광 이미징에 대해 서로 다른 척추 동물에서 하나의 생활 photoreceptor 세포의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 방법은 이미지와 같은 NADH이나 비타민 A와 같은 내생 fluorophores의 형광을 위해 사용하거나, CA에 민감한 exogenously 추가 형광 염료의...

형광 이미징을위한 절연 척추 Photoreceptor 세포를 생활 준비

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

이 문서는 생쥐의 후각 망울의 표면에지도 냄새 evoked 활동에 고유 광 신호와 flavoproteins autofluorescence 신호 이미징의 프로토콜을 제공합니다.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

ChR2을 표현 성인에서 태어난 뉴런은 후각 신경 회로의 기능들에 대한 그들의 기여를 검토하기 위해 슬라이스 electrophysiological 준비로 조작할 수 있습니다.

뉴런의 사진 자극에 저렴한 LED 배열을 사용하여

이 비디오는 파리에서 시냅스적으로 국소화된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징 방법을 보여줍니다. 현미경 검사를 위해 파리를 준비하고, 후각 조절을 수행하고, 냄새로 인한 칼슘 유입을 시각화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

우리는 MS 시간적 해상도 막 역학의 시각화를 가능하게 전자 현미경, "플래시와 동결"에서 새로운 기술을 개발했다. 이 기술은 고압 동결 optogenetic 뉴런의 자극을 결합한다. 여기서 우리는 절차를 설명하고 상세하게 프로토콜을 설명합니다.

플래시 및 동결 : 전자 현미경으로 막 역학을 캡처하는 소설 기법

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

배우세요 생쥐 후각 감각 뉴런에서 케이지 화합물의 플래시 광분해를 이용한 후각 신호 전달 메커니즘 연구 방법을 패치클램프 기록과 자외선 광분해 기술로 신경 신호 경로를 정밀하게 제어하고 분석하는 실험 기법을 익히세요.

강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

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