강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

후각은 외부 환경의 휘발성 화학 물질을 감지하고 인식할 수 있게 해줍니다. 냄새 분자는 후각 신경세포의 시냅스에 있는 수용체와 결합하여, 고리형 뉴클레오타이드 작동 통로(cyclic nucleotide gated channels)를 열고 이어 칼슘 활성 염화물 통로(calcium activator chloride channels)를 여는 신호 전달 폭포(transduction cascade)를 활성화합니다. 본 실험의 전반적인 목적은 광활성 케이지 화합물(photo-cage compounds)을 사용하여 이러한 통로를 직접 활성화하는 방법을 보여주는 것입니다. 케이지 화합물이란 화학적 케이지에 의해 생리학적으로 비활성화된 분자를 말합니다.

자외선 플래시가 케이지를 파괴하여 생리적으로 활성 상태인 화합물 케이지를 방출합니다. Cycl, mp 또는 cage calcium이 세포 내 용액에 포함되어 패치 피펫을 채우고 후각 감각 신경세포의 세포질로 확산됩니다. 전체 세포 전압 클램프 구성에서 전류를 측정하기 위해 패치 클램프 기록을 수행하는 동안, Cary 영역에 울트라 플래시를 조사하여 cycling, MP 또는 calcium을 활성화합니다.

안녕하세요. 오늘은 케이지 화합물의 FE 정책과 결합된 패치 클램프 기록 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 후각 센서 뉴런의 CMP 게이트 채널과 칼슘 활성 콜린 채널을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 실험에 사용된 패치 클램프 기록 시스템은 도립 현미경, 관류 시스템, 마이크로 조작기, 기록 전극 및 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 참조 전극으로 구성되어 있으며, 이 모든 장치는 패러데이 케이지 내부의 진동 방지 테이블 위에 설치되어 있습니다. 패치 클램프 증폭기는 데이터 수집 소프트웨어가 설치된 컴퓨터의 디지타이저에 연결되어 있습니다. 고강도 자외선 플래시를 생성하기 위해 excelon 플래시 램프를 사용합니다.

광섬광은 수동으로 트리거하거나 전기생리학적 획득을 제어하는 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터로 트리거할 수 있습니다. 광학 실험에 가장 적합한 파장은 출력 슬롯이나 플래시 램프에 UV 필터를 삽입하여 선택합니다. 광섬광의 강도는 플래시 램프의 전압이나 정전용량을 변경하여 조절할 수 있습니다.

플래시 램프의 두 번째 출력 슬롯에 중성 밀도 필터를 장착하여 광도를 더욱 정밀하게 제어합니다. 플래시 광은 석영 섬유 광 가이드를 통해 유리 바닥 배양 접시에 도말된 뉴런으로 유도됩니다. 광 가이드는 도립 현미경의 에피 형광 부착 장치에 연결됩니다.

어댑터를 사용하여, 여기 필터가 없는 변형된 필터 큐브가 이색 거울을 통해 UV 빔을 뉴런으로 유도합니다. 빛은 100 x 오일 침강 렌즈를 통해 집속됩니다. 라이트 가이드를 조명기에 삽입하여 조직으로 덮인 영역을 시각화합니다.

현미경에 연결된 CCD 카메라를 통해 모니터로 영상을 관찰합니다. 해부 전 실험을 위해 UV flesh 영역을 국소화할 수 있도록 모니터상에 해당 영역의 제어선을 그립니다. conna a와 poly가 코팅된 유리 바닥 디쉬 3개를 준비합니다. 해부를 준비하기 위해 50mm 설탕 코팅 페트리 접시 2개에 링거 용액을 채웁니다.

이를 얼음 위에 둡니다. 또한 냉각하십시오. 정지 혼합액 0.5 mL와 ringer solution 약 10 mL가 들어 있는 주사기를 혼합합니다.

희생된 마우스부터 시작합니다. 두개골을 덮고 있는 피부를 제거하고, 턱선을 따라 절개한 후 머리를 은도금된 페트리 접시에 넣습니다. 스테레오 현미경 아래에 접시를 두고 메스를 사용하여 시상면으로 이분합니다.

머리의 정중선을 따라 절개하십시오. 머리의 절반을 내측이 위로 오도록 돌립니다. 비중격을 조심스럽게 제거하여 터미네이트(terminates)를 노출시키십시오.

여기서 메스와 3번 포셉을 사용하여 중격을 제거하는 확대 영상을 보여줍니다. 지방 상피가 줄지어 있는 말단 부위를 조심스럽게 제거하십시오. 55번 초정밀 포셉과 메스를 사용하여 다른 은 코팅 페트리 접시에 옮기십시오.

재구성된 상피 조직 조각을 하부의 종말 신경단에서 분리하십시오. 분리된 후각 상피 조각들을 1 mL의 0-divalent ringer 용액이 담긴 튜브로 옮기십시오. 그 다음 파파인(papain)을 첨가하십시오.

마이크로 가위를 사용하여 상피 세포를 실온에서 3분 동안 배양한 후, 마이크로 가위로 다시 부드럽게 처리합니다. 5분 더 기다린 다음, 구경이 큰 화염 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여 정지 용액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 약 1 mL의 필터 링거 용액을 첨가하고, 직경 약 1 mm의 화염 연마 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 섞어줍니다.

세포가 포함된 용액을 3개의 유리 바닥 배양 접시 중앙에 넣고 4°C에서 약 1시간 동안 세포가 가라앉도록 둡니다. 그 다음 링거 용액(ringer solution)을 첨가합니다.

주변 광선에 의한 케이지 화합물의 분해를 방지하기 위해 어두운 조명 아래에서 작업하십시오. 100 x 대물렌즈에 이머전 오일을 한 방울 도포합니다. 해리된 촉각 감각 뉴런이 담긴 글라스 바텀 디쉬 하나를 도립 현미경 퍼퓨 스테이지 위에 올립니다.

링거 용액(ringer solution)을 사용합니다. 세포 내 용액이 담긴 시린지를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하고 냉장 보관하십시오. 섬모가 온전한 단일 후각 감각 신경세포를 찾습니다.

현미경의 스테이지를 이동하여 Cary 영역이 모니터에 그려진 영역 안에 위치하도록 합니다. UV 플래시 영역을 국소화하려면 케이지 화합물이 포함된 세포 내 용액으로 패치 파이펫을 채웁니다. 파이펫을 Apache 클램프 증폭기 헤드 스테이지의 홀더에 삽입하십시오.

표준 패치 클램프 기법을 사용합니다. 패치 피펫으로 뉴런의 세포체에 접근하여 기가 실(giga seal)을 형성합니다. 그 다음 컴퓨터를 통해 홀셀(whole cell) 모드로 전환합니다.

자극 프로토콜을 시작하고 반응을 기록합니다. 전형적인 자극 프로토콜은 전압을 일정 값으로 고정(clamp)하고, UV 플래시를 트리거하여 케이지 화합물을 용해(lysis)시킵니다. 이제 몇 가지 대표적인 기록을 보여드리겠습니다. 여기 제시된 것은 cage cyclic AMP의 용해에 대한 분리된 생쥐의 지방 sensory neuron의 반응입니다.

상단의 화살표는 UV 플래시가 조사된 시점을 나타냅니다. Cycl MP에 의해 활성화된 전류는 세포 외 저칼슘 링거액에서 -60 mV에서 기록되었습니다. 전류의 상승기는 빠르게 나타났으며, 단일 지수 함수로 피팅되었습니다.

여기에서는 1mM 칼슘이 포함된 일반 링거액에 담긴 동일한 뉴런의 기록을 볼 수 있습니다. 전류의 상승 위상과 -60mV 지점이 훨씬 낮아졌으며 다상성(multiphasic)을 띠게 되었습니다. 이는 칼슘이 C-재순환 P-게이트 채널로 유입되어 이차 염화물 전류를 활성화했기 때문입니다.

본 예시에서는 전압을 +60 millivolt로 고정했습니다. 이는 칼슘 유입을 줄이는 또 다른 방법입니다. +60 millivolt에서 cyclone PN uncaging으로 인한 반응의 상승기는 단일 지수 함수로 잘 설명되었으며, 이는 단 하나의 전류 성분만이 존재함을 나타냅니다.

Celia 내부에서 칼슘을 광방출(photo releasing)하여 얻은 반응의 예가 제시되어 있으며, 이 전류는 염화 이온에 의해 운반됩니다. 전압은 -50 mV였습니다. 광강화 칼슘(cage calcium)을 점진적으로 강도가 높아지는 UV 플래시로 광방출시킴으로써 진폭이 증가하는 반응들이 유도되었습니다.

지금까지 이 절차를 수행하며 분리된 공장 sensory neurons로부터 기록하는 방법을 보여드렸습니다. 매우 인내심을 갖는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.