Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

이 실험의 전반적인 목표는 자가 혈액 유래 내피 전구 세포가 있는 혈관 임플란트를 시딩한 다음 대형 동물 모델에서 혈전증에 대한 이 치료의 효과를 관찰하는 것입니다. 이는 돼지에서 말초 혈액 샘플을 채취하여 후기 성장 돼지 내피 전구 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 다음은 이식형 장치입니다.

원리 증명 연구에서 티타늄 튜브는 자가 PC와 함께 장착됩니다. 그런 다음 이 장치를 돼지의 하대정맥에 이식합니다. 결과는 제어 및 폐색된 베어 메탈 튜브와 대조적으로 EPC 시트 티타늄 튜브의 개통을 기반으로 혈전증에 대한 보호 기능이 있음을 보여줍니다.

Duke Surgery는 획기적이고 혁신적인 연구를 육성하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 다음 프레젠테이션은 의학을 발전시키기 위해 여러 부서와 학문 분야에 걸쳐 어떻게 협력하는지 보여주는 한 가지 예입니다. Dr.EK는 혈관 장치의 혈액 접촉 표면에 환자 자신의 전구 세포를 라이닝하여 혈전증을 예방하는 세포 착석 기술을 개발하기 위한 연구를 주도해 왔습니다.

이 세포는 임플란트를 이식받을 동일한 환자에서 유래했기 때문에 면역 체계의 거부 반응을 피할 수 있습니다. 우리의 성공과 여기에 설명된 방법은 대규모 팀 노력의 결과입니다. 외과적 이식은 혈관 외과의 Sean Gage, Duke 의대생인 Whitney Lane, 그리고 저에 의해 시연될 것입니다.

이제 세포 파종 과정을 안내할 의생명공학과 박사 과정 학생인 Alexander Janssen을 소개하고자 합니다. 자세히 말씀드리자면, 돼지 모델에 이식하기 직전에 혈액 유래 내피 전구 세포로 티타늄 튜브를 파종하는 방법을 시연하겠습니다. 이 방법은 개념 증명의 역할을 하며 니티놀 스텐트 및 기계적 순환 보조 장치와 같은 다른 많은 이식 가능한 장치에 동일한 기본 원칙을 적용할 수 있습니다. EPC는 돼지 혈액의 단핵 세포 분획을 도금하여 분리되며 일반적으로 약 7일 후에 나타납니다.

그들은 전형적인 조약돌 형태로 알아볼 수 있습니다. EPC를 배양 중인 총 900만 개의 세포로 확장합니다. 준비된 EPC를 무혈청 배지에서 두 번 헹구고, 라벨링 중 및 라벨링 후에 빛 노출을 제한하도록 주의하십시오.

그런 다음 형광 라벨 PKH 26으로 세포를 덮고 용액이 얼마나 많이 적용되었는지 기록합니다. 세포를 실온에서 4분 동안 배양합니다. 1분 후에 동일한 부피의 돼지 혈청을 염료 용액에 첨가하여 라벨링 반응을 중지합니다.

결합된 용액을 전체 성장 배지로 일대일로 희석합니다. 그런 다음 액체를 흡인하고 전체 성장 배지로 세포를 세 번 헹군 다음 칼슘이나 염화마그네슘 없이 두 번 세척하고 DPBS를 헹굽니다. 다음으로, 사용된 부피를 기록하면서 트립신으로 세포를 덮고 섭씨 37도에서 배양합니다.

배양 3분 후 현미경을 사용하여 세포가 분리되었는지 확인하고, 분리된 경우 첨가된 것보다 두 배 많은 트립신 중화 용액을 추가합니다. 트립신(Trypsin)은 세포 용액을 단일 튜브에 결합하고 혈구 분석기로 세포 밀도를 측정합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 펠렛화하고 최소 4.5ml의 무혈청 배지에 세포를 재현탁합니다.

돼지의 수술을 준비한 후, 두 번째 기억샘 세트의 15번 메스 날로 정중선을 절개합니다. 크랜은 전기소작술을 사용하여 마지막에서 두 번째 세트로 이끌었습니다. 절개를 복부 근막까지 운반합니다.

모기 집게로 복막을 들어 올리고 메츠 안달 가위로 조심스럽게 들어가 방광을 외부화하고 방광 벽에 3 oh Vicryl 지갑 끈 봉합사를 놓습니다. 절개 부위 중앙을 찌르고 16 프렌치 폴리 카테터를 절개 부위에 삽입합니다. 그런 다음 정맥 주사액을 투여하여 수술 중 소변 배출량을 시간당 킬로그램당 최소 1밀리리터로 적정합니다.

다음으로, 확대된 소장을 외부화하고 두 개의 외과적 견인기를 배치하여 복막강의 후방을 노출시키고 날카롭고 뭉툭한 절개를 사용하여 IVC를 식별합니다. 주변 조직에서 IVC를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 IVC 원위 운동의 분기점에 근접한 오른쪽 신장 동맥에서 혈관을 골격화합니다.

IVC 박리 시 각별한 주의를 기울이면 IVC의 아주 작은 결함이라도 동물 결찰자의 급격한 출혈과 출혈로 이어질 수 있습니다. IVC 분절의 모든 곁가지는 IVC의 분기점 바로 근처에 있는 두 개의 큰 후방 요추 정맥을 절개하고 결찰하는 데 특별한 주의를 기울입니다. 종종 뒤쪽에 큰 요추 정맥이 있습니다.

이 정맥을 자유롭게 절개하고 혈관 고리로 제어합니다. 이제 수술과 병행하여 이 절차를 시작하기 전에 임플란트에 EPC를 파종하기 시작하십시오. 티타늄 튜브 티슈 시트 스캐폴드는 완전히 조립되어 멸균 분야에서 사용할 준비가 되어 있어야 합니다.

가스 멸균 티타늄 튜브 어셈블리를 5cc 주사기에 넣어 엽니다. 그런 다음 5cc 주사기에서 플런저를 제거하되 주사기에 고정 된 유혹 캡을 버리지 마십시오. 피펫을 사용하여 주사기에 EPC 현탁액을 채웁니다.

그런 다음 플런저를 교체하십시오. 캡을 제거하고 주사기의 루어 끝을 꼭 맞을 때까지 어셈블리의 열린 실리콘 튜브에 삽입합니다. 그러나 더 이상 기포가 헤드피스 상단에 도달할 때까지 세포 용액을 천천히 전진시켜 기포를 제거하지 마십시오.

그런 다음 루어 캡으로 어셈블리를 닫고 멸균 장갑으로 테이프로 닫습니다. 이 전체 어셈블리를 가공된 주사기 홀더에 삽입하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 게이지를 사용하여 착석 챔버가 수평을 이루고 어셈블리가 부드러운 회전으로 배양할 수 있도록 합니다.

IVC를 결찰한 직후 돼지 1kg당 헤파린 100단위를 투여하여 수술을 계속합니다. 그런 다음 즉시 IVC를 IVC와 요추 정맥 원위부로 45도 각도로 고정한 다음 근위측으로 고정합니다. 다음으로, 숫자 11 메스 날과 냄비 가위를 사용하여 근위부와 원위 클램프 사이에 4cm 세로 정맥 이토미를 만듭니다.

IVC에서 모든 혈액을 배출하고 멸균 DPBS로 내부 내강을 세척합니다. 이제 EPC 장착 임플란트 또는 베어 메탈 컨트롤을 IVC에 삽입하여 세포가 건조되는 것을 방지하고 공기를 배출합니다. IVC를 염화칼슘과 염화마그네슘으로 DPBS로 채웁니다.

그런 다음 4개의 프롤린 러닝 봉합사로 정맥 이토루를 닫고 하나의 근위 클램프를 제거하여 소량의 등 출혈을 통해 IVC를 환기시킵니다. 출혈 후 원위 클램프를 제거하여 임플란트를 제자리에 고정합니다. 정맥 벽을 통과하는 PVC 튜브에 스테이 봉합사를 적용합니다.

CT 바늘에서 OPDS로 근막을 닫습니다. 두 개의 o Vicryl이 실행되는 피하 공간을 닫습니다. 그런 다음 피부를 스테이플러로 닫습니다.

절개 부위를 따라 0.25% 마르카인을 최대 20ml까지 피하주사하고 통증을 위해 거즈와 테가덤으로 상처를 덮습니다. 독감 Nixon과 oxymorphone을 필요에 따라 피하로 투여합니다. 마취를 중단하고 돼지가 깨어나면 7일 동안 우리로 되돌려 놓는다.

예방적 항생제로 24시간마다 아트리를 투여하고 수술 전에 붙인 펜타닐 패치가 총 3일 동안 부착되어 있는지 확인하십시오. 3일 후, 장착된 티타늄 튜브 임플란트를 제거하고 내부 표면을 검사했습니다. 550 나노미터 여기 파장 미만에서 형광 표지된 세포의 합류층이 다른 튜브에서 발견되었습니다.

절편 세포는 세포 경계를 시각화하기 위해 혈소판 내피 세포 접착 마커로 추가로 염색되었습니다. 이 절차에는 다양한 얼룩을 사용할 수 있습니다. 대조적으로, 노출된 티타늄 튜브 임플란트는 하대정맥의 전혈전이 낮은 공유 환경을 완전히 가립니다.

이미지 A와 C에서 볼 수 있듯이, 세포 시트형 티타늄 튜브는 이미지 B에 나타나 있으며 응고가 없는 상태로 유지되었습니다. EPC는 배양에서 평균 7일 후에 나타납니다 수술을 수행하는 동안 IVC나 곁가지가 조금만 찢어져도 돼지의 출혈로 이어질 수 있으므로 IVC를 신중하고 부드럽게 골격화하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 다른 혈액 접촉 물질은 혈전증을 예방하기 위해 빠르게 내피 거짓말이 될 수 있습니다.

예를 들어, EPC가 있는 내피 혈관 스텐트는 혈관 벽의 기본 내벽을 모방하여 스텐트 재협착증 및 혈전증 개발 후 예방할 수 있습니다. 당사의 퀵 시(Quick see) 기술을 사용하면 수술실이나 카테터 삽입 실험실에서 몇 분 이내에 환자 자신의 혈액 유래 내피 전구 세포를 혈관 내 장치에 라이닝할 수 있습니다. 따라서 외생물 배양이 연장되었습니다.

장치 자체에 소요되는 시간을 피할 수 있으며, 이 기술은 임상 실습으로 전환하기 위해 실용화됩니다.