Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

이 실험의 전반적인 목표는 혈관 임플란트에 자가 혈액 유래 내피 전구 세포를 파종한 후, 대동물 모델에서 이러한 처리가 혈전증에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이는 돼지로부터 말초 혈액 샘플을 채취하여 후기 성장 돼지 내피 전구 세포를 분리함으로써 수행됩니다. 그다음으로, 이식 가능한 장치를 사용합니다.

본 개념 증명 연구에서는 티타늄 튜브에 자가 PC를 배치하였습니다. 그 후 해당 장치를 돼지의 하대정맥에 이식하였습니다. 결과적으로, 대조군 및 폐쇄된 베어 메탈 튜브와 달리 EPC가 배치된 티타늄 튜브의 개통성을 통해 혈전증에 대한 보호 효과가 있음이 확인되었습니다.

Duke 수술팀은 획기적이고 혁신적인 연구를 육성하는 데 전념하고 있습니다. 다음 발표는 우리가 의학 발전을 위해 부서와 학문 분야를 어떻게 가로질러 협력하는지를 보여주는 하나의 사례입니다. EK 박사는 혈관 장치의 혈액 접촉 표면을 환자의 자체 전구세포로 덮어 혈전증을 예방하는 세포 안착 기술을 개발하기 위한 연구를 이끌어 왔습니다.

이 세포들은 임플란트를 이식받을 환자와 동일한 환자로부터 유래되었으므로, 면역 체계에 의한 거부 반응을 피할 수 있습니다. 본 연구의 성과와 여기에 기술된 방법들은 대규모 팀 노력의 결과입니다. 외과적 이식 과정은 혈관외과 섹션의 Sean Gage, Duke 의대생 Whitney Lane, 그리고 제가 시연하겠습니다.

이제 의생명공학과의 박사 과정 학생인 Alexander Janssen을 소개하겠습니다. 그는 세포 파종 과정을 상세히 설명해 줄 것입니다. 저는 돼지 모델에 이식하기 직전에 혈액 유래 혈관 내피 전구세포를 티타늄 튜브에 파종하는 방법을 시연하겠습니다. 이 방법은 개념 증명 역할을 하며, 동일한 기본 원리를 니티놀 스텐트 및 기계적 순환 보조 장치와 같은 다른 많은 이식형 장치에도 적용할 수 있습니다. EPC는 돼지 혈액의 단핵구 분획을 도말하여 분리하며, 보통 약 7일 후에 나타납니다.

이들은 전형적인 자갈길 모양(cobblestone morphology)으로 식별할 수 있습니다. 배양 중인 EPC를 총 9백만 개의 세포가 되도록 확장하십시오. 준비된 EPC를 무혈청 배지로 두 번 헹구되, 표지 과정 중과 후에 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오.

그 다음 세포를 형광 표지제인 PKH 26으로 덮고, 적용한 용액의 양을 기록합니다. 세포를 상온에서 4분 동안 배양합니다. 1분 후, 염료 용액과 동일한 부피의 돼지 혈청을 첨가하여 표지 반응을 중단시킵니다.

혼합된 용액을 완전 성장 배지로 1:1 희석합니다. 그다음 액체를 흡입하여 제거하고, 완전 성장 배지로 세포를 3회 세척한 후, 칼슘 또는 염화마그네슘이 없는 DPBS로 2회 세척합니다. 이어서 사용한 부피를 기록하며 세포가 충분히 잠기도록 트립신을 처리하고 37 °C에서 배양합니다.

3분간 배양한 후, 현미경을 사용하여 세포가 분리되었는지 확인하고, 분리되었다면 첨가했던 양의 2배에 해당하는 트립신 중화 용액을 추가합니다. 트립신 처리 후, 세포 용액을 하나의 튜브에 합치고 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 원심 분리하여 펠릿(pellet)으로 만든 후, 최소 4.5 milliliters의 무혈청 배지에 세포를 재현탁합니다.

돼지의 수술 준비가 완료되면, 15번 메스 날을 사용하여 두 번째 유선 부위부터 정중선을 절개합니다. 전기 소작기를 사용하여 끝에서 두 번째 유선 세트까지 조심스럽게 절개해 나갑니다. 복막근막까지 박리를 진행합니다.

모스키토 포셉(mosquito forceps)으로 복막을 들어 올린 후 메츠-앤달 가위(mets andal scissors)로 조심스럽게 절개하여 진입하고, 방광을 외부로 노출시킨 뒤 방광벽에 3-0 Vicryl purse string 봉합사를 이용하여 주머니 봉합을 실시합니다. 봉합 중심부에 작은 절개창을 내고 16 French Foley 카테터를 삽입합니다. 그런 다음 수술 중 소변량이 시간당 체중 kg당 최소 1 mL가 되도록 정맥 수액을 투여하여 조절합니다.

다음으로, 팽창된 소장을 외부로 노출시키고 두 개의 bour 외과적 견인기를 배치하여 복강의 후면을 노출시킨 후, 예리한 박리와 둔적 박리를 통해 하대정맥(IVC)을 확인합니다. 주변 조직으로부터 하대정맥(IVC)을 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 하대정맥(IVC) 분지부의 원위부까지 오른쪽 신동맥부터 혈관을 골격화합니다.

IVC 박리 시 매우 세심한 주의가 필요합니다. IVC에 아주 작은 결함만 생겨도 동물 결찰 부위에서 급격한 출혈과 혈액 소실이 발생할 수 있기 때문입니다. IVC 분절의 모든 측지들을 결찰하십시오. 특히 IVC 분지점 직상단에 위치한 두 개의 큰 후요정맥을 박리하고 결찰하는 과정에 각별히 주의하십시오. 후면에 큰 요정맥이 존재하는 경우가 많습니다.

이 정맥을 조심스럽게 박리한 후 혈관 루프(vessel loop)로 고정합니다. 이제 수술과 병행하여, 본 절차를 시작하기 전에 EPC를 임플란트에 파종하기 시작하십시오. 티타늄 튜브 조직 안착 스캐폴드는 완전히 조립되어 멸균 구역 내에서 즉시 사용할 수 있는 상태여야 합니다.

가스 멸균된 티타늄 튜브 어셈블리를 5 cc 주사기에 장착합니다. 그런 다음 5 cc 주사기에서 플런저를 제거하되, 버리지 말고 주사기에 고정 캡을 씌웁니다. 피펫을 사용하여 주사기에 EPC 현탁액을 채웁니다.

그 다음 플런저를 다시 끼웁니다. 캡을 제거하고 시린지의 루어(lure) 끝부분을 조립체의 개방된 실리콘 튜브에 딱 맞을 때까지 삽입합니다. 그 상태에서 세포 용액을 천천히 주입하여 용액이 헤드피스 상단에 도달할 때까지 기포를 모두 제거합니다.

그런 다음 루어 캡으로 어셈블리를 닫고 멸균 장갑 내부에서 테이프로 밀봉합니다. 이 어셈블리 전체를 가공된 시린지 홀더에 삽입하고 37 °C 인큐베이터에 넣습니다. 게이지를 사용하여 시팅 챔버가 수평인지 확인하고, 어셈블리를 천천히 회전시키며 배양합니다.

돼지 체중 kg당 100 units의 헤파린을 투여한 직후 IVC 결찰 후 수술을 계속합니다. 그런 다음 즉시 IVC와 요정맥의 원위부 45도 각도에서 IVC를 클램핑하고, 이어서 근위부를 클램핑합니다. 다음으로 11번 메스 날과 포트 가위를 사용하여 근위 및 원위 클램프 사이의 정맥에 4 cm 길이의 종단면 절개술을 시행합니다.

IVC 내의 혈액을 모두 제거하고 멸균 DPBS로 내부 루멘을 세척합니다. 이제 세포의 건조를 방지하고 공기를 제거하기 위해 EPC가 도포된 임플란트 또는 베어 메탈 대조군을 IVC에 삽입합니다. IVC를 염화칼슘과 염화마그네슘이 포함된 DPBS로 채웁니다.

그런 다음 4-0 proline running suture로 정맥 절개 부위를 봉합하고, 근위부 클램프 하나를 제거하여 소량의 역출혈을 통해 IVC 내의 공기를 제거합니다. 출혈 후, 임플란트를 고정하기 위해 원위부 클램프를 제거합니다. 정맥벽을 통과하는 PVC 튜브에 stay suture를 적용합니다.

CT 바늘에 끼운 OPDS로 근막을 봉합합니다. 2-0 Vicryl을 이용해 피하 공간을 연속 봉합합니다. 그런 다음 피부 스테이플러로 피부를 봉합하여 마무리합니다.

절개 부위를 따라 0.25% Marcaine을 최대 20 milliliters까지 피하 투여하고, 통증 완화를 위해 상처 부위를 거즈와 tegaderm으로 덮습니다. 필요에 따라 flu Nixon과 oxymorphone을 피하 투여합니다. 마취를 중단하고 돼지가 깨어나면 이후 7일 동안 케이지로 복귀시킵니다.

항생제 예방 조치로 24시간마다 atri를 투여하고, 수술 전 부착한 fentanyl 패치가 총 3일 동안 부착 상태를 유지하도록 합니다. 3일 후, 식립된 티타늄 튜브 임플란트를 제거하고 내부 표면을 관찰하였습니다. 550 nm 여기 파장 하에서, 다른 튜브에서 형광 표지된 세포들의 confluent한 층이 확인되었습니다.

세포 경계를 시각화하기 위해 절편 세포를 혈소판 내피 세포 접착 마커로 추가 염색하였습니다. 이 과정에서는 매우 다양한 종류의 염색약을 사용할 수 있습니다. 이와 대조적으로, 아무런 처리를 하지 않은 티타늄 튜브 임플란트는 하대정맥의 혈전 형성 가능성이 높은 저전단 환경에서 완전히 폐쇄됩니다.

이미지 A와 C에 나타낸 바와 같이, 세포가 안착된 티타늄 튜브는 이미지 B에 표시되어 있으며 혈전이 형성되지 않은 상태로 유지되었습니다. peak blood를 이용한 당사의 분리 절차 이후, EPC는 배양 후 평균 7일 뒤에 나타납니다. 수술 절차를 수행할 때, IVC의 아주 작은 찢어짐이라도 돼지의 과다출혈로 이어질 수 있으므로 IVC와 그 분지들을 매우 조심스럽고 부드럽게 박리하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차 이후, 혈액과 접촉하는 다른 재료들은 혈전 형성을 방지하기 위해 빠르게 내피세포화될 수 있습니다.

예를 들어, 당사의 EPC를 이용한 혈관 내피 스텐트는 혈관벽의 천연 내피층을 모방하여 시술 후 스텐트 재협착 및 혈전증을 예방할 수 있습니다. 당사의 퀵 씨(quick see) 기술을 통해 수술실이나 카테터실에서 단 몇 분 만에 환자 본인의 혈액 유래 혈관 내피 전구 세포로 혈관 내 장치의 내피를 코팅할 수 있습니다. 따라서 장기간의 ex vivo 배양이 필요하지 않습니다.

장치 자체에서의 소요 시간을 줄임으로써, 이 기술은 임상 실무로의 전환을 위한 실용성을 갖추게 됩니다.