Name: Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 학습하세요 자가 내피 전구 세포를 이용한 혈관 이식물 시딩 기술과 돼지 대동맥 모델에서의 생체적합성 평가 방법을. 이 기술은 혈전 형성을 줄이고 다양한 순환기 장치의 성능을 향상시킬 수 있습니다.

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저자는 본 연구에서 사용되는 돼지의 혈청을 제공하는 이미징 티타늄 섹션과 쌍둥이 바이오 제품에 대한 자신의 귀중한 조언을 Leica Microsystems에 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 RC1HL099863 - 01 &quot;장치를 지원 순환계의 biocompatibility을 향상시키기 위해 Autologous EPC 내막&quot;부여를 통해 그들의 지원에 대한 NIH 감사드립니다. 또한, 우리는 알렉 산드라 잔츤의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 원정대의 지원에 감사하고 있습니다. 우리는 또한 수술의 여러 측면 지원 및 연구 동물의 취급에 대한 조지 빠른, 마이크 로우와 Ianthia 파커 감사 드리고. 스티븐 오웬 우리 시딩 장치의 가공 각지에서 귀중한되고 티타늄 튜브를 절단했다.

<ol><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+bleeding+and+clotting+in+the+cardiac+surgery+patient%3A+from+vascular+endothelium+to+circulatory+assist+device+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface.</a> Circulation. 122, 2068-2077 (2010).</li>
<li>Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+biology+of+bleeding+and+clotting+in+the+surgical+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient.</a> Vascular. 16, 6-13 (2008).</li>
<li>Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+plasma+contact+activation+on+silicon%2C+titanium+and+aluminium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium.</a> Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li>
<li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).</li>
<li>Ueberrueck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+ovine+and+porcine+animal+models+for+biocompatibility+testing+of+vascular+prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses.</a> J Surg Res. 124, 305-311 (2005).</li>
<li>Velik-Salchner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+values+for+thrombelastography+%28ROTEM%29+and+selected+coagulation+parameters+in+porcine+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood.</a> Thromb Res. 117, 597-602 (2006).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAchneck%2C+HE+%22American+Heart+Association+Scientific+Sessions%2C+Abstract+Oral+Sessions%2C+Medical+Aspects+End+Stage+Heart+Failure%3A+Transplantation+and+Device+Therapies%22">American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies</a>. , (2010).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold%2Fpalladium+coating+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).</li>
<li>Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+and+125I-PKH95%3A+characterization+and+efficacy+as+labels+for+in+vitro+and+in+vivo+endothelial+cell+localization+and+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking.</a> J Surg Res. 62, 23-28 (1996).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 세포 시딩 티 튜브의 방법은 신속하고 균일하게 endothelialize으로 의사와 과학자들을 수 있도록 혈액을 연락 implantable 장치의 표면. 우리가 분리하고 주변의 혈액 샘플에서 EPCs를 확장하고 있기 때문에, 더 큰 침략 절차는 이러한 세포를 수확하기 위해 필요하지 않습니다. 또한, EPCs는 autologous 않으므로 셀 씨앗 주입 어떤 면역 반응의 위험이 제거됩니다. 그 프로토콜에 보여준 원칙은 티 튜브에 대한뿐만 아니라 심혈관 의학에서 널리 많은 다른 biomaterials, 활용하실 수 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 우리가 발견한 것처럼, 티 튜브의 세심한 청소하는 오염 물질 타협 셀 준수의 자기편 필름. 또한, 느린 회전 속도가 (튜브 직경에 반비례) 시딩 과정에서 필수적이며, 그러한 것을 EPCs이 서서히 정착하고 티 튜브가 움직이는으로 표면을 준수합니다. 이식 직전 시딩 우리의 방법은 허무 전직의 생체내 문화 시간을 피할 수, 세포가 개별적으로 준수하고 나중에 즉시 흐름의 다시 설립 다음 시트로 embolization의 가능성을 피하기 위해, 생체내에 합류 시트를 형성하고 있습니다. 우리의 이전 연구 EPCs가 합류 레이어 성장되면, 그들은 또한 내피 시트의 모든 가능한 sloughing을 최소화들이 단단히 준수 엑스트라 세포 매트릭스를 만들 것을 보여줍니다. embolic 분리의 가능성을 완전히 배제할 수 없다지만, 이것은 전체 장치 표면의 혈전증보다 가지각색의 낮은 위험이 치료가되지 않도록 설계되는 문제 같습니다. 낮은 전단에 주입 우리의 접근 방식은, 하부 대정 맥의 prothrombotic 환경 혈액 호환성 및 장치 5,6의 혈전증을 연구에 대한 가장 신뢰할 수있는 큰 동물 모델 중 하나를 사용합니다. 모든 동물의 보호와 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소와 듀크 대학은 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인 이후에 따라 실시합니다. 성공적으로 biomaterials 및 장치를 테스트하기 위해이 주입 방법을 이용하기 위해서는 인내 IVC 세그먼트를 해골로 만들다 및 장치 주변에는 출혈이 &#39;잘못된 루멘&#39;에서 유래없는 이러한 장치 삽입을위한 준비의 모든 정맥 분기 선박을 ligate하는 것이 중요합니다. 또 다른 중요한 단계는 내부 튜브 표면에 세포가 veinotomy의 폐쇄하는 동안 습기가 남아 reperfusion이 시작되기 전에 이러한 장치 루멘에 DPBS의 추가입니다. 장치가 입력된 위치에서 찾을 수없는 경우, 그것은 IVC에서 &#39;업스트림&#39;마이 그 레이션 할 수 있습니다. PVC 관의 3mm 섹션 튜브가 단단히 현재의 위치에 고정되도록 - 이것은 정맥 벽 통해 2를 통해 봉합 (4 - O Prolene)를 배치하여 예방할 수 있습니다. 연구자가 별도로 특허 튜브 explantation 후 그림 8에 표시된 찬란 사전 라벨 세포를 찾는 데 어려움이 있으면 그것은 세포가 일관된 시트에서 벗겨 가지고 가능성이 높습니다. 이것은 튜브와 함께 정맥을 고정 후, 3 티 튜브 섹션의 주변 혈관 및 창피 - 조립 매우 부드러운 절개로 막을 수 있습니다. 우리의 기술은 EPC - 시딩을 통해 심장 혈관 장치 혈전증을 방지하기위한 증명 개념을 제공합니다. 이 기술은 환자 자신의 내피 전구 세포로 늘어선 &#39;biogenic&#39;임플란트의 개발에 사용할 수 있습니다. 우리 돼지의 동물 모델의 타당성 연구는 임상 실천에이 &#39;맞춤형 의약품&#39;의 번역위한 첫 번째 단계를 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사명 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Boehringer Ingelheim - </td><td> BIC670025 </td><td> NAC # 10280002 </td></tr><tr><td> Alconox 전원 정밀 클리너 </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> 발포어 외과 견인기 </td><td> 애들러 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Baytril </td><td> 바이엘 </td><td> APVMA 46028/0705 </td><td></td></tr><tr><td> 버터플라이 니들 (19G) </td><td> Terumo </td><td> SV19CLK </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhexidine </td><td> 3M </td><td> 9200 </td><td></td></tr><tr><td> 클램프 (45도) </td><td> Aesculap </td><td> FC339T </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (-/-) </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (+/+) </td><td> Gibco </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> DuraPrep </td><td> 3M </td><td> 8635 </td><td></td></tr><tr><td> EBM - 2 중간 </td><td> Lonza </td><td> CC - 3156 </td><td> 모두 혈청 자유롭고 완전하게 성장 매체에 대한 자료 </td></tr><tr><td> EGM - 2 SingleQuots </td><td> Lonza </td><td> CC - 3162 </td><td> 모두 혈청 자유롭고 완전하게 성장 매체에 EBM - 2와 함께 사용 </td></tr><tr><td> Electrocautery 도구 </td><td> Valleylab </td><td> SurgII - 20 </td><td></td></tr><tr><td> 사포 </td><td> 3M </td><td> 60-0700-0425-8 </td><td> 240 그릿 </td></tr><tr><td> Euthasol의 안락사 솔루션 </td><td> Virback 동물 보건 </td><td></td><td> 아나다 # : 200-071 </td></tr><tr><td> 펜타 닐 패치 </td><td> Actavis </td><td></td><td> NDC # 67767-120-18 </td></tr><tr><td> Flunixin </td><td> 셔링 - 플로 </td><td></td><td> NAC # : 10470183 </td></tr><tr><td> 폴리 카테터 (16F) </td><td> 음유 시인 </td><td> 730116 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> 시그마 </td><td> H8264 - 500ML </td><td></td></tr><tr><td> 히트 건 </td><td> 밀워키 </td><td> 8988-20 </td><td></td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td></td><td></td><td> NDC # : 25021 </td></tr><tr><td> Histopaque - 1077 </td><td> 시그마 </td><td> H8889 - 500ML </td><td></td></tr><tr><td> 삽관법 튜브 </td><td> Mallinckrodt </td><td> 86,113 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> MWI, 메리디언 </td><td></td><td> NDC # 13985-030 </td></tr><tr><td> IV 카테터 (18G) </td><td> 백톤 디킨슨 - </td><td> 381547 </td><td></td></tr><tr><td> 케타민을 </td><td> 포르 다지 </td><td></td><td> NDC # 0856-2013 </td></tr><tr><td> 레벨 </td><td> 스완슨 </td><td> LLA001 </td><td></td></tr><tr><td> Luer - 잠금 팁 모자 </td><td> CML 공급 </td><td> 909-001 </td><td></td></tr><tr><td> Marcaine </td><td> Hospira </td><td></td><td> NDC # : 0409-1560-10 </td></tr><tr><td> Metzenbaum 가위 </td><td> 애들러 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 introducer (5 층) </td><td> 갤트 </td><td> KIT 002-01 </td><td></td></tr><tr><td> 모기 집게 </td><td> 애들러 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 모터 </td><td> Herbach 및 Rademan </td><td> H1 - 08 </td><td></td></tr><tr><td> Oxymorphone </td><td> 엔도 실험실 </td><td></td><td> NDC : 63481-624-10 </td></tr><tr><td> PKH26 다이 키트 </td><td> 시그마 </td><td> PKH26GL - 1KT </td><td></td></tr><tr><td> 돼지의 혈청 </td><td> 쌍둥이 바이오 제품 </td><td> 100-115 </td><td> 전체 성장 매체 2 % 농도 </td></tr><tr><td> 포츠 가위 </td><td> 애들러 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 정확한 비스타 스킨 스테플러 </td><td> 3M </td><td> 3998 </td><td></td></tr><tr><td> PVC 관 </td><td> McMaster-Carr/Insultab </td><td> 7132K117 </td><td> ID 15.88 mm를 확장 복구 ID 7.95 mm </td></tr><tr><td> 직각 중간 크기 </td><td> 애들러 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 메스 블레이드 (# 10-15) </td><td> 음유 시인 </td><td> 373910 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 튜브 </td><td> 맥매스터 - 카 </td><td> 51735K26 </td><td> 16.64 mm OD, 9.52 mm ID를 </td></tr><tr><td> 주사기 (5 CC) </td><td> 백톤 - 디킨슨 (BD) </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Tegaderm </td><td> 3M </td><td> 90,001 </td><td></td></tr><tr><td> 세 방향 꼭지 </td><td> 켄들 </td><td> 170060 </td><td></td></tr><tr><td> 티 튜브 </td><td> Tico 티타늄 </td><td> N / A </td><td> 로 ½ &quot;OD, 0.065&quot;벽, 0.370 &quot;ID, 0.1737 파운드 / 피트 지정 </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Lonza </td><td> CC - 5012 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 중화 솔루션 (TNS) </td><td> Lonza </td><td> CC - 5002 </td><td> 0.03 % </td></tr><tr><td> Vetropolycin </td><td> Pharmaderm 동물 보건 </td><td></td><td> NAC # : 12920110 </td></tr><tr><td> Vicryl 봉합사 (3-0) </td><td> Ethicon </td><td> J808T </td><td></td></tr><tr><td> 워터 목욕 Sonicator </td><td> 브랜슨 </td><td> B200 </td><td></td></tr></tbody></table>

autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 biocompatibility 테스트

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable 심혈관 장치 thromboemboli 형성 하나, 둘, 셋의 위험을 제기 인공 재료 (예 : 티타늄 (TI), polytetrafluoroethylene 확장)에서 제조됩니다. 우리는 autologous 혈액 파생 인간이나 돼지의 내피 전구 세포 (EPCs) 4 티 튜브의 내부 표면을 줄 수있는 방법을 개발했습니다. 돼지는 하부 대정 맥 (IVC)에 돼지의 EPCs의 합류 레이어를 포함 티 튜브를 이온 주입함으로써, 우리는 대형 동물 모델의 prothrombotic 환경에서 셀 씨앗 표면의 개선 biocompatibility를 테스트하고 수정되지 않은 노출된 금속 표면에 비해 5,6,7 (그림 1). 이 방법은 주입의 분 이내에 장치를 endothelialize 및 생체내에서 antithrombotic 함수를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 주변 혈액 50kg 요크셔 돼지와 EPCs 4,8를 분리 교양의 mononuclear 세포 분율로부터 얻은 것입니다. 티 튜브 (9.4 mm ID는) 3 4.5 cm 세로 섹션으로 미리 잘라 열 수축 튜브로 재조 립했다. 시딩 장치 티 튜브의 느린 회전을 허용하는, 건설되었습니다. 우리는 돼지에 개복술을 수행하고 대장과 방광을 externalized. 샤프하고 무딘 절개는 근위 오른쪽 신장 동맥 말초의 분기점에서 IVC를 해골로 만들다하는 데 사용되었다. 티 튜브는 다음 균일한 셀 - 코팅 9 10 달성 피 X 30 분에서 EPC 정지 및 회전 autologous 찬란 - 라벨로 가득 차 있었다. 100 USP / kg 헤파린의 관리 후, I​​VC 및 요추 정맥의 양쪽이 고정되어 있었다. 4cm의 veinotomy이 수행되고 장치가 삽입 인산염 버퍼 호수로 가득했습니다. veinotomy가 4-0 Prolene 실행 봉합과 폐쇄되면서 하나의 클램프는 데 공기 IVC로 제거되었습니다. 프로 시저의 끝에, 근막이 0 - PDS (polydioxanone 봉합)와 approximated 되었음 피하 공간 2-0 Vicryl로 닫히고 피부 폐쇄 잘라. 3 이후 - 21 일, 돼지가 euthanized 있었다 엉 - 블록을 explanted 및 고정 장치. 티 튜브는 분해 및 내부 표면은 형광 현미경으로 몇 군데 있었다. 우리는 EPC - 씨앗을 품고 튜브 특허 남은 반면, 베어 메탈 티 튜브가 완전히 occluded 것으로 나타났습니다. 또한, 우리는 내부 혈액 접촉 표면에 EPCs의 합류 레이어를 증명할 수 있었다. 결론, 우리의 기술은 장치의 혈전증을 방지하기 위해 autologous EPCs와 함께 주입 몇 분 이내에 티 튜브를 endothelialize하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 외과 방법은 최소한의 혈액 손실 및 EPC - 씨앗 표면 장애와 같은 수정된 장치의 개선 biocompatibility 테스트를 허용합니다.

혈액 - 문의 autologous 세포 및 시험 biocompatibility과 biomaterials 것은 시딩의 티타늄에 대한 방법을 설명합니다. 이 방법은 돼지의 venae cavae에 주입 수술의 분 이내에 씨앗 내피 전구 세포와 티타늄 튜브를 사용합니다. 이 기술은 다른 많은 implantable 생명 의학 장치에 적용할 수 있습니다.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

이식형 심혈관 장치는 인공 재료(예: 티타늄(Ti), 확장 폴리테트라플루오로에틸렌)로 제작되며, 이는 ...의 위험을 초래합니다.

본 실험의 전반적인 목표는 혈관 임플란트에 자가 혈액 유래 내피 전구 세포를 파종한 후, 대동물 모델에서 이러한 처치가 혈전 형성에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 돼지의 말초 혈액 샘플을 채취하여 후기 성장 돼지 내피 전구 세포를 분리합니다. 그다음으로, 이식 가능한 장치를 준비합니다.본 개념 증명 연구의 티타늄 튜브에는 자가 PC가 안착되어 있습니다. 이후 이 장치를 돼지의 하대정맥에 이식합니다. 결과에 따르면, 대조군 및 폐쇄된 베어 메탈 튜브와 달리 EPC가 안착된 티타늄 튜브의 개통성을 통해 혈전증에 대한 보호 효과가 있음이 나타났습니다.Duke surgery는 획기적이고 혁신적인 연구를 육성하는 데 전념하고 있습니다. 다음 발표는 의학 발전을 위해 우리가 어떻게 여러 학과와 학제 간 협업을 수행하는지를 보여주는 한 가지 사례입니다. EK 박사는 혈관 장치의 혈액 접촉 표면을 환자 자신의 전구세포로 코팅하여 혈전증을 예방하는 세포 시팅(cell seating) 기술을 개발하는 연구를 이끌어 왔습니다.이 세포들은 임플란트를 이식받을 환자와 동일한 환자로부터 유래되었으므로, 면역 체계에 의한 거부 반응을 피할 수 있습니다. 본 연구의 성과와 여기에 기술된 방법들은 대규모 팀의 협력 결과입니다. 외과적 이식 과정은 혈관 외과 섹션의 Sean Gage와 듀크 대학교 의대생인 Whitney Lane, 그리고 본 연구자가 시연하겠습니다.이제 의생명공학과 박사 과정생인 Alexander Janssen 씨를 소개하겠습니다. Janssen 씨가 세포 시딩 과정을 자세히 안내해 드릴 것입니다. 저는 돼지 모델에 이식하기 직전에 티타늄 튜브에 혈액 유래 내피 전구 세포를 시딩하는 방법을 시연하겠습니다. 이 방법은 개념 증명 역할을 하며, 동일한 기본 원리를 니티놀 스텐트 및 기계적 순환 보조 장치와 같은 다른 많은 이식 가능 장치에 적용할 수 있습니다. EPC는 돼지 혈액의 단핵구 세포 분획을 도말하여 분리하며, 보통 약 7일 후에 나타납니다.이들은 전형적인 자갈 모양(cobblestone)의 형태학적 특징으로 식별할 수 있습니다. 배양된 EPC를 총 900만 개의 세포 수가 될 때까지 증식시킵니다. 준비된 EPC를 무혈청 배지로 두 번 헹구며, 라벨링 도중 및 이후에 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오.그런 다음 형광 라벨인 PKH 26으로 세포를 덮고, 적용된 용액의 양을 기록합니다. 세포를 상온에서 4분 동안 배양합니다. 1분 후, 염료 용액에 동일한 부피의 돼지 혈청을 첨가하여 라벨링 반응을 중단시킵니다.혼합된 용액을 완전 성장 배지로 1:1 비율로 희석합니다. 그런 다음 액체를 흡입하여 제거하고, 완전 성장 배지로 세포를 3회 헹군 뒤, 칼슘 또는 염화마그네슘이 포함되지 않은 DPBS로 2회 세척합니다. 이어서 사용한 부피를 기록하며 세포가 trypsin에 잠기도록 덮어준 후 37 °C에서 배양합니다.3분간 배양한 후, 현미경을 사용하여 세포가 탈락했는지 확인하고, 탈락했다면 첨가한 양의 두 배에 해당하는 트립신 중화 용액을 추가합니다. 트립신 처리 후, 세포 용액을 하나의 튜브에 합치고 혈구계수기로 세포 밀도를 측정합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 원심 분리하여 펠렛화하고, 최소 4.5 milliliters의 무혈청 배지에 세포를 재현탁합니다.수술을 위해 돼지를 준비시킨 후, 두 번째 유선부터 15번 메스 날을 사용하여 정중선을 절개하십시오. 전기소작기를 사용하여 끝에서 두 번째 유선까지 조심스럽게 절개해 나갑니다. 복막 근막까지 박리를 진행하십시오.모스키토 포셉으로 복막을 들어 올리고 메츠 가위로 조심스럽게 절개하여 방광을 외부로 노출시킨 후, 방광벽에 3-0 Vicryl을 이용해 주머니 봉합(purse string suture)을 시행합니다. 봉합사 중심부에 작은 절개를 넣고 16 French Foley 카테터를 삽입합니다. 그 다음, 수술 중 소변량이 시간당 킬로그램당 최소 1mL가 되도록 정맥 수액을 투여하여 조절합니다.다음으로, 확장된 소장을 외부로 노출시키고 두 개의 bour 외과용 견인기를 배치하여 복강의 후면을 노출시킨 뒤, 예리한 박리와 둔적 박리를 통해 IVC를 식별합니다. 주변 조직으로부터 IVC를 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 IVC 분기점의 원위부에서 우측 신동맥까지 혈관을 골격화합니다.IVC 해부 시 매우 세심한 주의가 필요합니다. IVC에 아주 작은 결함만 생겨도 급격한 출혈과 동물의 과다출혈로 이어질 수 있기 때문입니다. IVC 분절의 모든 측분지들을 결찰하십시오. 특히 IVC 분기점 바로 근위측에 위치한 두 개의 큰 후요정맥을 해부하고 결찰할 때 특별히 주의하십시오. 후측에 큰 요정맥이 존재하는 경우가 많습니다.이 정맥을 주변 조직과 분리하여 박리한 후 혈관 루프로 고정합니다. 이제 수술과 병행하여, 본 절차를 시작하기 전에 임플란트에 EPC를 파종하기 시작합니다. 티타늄 튜브 조직 안착 스캐폴드는 완전히 조립되어 멸균 구역 내에서 사용할 준비가 되어 있어야 합니다.가스 멸균된 티타늄 튜브 어셈블리를 5 cc 주사기에 넣습니다. 그다음 5 cc 주사기에서 플런저를 제거하되, 버리지 말고 주사기에 고정된 캡을 씌워 둡니다. 피펫을 사용하여 주사기에 EPC 현탁액을 채웁니다.그런 다음 플런저를 다시 끼웁니다. 캡을 제거하고 시린지의 루어 끝부분을 어셈블리의 개방된 실리콘 튜브에 딱 맞을 때까지 삽입합니다. 더 이상 삽입하지 말고, 세포 용액을 헤드피스 상단까지 천천히 밀어 올려 기포를 제거합니다.그 다음 루어 캡으로 조립체를 닫고 멸균 장갑을 낀 상태에서 테이프로 밀봉합니다. 이 조립체 전체를 가공된 시린지 홀더에 삽입하고 37 °C 인큐베이터에 넣습니다. 게이지를 사용하여 시팅 챔버의 수평을 맞추고, 조립체를 천천히 회전시키며 배양합니다.하대정맥(IVC)을 결찰한 직후, 돼지 체중 1kg당 100단위의 헤파린을 투여하여 수술을 계속합니다. 그런 다음 하대정맥과 요정맥의 원위부와 근위부를 45도 각도로 즉시 클램프로 고정합니다. 이어서 11번 메스 날과 포트 가위를 사용하여 근위부와 원위부 클램프 사이에 4cm 길이의 종방향 정맥 절개술을 시행합니다.IVC 내의 혈액을 모두 제거하고 멸균된 DPBS로 내강을 세척합니다. 이제 세포가 건조되는 것을 방지하고 공기를 제거하기 위해 EPC가 안착된 임플란트 또는 베어 메탈 대조군을 IVC에 삽입합니다. IVC를 염화칼슘과 염화마그네슘이 포함된 DPBS로 채웁니다.그다음 4-0 prolen 연속 봉합사로 정맥 절개부를 폐쇄하고, 근위측 클램프 하나를 제거하여 소량의 역혈을 통해 IVC 내의 공기를 제거합니다. 출혈 후, 임플란트를 제자리에 유지하기 위해 원위측 클램프를 제거합니다. 정맥벽을 통과하는 PVC 튜브에 고정 봉합사를 적용합니다.CT 바늘에 끼운 OPDS를 사용하여 근막을 봉합합니다. 2-0 Vicryl을 이용해 피하 공간을 연속 봉합합니다. 그런 다음 피부 스테이플러로 피부를 봉합합니다.절개 부위를 따라 0.25% Marcaine을 최대 20 milliliters까지 피하 투여하고, 통증 완화를 위해 상처 부위를 거즈와 tegaderm으로 덮어줍니다. 필요에 따라 flu Nixon과 oxymorphone을 피하 투여합니다. 마취를 중단하고 돼지가 깨어나면 향후 7일 동안 케이지로 돌려보냅니다.항생제 예방 조치로 24시간마다 atri를 투여하고, 수술 전 부착한 fentanyl 패치가 총 3일 동안 잘 부착되어 있도록 합니다. 3일 후, 매립된 티타늄 튜브 임플란트를 제거하고 내부 표면을 검사했습니다. 550 nanometer 여기 파장에서, 다른 튜브 내에 형광 표지된 세포들이 밀집된 층을 형성하고 있는 것이 확인되었습니다.세포 경계를 시각화하기 위해 절편 세포를 혈소판 내피 세포 접착 마커로 추가 염색하였습니다. 이 과정에는 매우 다양한 염색법을 사용할 수 있습니다. 이와 대조적으로, 아무런 처리를 하지 않은 티타늄 튜브 임플란트는 하대정맥의 혈전 형성 가능성이 높은 저전단 환경에서 완전히 폐색됩니다.이미지 A와 C에 나타난 바와 같이, 세포가 안착된 티타늄 튜브는 이미지 B에 제시되어 있으며 혈전이 생성되지 않은 상태로 유지되었습니다. 돼지 혈액을 이용한 당사의 분리 절차 이후, 배양 7일 평균 시점에 EPC가 나타납니다. 수술 절차를 수행할 때 IVC를 조심스럽고 부드럽게 박리하는 것이 매우 중요한데, 이는 IVC나 그 분지에서 아주 작은 찢어짐만 발생해도 돼지의 과다출혈로 이어질 수 있기 때문입니다. 이 절차 이후, 다른 혈액 접촉 재료들은 혈전 형성을 방지하기 위해 빠르게 내피화될 수 있습니다.예를 들어, 당사의 EPC를 이용한 혈관 내피 스텐트는 혈관벽의 천연 내피층을 모방하여, 시술 후 스텐트 재협착 및 혈전 형성을 방지할 수 있습니다. 당사의 quick see 기술을 통해 수술실이나 카테터 삽입실에서 단 몇 분 만에 환자의 혈액 유래 혈관 내피 전구세포로 혈관 내 장치의 내피를 형성할 수 있습니다. 따라서 장기간의 ex vivo 배양이 필요하지 않습니다.장치 자체에서의 체류 시간을 최소화함으로써, 이 기술은 임상 실무로 전환하기 위한 실용성을 갖추게 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)은 혈관 항상성 및 수리를 공부하는 유망 도구입니다.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

여기서 우리는 인간의 코드 혈액 유래 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs) 및 골수 - 유래 subcutaneously immunodeficient 마우스로 콜라겐 / fibronectin 겔에 포함된 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)를,.을 제공하는 방법을 설명 이 셀 / 젤 조합은 마우스 vasculature와 연결하는 인간의 혈관 네트워크를 생성합니다.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

세포 및 분자 neotissue 형성에 대한 우리의 지식을 개선하기 위해, TEVG의 쥐 모델은 최근에 개발되었다. 이식은 C57BL / 6 마​​우스의 신동맥 대정맥 개재 이식으로 이식되었다. 이 모델은 우리의 임상 연구에서 달성 된 것과 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 훨씬 단축 된 시간 과정을 통해.

마우스 모델에서 하대 정맥 끼어 이식의 주입

동물의 희생까지 생체 내에서 엔드 - 투 - 엔드 문합 및 실시간 디지털 평가를 사용하여 양의 경동맥에 조직 설계된 선박 (TEVs)의 상호 위치 배치를위한 단계별 프로토콜입니다.

티슈 엔지니어링 혈관 이식 및 이후의 이식을위한 수술 기법<em&gt; 생체</em&gt; 모니터링

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

우리는 고립과 잘 특성화 된 환경에서 생체 내에서 혈관을 분석하기위한 모델로서 동정맥 (AV) 루프의 생성을위한 미세 수술 방법을 설명합니다. 이 모델은뿐만 아니라 혈관 신생의 조사에 유용 할뿐만 아니라 최적의 엔지니어링 축 방향으로 혈관 및 이식 가능한 조직에 적합합니다.

소형 동물 모델에서의 동정맥 (AV) 루프는 혈관 신생과 혈관을 조성한 조직 공학을 공부하기

현재 어떤 종류 vascularized 복합 allotransplantation의 긴-장기-면역 억제, 어려운 생활을 경계 표시에 대 한 지원에 따라 달라 집니다. 선물이 새로운 돼지 tibial VCA 모델 뼈 VCA를 공부 하 고 장기 면역 변조 없이 뼈 생존을 유지 하기 위해 수술 신생의 사용 방법을 설명 하는 데 사용할 수 있습니다.

돼지 Tibial Allotransplantation 외과 신생: 새로운 큰 동물 뼈 나가도록 복합 Allotransplantation 모델

여기에서, 우리는 새로운 심장 보호 전략을 조사하기 위하여 확고하게 확립되고 이용된 정형포피성 심혼 이식의 전임상 대형 동물 (돼지) 모형을 기술합니다.

정형외 심장 이식의 전 임상 돼지 모델

이 프로토콜은 심부전 모델링하는 경질 마우스의 에피카듐에 3D 생체 인쇄 패치를 이식하는 것을 목표로합니다. 그것은 마취에 관한 세부 사항을 포함, 수술 가슴 개폐, 왼쪽 전방 내림차순 (LAD) 관상 동맥의 영구 결찰 및 심장의 경각진 영역에 생체 인쇄 패치의 적용.

심근 경색의 뮤린 모델에서 3D 생체 인쇄 패치의 이식

여기에서는 커프 기법을 사용하여 조직 공학 혈관 이식편을 마우스 경동맥에 이식하기 위한 프로토콜을 제시하여 혈관 조직 재생 메커니즘을 조사하는 데 적합한 동물 모델을 제공합니다.

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이 연구는 대퇴 동맥의 소구경 이식편을 평가하기 위한 돼지 모델을 제시합니다. 이 모델은 인간의 혈관 역학을 모방하고 이식편 개통성, 혈류역학 및 혈관 리모델링을 종합적으로 평가합니다. 혈관 이식편을 검사하고 도플러 초음파 및 혈관 조영술로 모니터링할 수 있는 유용한 플랫폼을 제공합니다.

소구경 혈관 이식편을 테스트하기 위한 돼지 모델에 대퇴 혈관 이식편 이식

학습하세요 자가 내피 전구 세포를 이용한 혈관 이식물 시딩 기술과 돼지 대동맥 모델에서의 생체적합성 평가 방법을. 이 기술은 혈전 형성을 줄이고 다양한 순환기 장치의 성능을 향상시킬 수 있습니다.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

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