인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

본 영상에서는 일차 배양된 인간 기억 섬유아세포로부터 암 관련 섬유아세포(carcinoma associated fibroblasts, CAF)를 생성하는 절차를 설명합니다. 섬유아세포 암종은 신생물 세포와 스트로마(stroma)라고 불리는 비암성 구획으로 구성된 복잡한 조직입니다. 종양 관련 스트로마는 세포외 기질과 섬유아세포, 근섬유아세포, 내피세포, 기생충 및 백혈구를 포함한 다양한 스트로마 세포로 구성됩니다. 암 관련 섬유아세포는 종양 내에 존재하는 활성화된 섬유아세포의 특징인 근섬유아세포가 풍부합니다.

기질 세포는 종양 진행을 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다. 이러한 세포는 먼저 축소 유방 성형술을 통해 얻은 건강한 유방 조직에서 일차 인간 유방 섬유아세포를 분리함으로써 인비트로(in vitro)에서 생성할 수 있습니다. 획득한 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리시킨 후, 바이러스 형질전환을 통해 불멸화하고 GFP와 puromycin 저항성 유전자를 발현하도록 제작합니다.

그 다음, 세포를 인간 유방암 MCF-7 RA 세포와 함께 면역 결핍 마우스의 피하로 공동 주입합니다. 주입된 인간 메모리 섬유아세포는 종양 촉진 CAF 근섬유아세포로 분화하게 됩니다.

그 다음으로 모체 휴먼 유방 섬유아세포를 종양 이종이식편에서 추출하여 puromycin 존재 하에 배양합니다. 이렇게 생성된 puromycin 내성 세포를 실험적으로 생성된 CAF(Cancer-Associated Fibroblasts) 또는 exp CAF라고 합니다. 면역조직화학 분석 결과, 초기에 존재했던 정상 휴먼 유방 섬유아세포가 종양 이종이식편 내에서 종양 발생을 촉진하는 능력을 획득한 CAF 근섬유아세포로 진화했음이 밝혀졌습니다. 유방암 환자로부터 일차 CAF를 추출하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 종양 공동 이식을 통해 휴먼 유방 섬유아세포로부터 CAF를 실험적으로 생성할 수 있다는 것입니다.

시연 절차를 보여줄 일반 모델은 제 연구실의 박사후 연구원인 Kar와 박사 과정 학생인 Ahmed Kar입니다. 축소 유방 성형술로 절제한 건강한 인간 유방 조직 1g으로 시작하십시오. 조직을 PBS로 여러 번 세척한 다음, 15cm 페트리 접시에 넣고 멸균 면도날을 사용하여 1.5mm³ 미만 크기의 작은 조각으로 잘게 다집니다.

다음으로, 면도날을 사용하여 조직 파편을 조직 0.5g당 10mL의 세포 해리 버퍼가 들어 있는 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 최대 속도로 1분 동안 볼텍싱합니다. 튜브를 37°C 인큐베이터 내의 로커에 놓고 조직 파편이 12~18시간 동안 소화되도록 둡니다.

다음 날에도 튜브 내에는 소화되지 않은 조직 조각들이 많이 남아있을 것입니다. 먼저 최대 속도로 볼텍싱한 후, 튜브를 벤치탑에 놓고 상온에서 5분간 흔들지 않고 배양합니다. 배양 후, 5 mL 생리적 피펫을 사용하여 기질 세포가 농축된 상층액을 새로운 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 기질 분획을 250 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후 세포 펠릿을 PBS에 재현탁하고, 다시 250 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 이어서 펠릿을 10% FCS가 첨가된 DMEM에 재현탁하여 15 cm 페트리 접시에 옮깁니다.

세포를 37°C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 8~10일 후, 세포가 confluence 상태가 되어야 합니다. 이 시점에 세포를 수확하여 장기 보관을 위해 동결할 수 있습니다.

분리된 일차 인간 정상 기억 섬유아세포를 불멸화하려면, H turt와 GFP를 모두 발현하는 레트로바이러스 P MIG 벡터를 도입하십시오. 세포를 4~5일 동안 배양한 후 유세포 분석법을 사용하여 GFP 양성 세포를 분리하십시오. 이후 GFP로 표지된 불멸화 섬유아세포에 퓨로마이신 저항성 유전자를 인코딩하는 레트로바이러스 P babe puro 컨스트럭트를 도입하십시오. 최종 농도가 1 µg/mL인 퓨로마이신 존재 하에 세포를 5~7일 동안 배양하십시오.

GFP가 표지된 purmycin 내성 불멸화 인간 기억 섬유아세포를 분리합니다. 다음으로, 섬유아세포가 GFP 및 purmycin 내성을 인코딩하는 유전자의 수평 전이를 유발할 수 있는 활성 바이러스를 생성하는지 확인합니다. 6cm 페트리 접시에 2.5 × 10⁵개의 purmycin 내성 불멸화 인간 기억 섬유아세포를 배양하고 2일 동안 성장시킵니다.

공극 크기가 0.45 micron인 시린지 필터로 섬유아세포 조건 배지를 수집하고 여과합니다. 그런 다음 이를 10.5T mouse fibroblast cell에 첨가하고, 바이러스 감염 효율을 높여주는 5 µg/mL protein sulfate가 포함된 상태에서 12시간 동안 배양합니다. 12시간이 지나면 배지를 10% FCS가 보충된 DMEM으로 교체하고 추가로 2일 동안 배양합니다.

형광 현미경으로 세포를 관찰하십시오. GFP 바이러스에 감염된 세포의 약 10%에서 15%가 GFP 양성으로 나타날 것입니다. 이제 배지를 교체하여 1 µg/mL 농도로 세포를 처리하십시오.

5~7일 동안 purmycin을 처리합니다. 다시 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 purmycin 내성 tent and a half 세포가 콜로니를 형성했는지 확인합니다. 부모 세대인 purmycin 내성 GFP 표지 인간 유선 섬유아세포에서 생성된 활성 바이러스에 의한 수평 유전자 전달로 인해 주변의 purmycin 감수성 마우스 세포 및 암세포가 내성을 갖게 될 수 있음에 유의하십시오.

종양 이종이식편 내에서ピュー라마이신(purmycin) 내성 및 GFP 양성 반응이 나타납니다. 이는 면역결핍 마우스에 주입하기 위한 암 관련 섬유아세포를 실험적으로 생성하기 위해, 종양 이종이식편으로부터 주입된 GFP 표지ピュー라마이신 내성 인간 유선 섬유아세포를 분리하는 과정을 방해할 수 있습니다. 먼저 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 방금 준비한 인간 유선 세포주와 인간 유방암 세포주 MCF seven RAs를 넣고 트립신 처리 및 세포 수를 측정하는 것으로 시작하십시오.

주입당 50% matrigel이 포함된 400 µL의 배양 배지에서 1 × 10⁶개의 mc77 RA human breast carcinoma 세포와 3 × 10⁶개의 GFP 표지 purmycin 내성 immortalized human mammary fibroblasts를 재현탁합니다. 대조군으로서 튜브를 얼음 위에 둡니다.

마찬가지로 MCF seven RA 세포가 포함되지 않은 인간 유방 섬유아세포도 준비합니다. 다음으로 27게이지 바늘을 사용하여, calfs 표현형의 종양 내 변이를 조사하기 위해 세포 혼합물을 면역결핍 누드 마우스의 피하 부위에 주입합니다. 몇 가지 서로 다른 종양 이종이식편으로부터 calfs와 대조군 섬유아세포를 분리합니다.

그런 다음 각 혼합물을 각 마우스의 좌측과 우측 부위에 이식합니다. 주입 후 종양 또는 섬유아세포 이종이식편이 42일 동안 성장하도록 합니다. 종양 이종이식편 내 섬유아세포의 배양 기간은 종양 내 모섬유아세포에서 획득한 근섬유아세포 표현형을 기반으로 최적화해야 합니다.

안락사시킨 마우스에서 calf 또는 대조군 섬유아세포를 추출하려면, 제노그라프트 조직 최소 0.5 g과 섬유아세포 제노그라프트 조직 최소 0.1 g을 각각 별도의 디쉬에 넣습니다. 다음으로, 멸균된 면도날을 사용하여 조직을 1.5 mm³ 미만의 작은 조직 조각으로 잘게 다집니다. 그런 다음 면도날을 이용해 조직 조각들을 세포 해리 버퍼가 담긴 15 mL 원추형 튜브로 옮기고, 최대 속도로 1분 동안 볼텍싱합니다. 세포 현탁액을 37 °C에서 지속적으로 천천히 흔들어주며 3시간 동안 배양한 후, 세포 현탁액을 원심 분리합니다.

종양 또는 파이버글라스 sano graft로부터 분리하여 250 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 세포 펠렛을 PBS에 재현탁하고 원심분리를 반복합니다. 그 후, 결과물인 세포 펠렛을 10% FCS가 첨가된 DMEM에 재현탁하여 퓨로마이신(purmycin) 내성 모체 인간 유방 섬유아세포 배양물을 분리합니다.

종양 또는 섬유아세포 유래 세포를 1 µg/mL의 Puromycin이 포함된 15 cm 페트리 접시에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양합니다. 이를 통해 오염된 암세포 및 또는 마우스 세포를 제거할 수 있습니다.

기질 세포를 세포가 합류될 때까지 증식시킨 후, 동결 보존액을 사용하여 -80 °C에서 보관합니다. 결과적으로 얻어진 puromycin 내성 세포(42일령 XP calf 1 또는 대조군 섬유아세포 1 세포로 지정)는 불멸화되었으며 GFP 양성임에 유의하십시오. 인간 기억 섬유아세포는 종양 진행 과정에서 암세포와 상호작용함으로써 종양 이종이식물 내에서 종양 촉진 근섬유아세포 표현형을 증가시킵니다. 1×10⁶개의 MCF-7 RA 세포와 3×10⁶개의 42일령 P calf 세포를 혼합합니다.

1.5 mL 에펜도르프 튜브에 50% Matrigel이 포함된 400 µL의 배양액과 함께 세포를 분주합니다. 또한, exp calf 세포의 종양 촉진 myofibroblastic 표현형을 더욱 강화하기 위해, 암세포가 포함되지 않은 42일 된 대조군 섬유아세포 3 × 10⁶개를 에펜도르프 튜브에 준비합니다. 이 세포들과 CF seven RA 세포의 혼합물을 누드 마우스의 피하에 주입합니다. 필요한 경우, 대조군 설정을 위해 암세포 없이 대조군 섬유아세포만 단독으로 주입합니다.

종양 촉진 myofibroblastic 표현형을 강화하기 위해, 종양 이종이식편 내에서 exp calf one 세포를 200일 동안 추가로 배양하여 exp C two 세포를 생성합니다. 또한 exp calf two 세포에 대한 대조군으로서, 암세포 없이 대조군 섬유아세포 one 세포만을 마우스에 주입한 후 종양을 제거하여 조직 배양 접시에 옮김으로써 대조군 섬유아세포 two 세포를 생성합니다.

종양 또는 섬유아세포 seno graft를 해부 및 해리하여 단일 세포 현탁액으로 만든 후 배양합니다. 10% F-C-S-D-M-E-M이 담긴 15 centimeter 페트리 접시에서 pur mycin을 처리하여 세포를 증식시킨 후, trypsin으로 세포를 떼어내어 freezing medium을 사용하여 minus 80 degrees Celsius에서 보관합니다. 이렇게 얻은 pur mycin 내성 세포를 242 day old exp calf two cells 또는 control fibroblasts two cells라고 명명합니다. GFP로 표지된 exp calf two 및 control fibroblasts two cells를 유방 종양 이종이식편에서 추출하여 면역조직화학적으로 분석한 결과, 이 이미지에서 보듯이 세포들은 human specific fermenting prolo four hydroxylase, collagen one A, fibronectin, S 100, A four, 그리고 fibroblasts surface protein을 포함한 중간엽 마커에 대해 강한 양성 반응을 보입니다.

이러한 결과는 이 세포들이 인간 유래이며 중간엽 성질을 가지고 있음을 나타냅니다. 반면, 상피 세포 표지자인 cytokeratin은 이러한 GFP 양성 섬유아세포에서 염색되지 않았습니다. 이러한 발견은 EXP C two 및 대조군 섬유아세포 two 세포가 처음에 마우스 이종 이식편에 도입된 모체 인간 유선 섬유아세포에서 유래했음을 시사합니다.

중요한 점은, 대조군 섬유아세포 2세포와 비교했을 때 XP 종아리 2세포에서 myofibroblast의 마커인 alpha SMA와 extracellular matrix glycoprotein to nasin C에 양성 반응을 보이는 세포의 수가 훨씬 더 많이 관찰되었다는 것입니다. 42일 된 XP 종아리 1세포에서 관찰된 것보다 XP 종아리 2세포에서 alpha SMA 양성 myofibroblast의 비율이 더 높다는 점에 주목하십시오. 이러한 데이터는 종양 제노그라프트 내의 상주 인간 메모리 섬유아세포가 종양 진행 및 발달 과정에서 점진적으로 종아리 myofibroblast로 변한다는 것을 입증합니다.

보완 종양 이종이식 모델은 종양 미세환경을 연구하는 연구자들이 정상 섬유아세포가 암으로 진화하는 과정을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 섬유아세포라고 합시다.