디지털 Immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 Pial Arterioles에서 에스 트로겐 수용체 - α의 영상

본 실험 과정의 전반적인 목적은 암컷 쥐 뇌에서 얻은 피질 동맥의 횡단면 슬라이스를 사용하여 에스트로겐 수용체 알파(estrogen receptor alpha)의 염색 및 시각화를 최적화하는 간단한 기술을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 뇌 표면에서 Evan's blue 염료로 염색된 피질 동맥을 제거한 후, 섹셔닝 후 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 8 µm 두께의 링 모양으로 절단함으로써 수행됩니다. 이렇게 얻은 횡단면은 슬라이드에 마운팅한 후 에스트로겐 수용체 알파에 대한 1차 항체와 함께 배양합니다.

다음으로, dpi가 포함된 마운팅 매질을 사용하여 절편을 2차 항체 및 대조 염색약과 함께 배양합니다. 마지막으로, 형광 표지된 껍질 혈관 분절을 촬영하고 확장 초점 깊이(extended depth focus) 소프트웨어를 사용하여 2D 이미지로 변환합니다. 최종적으로 확장 초점 소프트웨어가 탑재된 Nikon 면역형광 현미경을 통해 껍질 세동맥의 에스트로겐 수용체 알파(estrogen receptor alpha)를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

제 이름은 Marguerite Littleton Kearney 박사입니다. 오늘은 제 연구실의 박사후 연구원인 Neil Farani 박사가 에스트로겐 수용체 알파(estrogen receptor alpha)의 시각화 및 염색을 최적화하기 위한 간단한 절차를 시연하겠습니다. peel에서 수행됩니다.

Evans blue 염색액으로 관류시킨 후 -70 °C에서 보관한 쥐의 뇌에서 동맥을 분리합니다. 해부 현미경을 사용하여 뇌 표면의 피질 동맥을 확인하고, 미세 핀셋을 사용하여 이를 제거합니다. 이때 부착된 뇌 조직을 주의 깊게 제거하십시오.

동맥을 작은 시험관에 넣고 얼음 위에 둡니다. 0.1 M PBS에 희석된 2% 저온 파우더 포름알데히드(formaldehyde)로 동맥을 30분 동안 고정합니다. 절편 제작을 위해 -20 °C로 설정된 동결 디스크 위에 임베딩 매질을 붓습니다.

동맥 절편을 척(chuck) 위에 평평하게 놓고 얼 때까지 기다립니다. 단단하게 얼면, 크라이오스탯 동결 디스크 위의 임베딩 미디어에 동맥을 수직으로 세워 배치합니다. 이때 동맥의 끝부분이 앞을 향하도록 하십시오.

동맥이 완전히 얼 때까지 핀셋으로 잡고 있습니다. 동맥이 부착된 냉동 디스크를 크라이오스탯 헤드에 넣은 다음, 8 µm 두께의 동맥 링 절편을 슬라이드 위에 직접 컷팅합니다. 절단된 동맥 절편을 크롬 칼륨 젤라틴에 부착합니다.

두 개의 붓을 사용하여 동맥 링을 곧게 펴며 슬라이드에 고정합니다. 준비된 슬라이드를 슬라이드 보관함에 넣어 4 °C 냉장고에 하룻밤 동안 보관합니다. 냉장고에서 슬라이드를 꺼내 벤치 탑 위에서 상온으로 맞춥니다.

슬라이드를 1~1.5 mL의 0.1 M PBS로 세척합니다. 10분 후 PBS를 제거하고 이 과정을 2회 더 반복합니다. 마지막 PBS 세척 후, 슬라이드를 1 mL의 50 mM 염화암모늄(ammonium chloride)에 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 내인성 형광을 감소시키기 위해, 앞서 설명한 대로 0.1 M PBS로 슬라이드를 3회 세척하며, 회당 세척 시간은 10분으로 합니다. 다음으로, 1차 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위해 0.1% Triton X 100과 1% normal goat serum이 포함된 PBS 용액에서 슬라이드를 30분 동안 블로킹합니다.

블로킹 후, 블로킹 용액에 1:500 비율로 희석한 ER alpha 항-일차 항체를 슬라이드에 처리하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 냉장고에서 슬라이드를 꺼내 실온으로 맞춥니다. 결합하지 않은 일차 항체를 제거하기 위해 0.1% PBS 1~1.5 mL로 10분씩 3회 세척합니다.

매회, 블로킹 용액에 희석된 Oregon Green, 4 88 이차 항-토끼 항체를 처리하여 실내 온도 및 암소에서 2시간 동안 슬라이드를 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 0.1 molar PBS로 10분씩 3회 세척한 다음 환기 후드로 옮깁니다. DAPI가 포함된 마운팅 매질 한 방울을 혈관 위에 떨어뜨리고, 샘플 위에 커버슬립을 덮습니다. 커버슬립의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하고 완전히 건조시킵니다.

염색된 혈관 절편이 부착된 준비된 슬라이드를 현미경 아래에 넣고, 형광 표지된 관심 영역이 보이도록 조정합니다. 염색된 ER alpha를 시각화하는 것이 이 절차에서 가장 어려운 단계입니다. 수용체가 가장 명확하게 보이는 혈관 절단면의 높이를 찾으십시오.

100배 배율에서 시작하여 600배 배율로 높입니다. 카메라를 사용하여 세포핵의 DPI 채널과 DR alpha의 ZI 채널 이미지를 각각 캡처한 다음, 소프트웨어를 사용하여 혈관 분절의 다중 뷰를 2D 이미지로 변환합니다. 여기서 ER alpha의 면역형광 염색 결과는 녹색으로, DPI를 이용한 대조 염색 결과가 함께 표시됩니다.

암컷 쥐 뇌에서 분리한 동맥 링의 청색 이미지에서, 병합된 영상은 핵 내 에스트로겐 수용체 알파의 존재를 시사합니다. Z-stack 이미지의 조합을 사용하여 ER 알파 면역형광의 초점이 맞은 이미지를 얻을 수 있으며, 1차 및 2차 항체 모두에 대해 자가형광 음성 대조군 실험을 수행해야 합니다. 2차 항체를 처리하지 않은 동맥의 내피 세포 측을 따라 뚜렷한 자가형광이 나타남에 유의하십시오.

이 영상을 시청한 후, 뇌 표면에서 동맥을 분리 및 박리하고 8 µm 두께의 횡단면 링을 준비하는 방법을 이해하게 될 것입니다. 또한, 형광 표지된 estrogen receptor alpha의 사용법과 디지털 면역형광 현미경 및 Nikon extended 소프트웨어를 사용하여 수용체를 시각화하는 방법에 익숙해질 것입니다.