마우스 모델에서 망막 색소 상피에 바이러스 벡터의 망막하 주사

마취된 마우스로 시작하여 동공 확장제를 바르십시오.

현미경으로 눈꺼풀을 열고 눈을 살짝 돌출시켜 주사 부위를 노출시킵니다.

안과용 점탄성 용액 한 방울을 바른 다음 커버슬립을 놓아 망막을 시각화합니다.

가는 바늘을 사용하여 각막-공막 접합부 뒤에 구멍을 만들어 혈관과 수정체의 손상을 방지합니다.

이 미리 구멍이 뚫린 구멍을 통해 망막 뉴런을 지지하는 망막 색소 상피 또는 RPE 근처의 망막하 공간에 무딘 주사기를 접선 방향으로 삽입합니다.

표적 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 망막하 공간에 주입합니다.

체액 축적으로 인한 망막하 수포의 형성을 관찰하여 성공적인 벡터 전달을 확인합니다.

눈꺼풀을 부드럽게 닫아 주사 부위를 덮고 마우스가 회복될 수 있도록 합니다.

렌티바이러스는 엔도사이토시스를 통해 RPE에 들어가 유전 물질을 방출하고 이를 해당 DNA로 전환하여 숙주 게놈과 통합되어 유전자 발현을 가능하게 합니다.

먼저 33게이지 무딘 바늘이 달린 마이크로리터 주사기를 준비합니다. 에틸렌옥사이드 가스를 사용하여 멸균하십시오. 다음으로, 마이크로리터당 약 100만 역가 단위로 마이크로 퓨지 튜브에서 PBS의 바이러스 벡터 희석액을 준비합니다. 이제 주사기를 넣을 때 용액으로 여러 번 세척하여 주사기의 사각지를 제거하십시오. 주입할 수 있도록 1.5-2마이크로리터를 준비하십시오.

바이러스 벡터 주사가 준비된 상태에서 틸레타민, 졸라제팜 및 자일라진의 복강 내 주사로 성인 마우스를 마취합니다. 반사 신경이 없어 동물이 마취되었는지 확인하십시오. 마취가 확인되면 0.5% 페닐에프린과 0.5% 트로피카미드를 떨어뜨려 동공을 확장합니다. 이제 수술용 현미경으로 눈꺼풀을 열고 눈을 돌출하여 적도를 노출시킵니다. 안와 테두리 바깥쪽에 손가락을 놓아 눈을 이 위치에 고정합니다.

그런 다음 안과용 점탄성 용액을 각막 표면에 바르고 각막 위에 작은 둥근 커버 슬라이드를 놓습니다. 따라서 망막을 볼 수 있습니다. 이제 윤부의 약간 뒤쪽, 오른쪽 눈 아래쪽 또는 왼쪽 눈 위쪽에 멸균 30게이지 반바늘을 사용하여 작은 구멍을 만듭니다. 임시로 배치되거나 비강에 배치된 구멍은 덮기 어렵기 때문에 좋은 선택이 아닙니다.

천

자를 뚫는 동안 윤부 혈관이나 수정체를 치지 말고 바늘의 경사 전체를 삽입하지 마십시오.

망막하 주사의 경우 벡터 주입 바늘을 구멍을 통해 홍채 평면에 대해 45도 각도로 삽입합니다. 유리체강을 가로지르기 위해 표시된 경로를 따라 유두주위 영역을 향해 바늘을 뒤쪽으로 밉니다. RPE 층에 도달했음을 나타내는 가벼운 저항이 느껴질 때까지 바늘을 망막하 공간으로 접근합니다.

바늘은 잠재적인 망막하 공간에 배치되어야 하므로 과도한 압력으로 공막 조직을 관통하지 마십시오. 바늘이 과도한 힘으로 두개골 조직에 구멍을 뚫으면 저항 없이 외안와 공간으로 들어갑니다.

이제 바이러스 벡터를 망막하 공간에 부드럽게 주입합니다. 매우 중요한 조직 손상을 방지하기 위해 바늘을 매우 가만히 유지하십시오. 그런 다음 바늘을 부드럽게 빼냅니다. 이제 안구를 풀 수 있습니다. 벡터 축적을 나타내는 망막하 수포가 보여야 합니다. 마지막으로 눈꺼풀을 부드럽게 닫아 주사 부위를 덮습니다. 구멍의 자체 밀봉이 발생합니다.