부정적 얼룩 EM에 의해 단백질과 Macromolecular의 단지를 떠올리 : 그리드 준비에서 이미지 수집

본 절차의 전반적인 목적은 음성 염색 전자 현미경법을 통해 정제된 단백질 샘플을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 샘플을 지지할 전자 현미경 그리드를 준비함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 음성 염색 용액을 준비하는 것입니다.

다음으로, 시료를 전자현미경 그리드에 도포하고 네거티브 염색을 수행합니다. 마지막으로, EM 그리드를 전자현미경에 장착하고 적절한 광학 조건 하에서 이미지를 기록합니다. 일반적인 명시야 DEM 이미지는 대비가 높고 세부 묘사가 뚜렷하며, 특징 없는 배경 위에 흩어져 있는 단일 거대분자를 보여줍니다.

음성 염색 전자 현미경법은 분석하고자 하는 단백질을 시각화하는 간단한 방법입니다. 이 방법은 정제된 단백질의 구조 분석이나 기타 생화학 및 생물물리학적 분석을 위한 일상적인 분석법으로 활용될 수 있습니다. 본 영상에서는 전자 현미경 관찰을 위해 음성 염색 시료를 준비하는 방법을 설명합니다.

일부 단계는 텍스트 설명과 그림만으로는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 도움이 됩니다. 먼저 유리 피펫을 사용하여 물이 담긴 큰 비커의 수면에 콜로디온 한 방울을 떨어뜨립니다. 콜로디온이 퍼지면서 수면의 먼지를 포착할 수 있습니다.

먼지가 묻은 콜로디온 플라스틱 필름을 제거하고 다른 한 방울로 교체합니다. 다음으로 50~100개의 EM 그리드를 광택면이 아래로 향하게 하여 부유하는 플라스틱 필름 위에 하나씩 배치합니다. 일반적인 음성 염색에는 400 mesh 그리드를 선택하고, 200 mesh 그리드도 선택합니다.

틸트 쌍(tilt pair) 이미지를 수집하기 위한 단계입니다. 그리드 면적보다 약간 더 큰, 구김이 없고 흡수력이 낮은 종이를 선택하십시오. 종이를 그리드 위에 올려놓고 종이가 완전히 젖을 때까지 기다리십시오.

종이가 물을 너무 빨리 흡수해서는 안 됩니다. 저렴한 메모장의 종이를 사용합니다. 이제 그리드는 플라스틱 필름과 종이 사이에 끼워진 상태가 됩니다.

핀셋을 사용하여 종이를 페트리 접시에 놓고 천천히 자연 건조시킵니다. 주름이 생길 수 있으므로 더 빠른 건조 방법은 피하십시오. 본 실험실에서 사용한 탄소 코팅기는 Creston 2 0 8 C 고진공 터보 탄소 코터입니다.

Creston 박막 두께 측정기가 장착되어 있습니다. 이 측정기는 탄소 증착에 민감한 수정 진동자(quartz balance)를 사용합니다. 하지만 여기에 설명된 프로토콜에서는 이 장치가 필요하지 않습니다. 먼저 탄소 코팅기에서 탄소봉을 연마하고 장착하는 것부터 시작하십시오.

다음으로, 성에가 낀 영역의 절반을 코팅하지 않은 상태로 남겨두기 위해 진공 그리스를 바른 유리 슬라이드를 준비합니다. 탄소 코팅 후, 슬라이드의 그리스 처리된 영역을 통해 탄소 코팅의 두께를 추정합니다. 탄소 코팅기의 벨 자 아래 스테이지 위에 그리드가 그려진 종이를 놓습니다. 그리스를 바른 유리를 배치합니다.

그리드 옆으로 슬라이드를 이동시키십시오. 진공 챔버를 최소 10 micro tours까지 펌핑하십시오. 그렇지 않으면 스파킹으로 인해 그리드에 많은 대형 입자가 생성될 수 있습니다. 이제 전류를 매우 천천히 높이십시오.

탄소 막대의 날카로운 팁이 매우 밝게 빛나게 됩니다. 코팅이 시작될 때 이를 맨눈으로 관찰하지 마십시오. 탄소 코팅이 형성됨에 따라 유리 슬라이드의 색상이 짙은 회색으로 변하게 되며, 원하는 탄소 두께에 도달했을 때 전류를 차단하십시오. 이때 벨 자(bell jar)의 투명도를 고려해야 합니다. 슬라이드의 어두운 정도와 탄소 두께의 상관관계를 보정한다면, 이 방법은 더 고가인 박막 두께 측정기만큼 정확합니다.

공정이 완료되면 진공 챔버를 배기하고 코팅된 그리드를 제거하여 나중에 사용하십시오. 얇은 플라스틱 층은 음성 염색 이미지의 품질에 영향을 주지 않으나, 진행하기 전에 그리드를 클로로포름에 몇 시간 동안 담가 제거할 수 있습니다. 신선한 우라닐 포르메이트 용액을 제조하거나, 암소에서 2주 미만으로 보관된 용액을 사용하십시오.

상태가 좋은 신선한 용액은 노란색을 띠며, pH는 약 4이며, 침전물이 없이 매우 깨끗합니다. 먼저 상용 글로잉 시스템(glow system)을 사용하여 탄소 코팅 그리드를 방전시키십시오.

다음으로, 증류수 20 µL 방울 두 개와 신선한 urinal formate 용액 25 µL 방울 두 개를 perfil 조각 위에 떨어뜨립니다. 역방향 힘 안티 캐필러리 핀셋을 사용하여, 탄소 코팅된 면이 위로 향하도록 글로우 방전 그리드를 잡습니다. 중요한 점은, 이 핀셋은 그리드에서 액체를 빨아들이지 않는다는 것입니다.

이제 2 µL의 단백질 시료를 그리드에 도포하고 단백질이 그리드에 흡수될 때까지 기다립니다. 이 과정은 보통 30초가 소요되나, 매우 희석된 시료의 경우 더 많은 시간이 필요하며 이는 완충액 농도에 영향을 줄 수 있습니다. 완료되면 여과지를 사용하여 단백질 시료를 닦아냅니다.

그런 다음 그리드 표면을 물 한 방울에 가볍게 접촉시킨 후 몇 초 이내에 닦아내어 이 과정을 두 번 반복하여 세척합니다. 물 세척 직후, 그리드를 염색액 한 방울에 가볍게 접촉시킨 뒤 빠르게 닦아냅니다. 동일한 방법으로 그리드를 두 번째 염색액 한 방울에 20초 동안 접촉시킵니다.

마지막으로, 벤치형 퓸 후드에서 그리드를 공기 건조시키거나, 가급적이면 EM 세션 전에 진공 상태에서 건조하십시오. EM 현미경의 정렬 상태를 확인하고, 가능한 경우 최적화된 정렬 파일을 로드하여 거의 완벽한 상태로 복구해야 합니다. 이제 EM 그리드를 단일 틸트 표준 시료 홀더에 장착하십시오. 그다음, 홀더를 스테이지에 삽입하십시오.

그 다음 펌핑 사이클이 완료될 때까지 기다린 후 홀더를 컬럼에 삽입하십시오. 이제 염색 상태가 좋은 샘플 영역을 찾기 시작합니다. 최소 대비법(minimum contrast method)을 사용하거나, CC, D 카메라를 사용하여 라이브 포커스(live focus)를 계산함으로써 수동으로 초점을 맞추십시오.

전력 스펙트럼을 확인하십시오. 그 다음 필요에 따라 딥 포커스(deep focus)를 설정하는데, 보통 -1.5 µm로 설정합니다. 그리드 전체에서 염색 농도가 다를 수 있으므로, 흰색 대비가 나타나는 단백질을 찾으십시오.

단백질 대비가 검게 나타나는 얼룩이 불균일하거나 염색이 양성으로 나타나는 영역은 피하십시오. 그리드를 제작하고 음성 염색된 시료를 시각화하기 위해 설명된 접근 방식을 사용합니다. 시연을 위해 몇 가지 익숙한 단백질들을 촬영하였습니다.

세부 사항과 선명한 대비를 확인하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 전자 현미경 관찰을 위한 음성 염색 거대분자 시료 제작 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련될 경우, 이 기술은 약 4시간 만에 수행할 수 있습니다.

이 절차에 이어, 분자 구조를 더 잘 이해하기 위해 3D 재구성(3D reconstruction)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.