부정적 얼룩 EM에 의해 단백질과 Macromolecular의 단지를 떠올리 : 그리드 준비에서 이미지 수집
December 22nd, 2011
부정적인 얼룩 전자 현미경 (EM)에 의해 머릿속 단백질 샘플은 인기있는 구조적 분석 방법이되었다. 그것은 단백질 준비의 품질의 질적 심사 또한 연구되고있는 분자의 3 차원 재구성을 계산으로 정량 구조 분석에 유용합니다. 이 문서에서 우리는 EM 그리드를 준비 샘플을 염색법과 전자 현미경의 시료를 시각화에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 초보자 사용자가 쉽게 이러한 프로토콜을 따르 수 있으며, 부정적인 자신의 단백질 샘플을 평가하기위한 다른 생화학 assays 이외에, 일상적인 분석으로 그들을 얼룩 활용합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 음성 염색 전자 현미경으로 정제된 단백질 샘플을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 샘플을 지지할 전자 현미경 그리드를 준비하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 음성 염색 용액을 준비하는 것입니다.
다음으로, 샘플을 전자 현미경 그리드에 적용하고 음극으로 염색합니다. 마지막으로, EM 그리드는 전자 현미경에 로드되고 이미지는 적절한 광학 조건에서 기록됩니다. 기존의 명시야, DEM 이미지는 대비가 높고 선명하게 디테일하여 특징이 없는 배경에 흩어져 있는 단일 거대분자를 보여줍니다.
음성 염색 전자 현미경은 좋아하는 단백질을 시각화하는 간단한 방법입니다. 구조 분석 또는 기타 생화학적 및 생물물리학적 분석을 위해 정제된 단백질을 검사하기 위한 일상적인 분석으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 전자 현미경을 위해 음성 염색 샘플을 준비하는 방법을 보여줍니다.
이 방법을 시각적으로 시연하면 일부 단계는 텍스트 설명 및 그림에서 배우기 어렵기 때문에 유용합니다. 먼저 유리 피펫을 사용하여 물 표면의 큰 물 비커에 콜로디온 한 방울을 떨어뜨립니다. 콜로디온이 퍼짐에 따라 물 표면에서 먼지를 포집할 수 있습니다.
먼지가 많은 콜로디온 플라스틱 필름을 제거하고 다른 방울로 교체하십시오. 다음으로 50개에서 100개의 EM 그리드 사이를 떠 다니는 플라스틱 필름에 하나씩 놓고 반짝이는 면이 아래로 향하게 합니다. 일상적인 네거티브 스테인을 위해 400개의 메쉬 그리드를 선택하고 200개의 메쉬 그리드를 선택합니다.
틸트 페어 이미지 수집용. 격자 영역보다 약간 큰 느린 흡수성 구겨지지 않은 용지 조각을 선택합니다. 격자 위에 종이를 놓고 종이가 완전히 젖을 때까지 기다립니다.
종이가 물을 너무 빨리 흡수하지 않아야 합니다. 우리는 값싼 메모장에서 종이를 사용합니다. 그리드는 이제 플라스틱 필름과 종이 사이에 끼워져 있습니다.
집게를 사용하여 종이를 페트리 접시에 넣어 천천히 자연 건조시킵니다. 빠른 건조 방법은 주름을 유발할 수 있으므로 피하십시오. 우리 실험실에서 사용되는 탄소 코팅 기계는 Creston 2 0 8 C 고진공 터보 탄소 코팅기입니다.
Creston 필름 두께 모니터가 장착되어 있습니다. 모니터는 탄소 침전물에 민감한 석영 저울을 사용합니다. 그러나 여기에 설명된 프로토콜은 이 장치를 필요로 하지 않습니다.탄소 코팅 기계에서 탄소 막대를 날카롭게 하고 로드하는 것으로 시작합니다.
다음 코팅, 진공 그리스가 있는 유리 슬라이드는 코팅되지 않은 젖빛 영역의 절반을 남겨둡니다 탄소 코팅 후 슬라이드의 그리스 처리된 영역은 탄소 코팅의 두께를 추정하는 데 사용됩니다. 격자가 있는 종이를 무대에 놓습니다.tage 탄소 코팅 기계의 벨 항아리 아래. 기름칠한 유리를 놓습니다.
그리드 옆으로 밉니다. 진공 챔버를 최소 10개의 마이크로 투어까지 펌핑하면 스파크가 발생하면 그리드에 많은 큰 입자가 생성됩니다. 이제 전류를 매우 천천히 높이십시오.
탄소 막대의 날카로운 끝이 매우 밝아집니다. 코팅이 시작될 때 육안으로 관찰하지 마십시오, 탄소 코팅이 쌓이면 유리 슬라이드의 색상이 짙은 회색으로 변하고 원하는 탄소 두께에서 전류를 차단하고 벨 항아리의 투명도를 고려하십시오. 이러한 판단을 내릴 때, 슬라이드의 어둡기가 탄소 두께에 맞게 보정되면 이 방법은 더 비싼 필름 두께 모니터만큼 정확합니다.
공정이 완료되면 진공 챔버를 환기시키고 나중에 사용할 수 있도록 코팅된 그리드를 제거합니다. 얇은 플라스틱 층은 음극으로 염색된 이미지의 품질에 영향을 미치지 않지만 진행하기 전에 몇 시간 동안 그리드를 클로로포름에 담그면 제거할 수 있습니다. 신선한 소로포름산염 용액을 만들거나 어두운 곳에 보관한 지 2주 미만인 용액을 사용하십시오.
좋은 신선한 용액은 노란색, 약 4의 pH를 가지며 침전물 없이 매우 깨끗하게 실행됩니다. 시중에서 판매되는 시스템을 사용하여 빛을 내는 것으로 시작하십시오. 탄소 코팅 그리드를 배출합니다.
다음으로, 20 마이크로 리터의 증류수 2 방울과 2 2 마이크로 리터의 신선한 소변기 포름산염 용액을 퍼필 조각에 떨어 뜨립니다. 역력 모세관 방지 집게를 사용하여 탄소 코팅면이 위로 향하게 하여 글로우 방전 그리드를 잡습니다. 결정적으로, 이 집게는 그리드에서 액체를 빨아들이지 않습니다.
이제 2마이크로리터의 단백질 샘플을 그리드에 적용하고 단백질이 그리드에 흡수될 때까지 기다립니다. 이 작업은 일반적으로 30초가 소요되지만 매우 희석된 샘플은 더 많은 시간이 필요하므로 완충액 농도에 영향을 줄 수 있습니다. 완료되면 여과지를 사용하여 단백질 샘플을 닦아내십시오.
그런 다음 그리드 표면을 물 한 방울에 잠시 닿히고 몇 초 안에 건조시켜 그리드를 두 번 씻습니다. 물이 그리드에 잠시 닿아 얼룩 한 방울이 묻은 후 빠르게 닦아 건조시킵니다. 동일한 기술을 사용하여 그리드가 20초 동안 두 번째 얼룩 방울과 접촉하도록 합니다.
마지막으로, 벤치 흄 후드의 그리드를 자연 건조하거나, EM 세션 전에 진공 상태에서 건조하고, 사용 가능한 경우 완벽한 정렬 파일을 로드하는 EM 현미경의 정렬을 확인하고 거의 완벽한 상태로 복원해야 합니다. 이제 EM 그리드를 단일 틸트 표준 시편 홀더에 로드합니다. 그런 다음 홀더를 스테이지에 삽입합니다.
그런 다음 펌핑 주기가 완료될 때까지 기다렸다가 홀더를 컬럼에 삽입합니다. 이제 얼룩이 좋은 샘플 영역을 찾기 시작합니다. 최소 대비 방법을 사용하거나 CC, D 카메라를 사용하여 라이브 포를 계산하여 수동으로 초점을 맞춥니다.
당신의 파워 스펙트럼. 그런 다음 필요에 따라 딥 포커스를 일반적으로 음수 1.5미크론으로 설정합니다. 얼룩 농도는 그리드에 따라 다를 수 있으므로 흰색 대비가 있는 단백질을 검색하십시오.
고르지 않은 얼룩이 있거나 단백질 대비가 검게 변하는 양성 얼룩이 있는 부분을 피하십시오. 윤곽을 잡은 접근법을 사용하여 그리드를 만들고 음으로 염색된 샘플을 시각화합니다. 시연 목적으로 몇 가지 친숙한 단백질을 이미지화했습니다.
그들의 디테일과 선명한 대비에 주목하십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 전자 현미경에서 관찰하기 위해 음으로 염색된 거대분자 샘플을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 약 4시간 안에 수행할 수 있습니다.
이 절차에 따라 분자 구조를 더 잘 이해하기 위해 3D 재구성과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
개요
이 기사는 음성 염색 전자현미경(EM)을 사용하여 정제된 단백질 샘플을 시각화하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 초보 사용자에게 적합하며 단백질의 구조 분석을 위한 일상적인 분석으로 사용됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 구조 생물학
- 전자현미경
- 단백질 분석
배경
- 음성 염색 EM은 단백질을 시각화하는 데 널리 사용되는 기술입니다.
- 질적 및 양적 구조 분석을 가능하게 합니다.
- 샘플 준비 및 시각화를 위한 프로토콜은 성공적인 적용에 필수적입니다.
- 이 방법은 단백질 구조에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- EM 그리드 준비 및 샘플 염색을 위한 포괄적인 가이드를 제공합니다.
- 음성 염색 EM을 사용한 단백질 시각화를 시연합니다.
- 단백질 분석에서 이 방법의 일상적인 사용을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 전자현미경 그리드의 준비.
- 단백질 샘플에 음성 염색 용액의 도포.
- 전자현미경에서 샘플의 시각화.
- 최적의 조건에서 이미지 기록.
주요 결과
- 단백질의 고 대비 이미지를 얻었습니다.
- 상세한 프로토콜이 성공적으로 시연되었습니다.
- 시각 보조 자료가 복잡한 단계에 대한 이해를 향상시켰습니다.
- 결과는 일상적인 단백질 분석을 위한 음성 염색 EM의 사용을 지지합니다.
결론
- 음성 염색 EM은 단백질 시각화를 위한 효과적인 방법입니다.
- 제공된 프로토콜은 초보 사용자가 쉽게 따를 수 있습니다.
- 이 기술은 다른 생화학적 분석을 보완할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
