작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

다음 실험의 전반적인 목표는 소분자 유도를 사용하여 만능 인간 배아 줄기 세포에서 직접 그리고 독점적으로 신경 자손을 유도하는 것입니다. 이는 정의된 조건에서 유지되는 미분화 세포에 레티노산을 추가함으로써 달성됩니다. 다음으로, 분화 과정은 현탁 배양에서 세포를 분리하여 신경아세포(neuroblast)라고 하는 부유 세포 클러스터를 형성함으로써 계속됩니다.

신경아세포가 신경 분화 배지의 조직 배양 플레이트에 부착되도록 허용되면 성숙한 뉴런의 특성이 발달합니다. 궁극적으로, 면역형광 및 디콘볼루션 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 처리된 인간 배아 줄기 세포의 형태 및 마커 발현에서 레티노산 처리의 효과를 보여줄 수 있습니다. 다른 기술에서는 세포의 극히 일부만이 신경 표현형을 추구하는 반면, 우리의 방법은 작은 분자의 간단한 제공에 의해 독점적으로 신경 계통을 향하는 만능 인간 배아 줄기 세포의 잘 제어되고 효율적인 유도를 가능하게 합니다.

재고 용액을 수리할 때 주의해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 마트리겔과 휴먼 라미닌을 영하 80도에서 4도까지 천천히 해동하고, 하룻밤 동안 미디어를 섭씨 4도에서 보관하고, 사용하기 전에 항상 미디어를 섭씨 37도로 예열하십시오. 또한 인간 ESL 배지를 준비할 때 일부 보충제는 사용 직전에 추가됩니다.

여기에는 BFGF, 아스코르브산, A에서 활성을 보이는 인간 인슐린 및 전달이 포함됩니다. 다음으로, 플레이트 코팅 직전에 matra gel 또는 human laminin working solution을 만듭니다. 젤라틴이 사전 코팅된 조직 배양 플레이트를 준비한 후 5% 이산화탄소에서 37도 SIU로 플레이트를 배양합니다.

젤라틴은 마트리겔 또는 라미닌 작업 용액으로 대체할 수 있습니다. 이 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 코팅하십시오. 먼저 인간 ES 세포 군체가 5-7일 동안 성장하도록 한 다음 분열을 준비합니다.

그들 중 일부는 75% 이상의 콜로니를 선택합니다.분화된 인간 ES 세포에서는 일반적으로 약간 불투명하며 쌓인 세포를 포함하는 정의된 가장자리 콜로니가 있습니다. 분화의 시작에 대한 표시는 일반적으로 대부분 분화된 세포를 포함하는 흰색 군체가 일반적으로 명확하게 나타나는 것으로 보입니다. 흰색 또는 투명 식민지를 선택하지 마십시오.

플레이트를 빛에 비추고 마커를 사용하여 윤곽을 따라 플레이트 바닥에 있는 약간 불투명한 군체의 윤곽을 그립니다. 멸균 P 2 피펫 팁의 가장자리를 사용하여 인간 ES 세포 군집체에서 주변 섬유아세포층을 분리합니다. 그런 다음 주변의 섬유아세포 세포를 제거하고 집락의 분화된 모든 부분도 제거합니다.

이제 분리된 분화된 세포를 포함하는 오래된 배지를 흡인합니다. 다음으로, 각 웰에서 BFGF가 결핍된 인간 E es 세포 배지로 미분화된 세포를 한 번 세척한 다음 사용 직전에 B-F-G-F-B-F-G-F를 포함하는 3밀리리터의 신선한 인간 ESL 배지를 신선한 배지에 첨가합니다. 이제 멸균 P 2 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 작은 조각으로 자르고 플레이트에서 분리합니다.

배지에서 분리된 콜로니 조각을 50ml 원뿔형 튜브로 당깁니다. 한 개 더 뽑습니다. 밀리리터 미디어는 웰 당 헹굼합니다.

이제 세포는 작은 분자를 사용하여 추가 분화를 할 준비가 되었습니다. 갓 코팅한 접시를 섭씨 37도로 데우는 것으로 시작합니다. 플레이트에서 코팅 용액을 흡입하고 콜로니 조각이 포함된 4mL의 배지 분취량을 각 웰에 추가한 다음 플레이트를 흔들지 않고 인큐베이터로 부드럽게 옮깁니다.

접시가 씨를 뿌릴 수 있도록 접시를 방해하지 마십시오. 3 일 동안 씨를 뿌린 후에, 옴산 포함하는 새로운 매체를 만드십시오. 그런 다음 대부분의 오래된 배지를 제거하고 세포가 잠긴 상태로 유지될 수 있도록 충분한 매체만 남깁니다.

세포가 각각으로 건조되도록 해서는 안 됩니다. 음, 4ml의 신선한 인간 ES 세포 배지에 BFGF와 레티노산을 첨가합니다. 격일로 배지를 교체하고 레티노산 처리된 인간 ES 세포 집락이 성장할 수 있도록 합니다.

7-8일이 지나면 세포는 형태학적 변화를 겪어 큰 분화된 세포가 됩니다. 그런 다음 부유 세포 배양을 진행하여 현탁 배양을 시작하여 자발적으로 분화하고 이동하여 섬유아세포층을 형성한 세포에서 ESL 콜로니를 분리하여 배양을 시작합니다. 멸균 피펫 팁과 함께 앞서 언급한 기술을 사용한 다음 떠다니는 분리된 섬유아세포 세포가 포함된 오래된 배지를 흡인합니다.

HESC 배지로 세포를 한 번 세척하고 3밀리리터의 HESC 배지로 다시 현탁합니다. 이제 멸균 P 2 피펫 팁을 사용합니다. 식민지를 작은 조각으로 자르고 접시에서 분리하십시오.

콜로니가 분리된 미디어를 단일 50ml 원뿔형 튜브로 당깁니다. 1ml의 미디어로 우물을 헹구고 수영장에 헹굼을 추가합니다. 그런 다음 4ml의 풀링된 세포를 6개의 웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 4-5일 동안 분취하고 플레이트를 인큐베이터에 보관합니다.

이 기간 동안 부유 세포 클러스터 또는 신경아세포가 형성되어 신경아세포를 보다 성숙한 뉴런 표현형으로 더욱 진행시킵니다. 이를 포함하는 미디어를 50ml 원추형 튜브로 당깁니다. 그런 다음 5분 동안 1, 400RPM으로 세포를 원심분리합니다.

흡입하고, 가능한 한 많은 기존 배지의 무게를 측정하고, VEGF N NT 3 및 BDNF를 포함하는 동일한 양의 새로운 NSC 배지를 추가합니다. 피펫팅을 통해 세포를 현탁액에 혼합한 다음 웰당 현탁액 4ml를 6으로 분취합니다. 웰 조직 배양 플레이트는 플레이트를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터로 옮깁니다.

신경아세포는 Matrigel에서 3D 배양을 위해 하룻밤 사이에 배양 플레이트에 부착되거나 신경아세포 현탁액에 인간 라미네이트가 부착됩니다. 그리고 3D 매트릭스는 섭씨 37도에서 중합됩니다. 격일로 미디어를 교체하십시오.

2주 이내에 신경돌기를 지닌 신경 세포와 색소 세포의 광범위한 네트워크가 나타날 것입니다.레티노산은 정의된 배양 시스템에서 유지되는 인간 ES 세포가 전적으로 다능성에서 신경 표피 표현형으로 전환하도록 유도하기에 충분합니다. 미분화된 인간 E es 세포를 레티노산에 노출시키면 군집 내의 모든 세포는 다능성 관련 마커 OCT 4의 발현을 중단한 큰 분화된 세포로 형태학적 변화를 겪었습니다. 세포는 또한 HNK 1 a, P 2 및 TRKC와 같은 다양한 신경 외부 배엽 관련 마커를 발현하기 시작했습니다.

이 거대하고 분화된 세포는 계속 증식하고 군체의 크기가 증가하여 초기 신경 세포 마커인 베타 3 튜불린을 자발적으로 발현했습니다. 더 성숙한 뉴런 마커 맵 2는 세포가 쌓인 군체 지역에서 나타나기 시작했습니다. 공교롭게도, 신경외배엽 세포의 출현과 함께, 신경세포 특이적 전사 인자 NER 1은 도파민성 신경세포 분화 및 티로신 하이드록실라제 유전자의 활성화에 관여하여 핵으로 전위되었습니다.

분리 후, 레티노산을 처리한 인간 ES 세포는 염기성 FGF를 제거한 후 현탁 배양에서 신경아세포를 형성하고, 신경아세포를 조직 배양판에 부착한 후, 중추신경계의 전형적인 신경돌기 보유 신경세포와 색소 세포의 광범위한 네트워크가 나타나기 시작했으며, 효율이 급격히 증가하여 3개월에 걸쳐 배양할 수 있었습니다. 이 인간 ES 세포 유래 신경 세포는 베타 3 튜불린을 레티노산 처리 없이 세포의 자발적 다중 계통 분화와 비교하여 발현하고 2개의 맵을 공동 발현하면 마스터했습니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 약 4주 안에 만능 인간 배아 줄기 세포에서 신경 세포의 신경 전구 세포를 균일하게 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

인간 세포를 대상으로 하는 작업은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하기 전에 항상 세포주에 병원균 및 마이코플라스마가 없는지 확인하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.