작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

다음 실험의 전반적인 목표는 저분자 유도 물질을 사용하여 다능성 인간 배아 줄기세포로부터 직접적이고 배타적으로 심장 계통의 후손 세포를 유도하는 것입니다. 이는 정의된 조건 하에서 유지된 미분화 인간 ES 세포에 니코틴아미드를 첨가함으로써 달성됩니다. 그 다음으로, 심장 분화 세포를 분리하여 부유 배양 상태의 부유 세포 클러스터인 카디오 블라스트(cardio blasts)를 형성합니다.

형성된 심장모세포(cardioblasts)를 심장 분화 배지에 부착시키면 박동하는 심근세포로 계속 발달합니다. 최종적으로, 디콘볼루션(deconvolution) 또는 공초점 현미경을 이용한 면역형광 염색과 전기생리학적 기록을 통해 결과를 평가합니다. 이 기술의 주요 장점은 소분자 화합물을 간단히 제공함으로써 다능성 인간 배아줄기세포를 심장 계통으로만 효율적으로 유도할 수 있다는 점입니다.

기존의 다분화 방법에서는 극소수의 세포만이 심장 표현형을 나타냅니다. 스톡 용액을 준비할 때 주의해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. Matrigel과 human laminin은 -80 °C에서 4 °C로 하룻밤 동안 천천히 해동하고, 배지는 4 °C에서 보관하며, 사용 전에는 항상 배지를 37 °C로 가온하십시오.

또한, 인간 ES 세포 배지를 준비할 때 일부 보충제는 사용 직전에 첨가합니다. 여기에는 bFGF, 아스코르브산, human insulin 및 transferrin이 포함됩니다. 다음으로, 플레이트 코팅 직전에 Matrigel 또는 인간 laminin 작업 용액을 만듭니다.

젤라틴이 사전 코팅된 조직 배양 플레이트가 준비되면, 5% carbon dioxide 조건의 37 °C에서 플레이트를 배양합니다. 젤라틴은 matrigel 또는 laminin 작업 용액으로 대체할 수 있습니다. 이 플레이트들은 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 코팅합니다.

먼저 인간 ES 세포 콜로니를 5~7일 동안 배양한 후, 그 중 일부를 계대 배양할 준비를 합니다. 미분화된 인간 ES 세포가 75% 이상 포함된 콜로니를 선택하십시오. 이러한 콜로니는 보통 경계가 뚜렷하고 세포가 층을 이루며 쌓여 있어 약간 불투명하게 보입니다. 분화가 시작되었다는 신호로, 대부분 분화된 세포를 포함하는 흰색 콜로니는 보통 투명하게 보입니다.

흰색이나 투명한 콜로니는 선택하지 마십시오. 플레이트를 빛에 비추어 보고, 플레이트 바닥면에 있는 약간 불투명한 콜로니의 외곽선을 따라 마커로 표시하십시오. 멸균된 P2 피펫 팁의 끝을 사용하여 인간 ES 세포 콜로니 주변의 섬유아세포 층을 분리하십시오.

그런 다음 주변의 섬유아세포를 제거하고 콜로니의 분화된 부분들을 모두 제거합니다. 이제 분리된 분화 세포들이 포함된 기존 배지를 흡입하여 제거합니다. 다음으로 각 웰의 미분화 세포를 bFGF가 없는 인간 ES 세포 배지로 한 번 세척한 후, 사용 직전에 bFGF를 첨가한 신선한 인간 ES 세포 배지 3 mL를 추가합니다.

이제 멸균된 P2 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 작은 조각으로 자르고 플레이트에서 떼어냅니다. 떼어낸 콜로니 조각들을 배지와 함께 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 각 웰당 1 mL의 배지로 추가 헹굼 과정을 수행하여 옮겨 담습니다.

이제 세포를 저분자 화합물을 사용하여 추가로 분화시킬 준비가 되었습니다. 먼저 새로 코팅한 플레이트를 37 °C로 가온합니다. 플레이트에서 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, 콜로니 조각이 포함된 배지 4 mL씩을 각 웰에 분주한 다음, 플레이트를 흔들지 말고 조심스럽게 인큐베이터로 옮깁니다.

세포가 안착할 수 있도록 플레이트를 흔들지 마십시오. 그다음, 세포가 잠겨 있을 정도의 양만 남기고 기존 배지를 대부분 제거합니다. 세포가 건조해지지 않도록 주의해야 합니다.

basic FGF와 nicotinamide가 포함된 신선한 인간 ESL 배지를 혼합하고, 이 배지를 각 웰에 정해진 밀리리터만큼 분주합니다. 배지는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있으며, 이 기간 동안 이틀마다 세포 배양액을 교체하여 콜로니를 성장시킬 수 있습니다. 8~10일 후, 세포는 형태학적 변화를 거쳐 크고 분화된 세포들이 증식하고 층을 이루며 쌓이게 됩니다.

그다음 부유 배양을 진행합니다. 부유 배양을 시작하려면, 자발적으로 분화되어 이동하여 섬유아세포 층을 형성한 세포들로부터 ESL 콜로니를 분리하십시오. 앞서 언급한 기술을 사용하여 멸균된 피펫 팁으로 처리한 후, 부유된 분리 섬유아세포들이 포함된 기존 배지를 흡입하여 제거합니다. HESC 배지로 세포를 한 번 세척하고, 이제 멸균된 P2 피펫 팁을 사용하여 3 mL의 HESC 배지에 세포를 재부유시킵니다.

콜로니를 작은 조각으로 자르고 플레이트에서 분리합니다. 분리된 콜로니가 포함된 배지를 50 milliliter 원심분리관 하나에 모두 모읍니다. 웰을 1 milliliter의 배지로 헹구고, 이 세척액을 함께 모읍니다.

그다음, 혼합된 세포 4 mL를 초저부착 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 4~5일 동안 배양합니다. 플레이트를 인큐베이터에 보관하여 부유 세포 클러스터 또는 심근세포 전구세포(cardioblasts)가 형성되도록 하여, 이들이 박동하는 심근세포 표현형으로 발달하도록 유도합니다. 이후 배지와 함께 이들을 50 mL 원추형 튜브에 모읍니다.

그다음 세포를 1,400 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 기존 배양액을 가능한 한 많이 측정하여 제거하고, 10 millimolar nicotinamide가 포함된 신선한 심장 분화 배양액을 동일한 양으로 첨가합니다.

피펫팅을 통해 부유하는 cardio blasts를 혼합한 다음, cardio blasts 현탁액 4 mL를 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 플레이트를 37 °C 가습 배양기에 옮겨 cardio blasts가 조직 배양 플레이트에 하룻밤 동안 부착되도록 합니다. 배양 중 이틀마다 반복합니다.

8일 차에 10 mM nicotinamide가 포함된 심장 분화 배지를 교체하십시오. nicotinamide가 없는 심장 분화 배지로 변경하십시오. 이후 이틀마다 배지 교체를 계속하십시오.

니코틴아미드 제거 후 2주 이내에 박동하는 심근세포가 나타나기 시작하며 그 수가 증가합니다. 니코틴아미드는 정의된 배양 시스템에서 유지되는 인간 ES 세포가 다능성 상태에서 오직 심장 중배엽 표현형으로 전이되도록 유도하는 데 충분한 것으로 나타났습니다. 분화되지 않은 인간 ES 세포를 니코틴아미드에 노출시켰을 때, 콜로니 내의 모든 세포가 형태학적 변화를 거쳐 OCT four의 발현이 하향 조절된 커다란 분화 세포로 변하였습니다. 또한 이 세포들은 심장 특이적 전사 인자인 NK X 2.5와 alpha actinin을 발현하기 시작했습니다.

두 특성 모두 심장 중배엽 표현형과 일치합니다. 이러한 분화된 세포들은 세포가 쌓인 콜로니 영역에서 계속해서 증식하며 크기가 증가했습니다. NKX 2.5 발현은 더욱 강해졌습니다. 분리 후, 니코틴아미드 처리된 인간 ES 세포는 부유 배양에서 심장 모세포를 형성했습니다.

심장아세포(cardio blasts)의 부착을 유도한 후, 심장아세포를 니코틴아미드(nicotinamide)로 1주일 동안 처리하였습니다. 니코틴아미드 처리를 중단하고 1~2주일이 지나자, 효율이 급격히 증가하며 박동하는 심근세포가 나타나기 시작했습니다. 이들은 리드미컬하게 수축하며 맥동하는 세포 클러스터 형태로 나타났으며, IDE 처리를 거치지 않은 세포의 자발적인 다분화에서는 이러한 특성이 나타나지 않았습니다. 박동하는 심근세포 클러스터 내의 세포들은 NK X 2.5 및 alpha actinin을 포함하여 심근세포의 특성 마커들을 발현하였습니다.

박동하는 심근세포의 수축은 전기적 프로파일을 통해 강하고 리드미컬하며, 조화롭고 잘 동기화되어 있음이 확인되었으며, 임상 심전도의 체표면 전극에서 관찰되는 P-Q-R-S-T complex와 유사한 규칙적인 임펄스를 나타냈습니다. 또한, 심근세포는 기술이 숙달되면 3개월 이상 강한 수축력을 유지할 수 있었습니다. 이 기술을 적절히 수행하면 다능성 인간 배아줄기세포로부터 약 5주 만에 심장 전구세포와 박동하는 심근세포를 균일하게 생성할 수 있습니다.