Name: 작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 니코틴아미드를 이용한 작은 분자 유도법으로 인간 배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포와 수축성 심근세포를 효율적으로 분화시키는 방법을. 이 기술은 심혈관 재생 치료 연구에 활용됩니다.

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XHP은 노화에 국립 연구소 (NIHK01AG024496)와 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소 (NIHR21HD056530)에서 건강 (NIH) 보조금의 국립 연구소에 의해 지원되었습니다.

1. 솔루션 및 미디어 준비 <ol><li> 젤라틴 코팅 솔루션 : 4 0.1 % (W / V) ddH 2 O, autoclaved에 젤라틴 및 저장 ° C. </li><li> Matrigel 코팅 솔루션을 제공합니다. 증권 솔루션 : ° C 야간 10 ML 얼음처럼 차가운 DMEM이나 DMEM/F12를 추가, 잘 섞어 나누어지는 1 ML / 소독 조직 문화 후드 아래 튜브, -20에 저장 ° C. 4 느린 해동 Matrigel (10 ML) 작업 솔루션 : 천천히 녹여 4 일 ML Matrigel의 나누어지는 ° C DMEM이나 DMEM/F12를 차게 14 ML에 1-2위한 시간, 전송 및 코팅하기 전에 즉시 소독 조직 문화 후드 아래에 잘 섞는다. </li><li> 인간 laminin 코팅 솔루션 : 희석 한 ML 인간 laminin 솔루션 얼음처럼 차가운 DMEM 또는 DMEM/F12 함께 (트리스의 0.5 MG / ML -80에서 저장, NaCl을 버퍼 ° C, 1-2 시간 동안 4 ° C에서 느린 해동) 12.5 ML 작업 솔루션 (40 μg / ML) 소독 조직 문화 후드 아래에 바로 코팅하기 전에. </li><li> 성장 인자의 재고 솔루션 (500 1000X)는 10 μg의 성장 요인을 풀다멸균 버퍼 / ML (0.5 % BSA, 1.0 MM DTT, 10 % 글리세롤, 1XPBS)와 -80에서 50-100 μl / 튜브 aliquots로 저장 ° C. </li><li> HESC 미디어 : DMEM/F12 또는 KO - DMEM (80 %), KO 혈청 교체 (20 %), L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜), 가상 불필요한 아미노산 (MNAA, 1X) 및 β - 메르 캅 토 에탄올 (100 μm의), 필터링 및 4 저장 ° 사용하기 전에 20 NG / ML bFGF와 함께 보충 C,. 또는 정의된 구성 요소 "KO 혈청 교체"대체 : DMEM/F12 또는 KO - DMEM (100 %), L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜), MNAA (1X), 가상 필수 아미노산 (MEAA을 , 1X) 및 β - 메르 캅 토 에탄올 (100 μm의), 필터링 및 4 저장 bFGF (20 NG / ML)와 보충 ° C, 인간 인슐린 (20 μg / ML), 아스코르비 산 (50 μg / ML), 인간 activin (50 NG / ML), 인간 / 알부민 Albumax (10 MG / ML), 그리고 인간의 트랜스페린 (8 μg / ML)을 사용하기 전에. </li><li> HESC 심장 차별화 미디어 : DMEM/F12 (90 %), 정의 FBS (10 %), 그리고 L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜). </li><li> 미디어가 들어있는 니코틴 (NAM) : 시간을 추가하십시오 N10 mm의 최종 농도, 4 필터링, 저장 ° C와 준비 2 주 이내에 사용합니다.하는 H​​ESC 미디어 또는 HESC 심장 차별화 미디어 오전 </li></ol> 2. 플레이트 코팅 <ol><li> 와 코트 판 젤라틴 : 시간을 추가하십시오 ML / 물론 6 자 접시에 젤라틴 용액의 2.5 37 ° C 배양기에서 하룻밤 humidified 품어. </li><li> 코트 laminin과 접시 : 냉기 젤라틴 - 코팅 접시와 젤라틴 제거는, 2.5 ML 추가 / 미리 냉장에 잘 Matrigel 또는 인간의 laminin 코팅 작업 솔루션은 4 ° C 하루에 6 접시와 잘 부화를 gelatinized. </li></ol> 3. 정의된 조건 하에서 Undifferentiated hESCs를 Passaging 및 심는 <ol><li> hESC의 식민지가 5~7일 나이로 성장할 수 있도록하고, 해부 현미경 (사전 따뜻한 37 단계를 해부 ° C) 소독 후드를 해부 아래에 hESC 문화 플레이트 가져가라. </li><li> hESC의 식민지가 분할을 선택합니다. Morphologically이 식민지 (SM&gt; 75% undifferentiated hESCs이 있어야합니다해부 현미경 아래에 뚜렷한 모서리와 함께 일반적으로 약간 불투명한 모든 소형 전지), (하지 하얀 쌓여 업 세포가 아닌 명백한 차별화된 세포). 신중하게 선택한 식민지 개요 및 P2 멸균 피펫 팁의 가장자리와 식민지이나 유리 모세관 뽑아 (있을 경우)은 식민지를 둘러싼 차별 fibroblast 계층과 모든 차별화된 부분을 제거합니다. </li><li> aspirating로 부동 분리된 차별화된 세포를 포함하는 기존의 미디어를 제거합니다. 한번 hESC 미디어 (bFGF없이)로 씻으십시오. 3 ML 추가 / 20 NG / ML bFGF를 포함하는 잘 신선한 hESC 미디어. </li><li> 작은 조각으로 undifferentiated hESC의 식민지 잘라하고, 멸균 피펫 팁 또는 모세관 뽑아 유리 분리합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에서 함께 분리 식민지 조각을 포함하는 미디어 풀. 1 ML / 함께 20 NG / ML bFGF와 수영장을 포함하는 잘 hESC 미디어와 함께 한 접시를 씻으십시오. </li><li> 코팅 신선한 접시에서 Matrigel 또는 인간의 laminin 솔루션을 기음. 나누어지는 4 ML / 잘 HESC 미디어는 6 잘 판에 식민지 조각을 포함하는. 부드럽게 떨지 않고 배양기에 플레이트를 전송하고 5 % CO 2 분위기 humidified 37 ° C 배양기에서 방해없이 식민지 조각의 씨앗이 하룻밤 수 있습니다. </li></ol> 4. 니코틴과 정의 문화 체제에서 hESCs의 심장 유도 <ol><li> 시딩 후 3 일에, 접시 각 우물에서 이전 미디어의 대부분을 제거하고 hESC의 식민지 (hESCs가 건조 절대로 용납할) 빠져들 수 있도록 충분한 미디어를 두십시오. 20 NG / ML bFGF와 10 MM의 니코틴 (NAM)이있는 4 ML / 물론 신선한 hESC 미디어로 바꿉니다. </li><li> 20 NG / ML bFGF와 10 MM NAM 매일을 포함하는 신선한 hESC 매체와 오래된 미디어를 교체하고, 심장 유발 hESC의 식민지 일 8-10에 성장 수 있습니다. NAM에 노출되면, 식민지 내의 모든 세포가 번식에 계속 큰 차별화된 세포 형태 변화를 받아야합니다. 식민지는, 크기, 그리고 하루 8-10 증가합니다D 세포는 식민지의 일부 지역에서 무더기로 쌓이기 시작합니다. </li></ol> 5. 서스펜션 문화 평생 심장 차별화 <ol><li> 멸균 후드를 해부 아래 현미경 (미리 따뜻한 37 단계를 해부 ° C) 해부에 hESC 문화 플레이트를 가져가라. 조심스럽게 식민지 개요 및 P2 멸균 피펫 팁의 가장자리와 식민지를 둘러싼 fibroblast 층 (차별화된 세포 식민지 밖으로 마이 그 레이션)을 제거하거나 유리 모세관 뽑았. </li><li> aspirating로 부동 분리 fibroblast 세포를 포함하는 기존의 미디어를 제거합니다. 한번 hESC 미디어 (bFGF없이)로 씻으십시오. 3 ML / 물론 신선한 hESC 미디어 (bFGF없이) 추가합니다. </li><li> 작은 조각으로 심장병 유발 hESC의 식민지 잘라하고, 멸균 피펫 팁 또는 모세관 뽑아 유리 분리합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에서 함께 분리 식민지 조각을 포함하는 미디어 풀. 함께 한 ML / 잘 hESC 미디어 (bFGF 제외) 수영장과 함께 한 접시를 씻으십시오. </li><li> 나누어지는 4m37 6 잘 ultralow 첨부 플레이트와 부화 식민지 조각을 포함하는 L / 잘 혈청 무료 hESC 미디어 ° C 배양기가 떠있는 세포 클러스터 (cardioblasts)가 4-5일에 대한 양식 수 있도록 humidified. </li></ol> 6. 접착제 문화 Cardiomyocyte 표현형의 성숙을 박동 <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 함께 떠 cardioblasts를 포함하는 미디어 풀. 5 분 1,400 rpm으로 원심 분리기. 당신이 할 수만큼 기존의 미디어를 대기음 10 MM NAM을 포함하는 신선한 hESC 심장 차별화 미디어의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 4 ML / 잘 6 잘 접시에 부동 cardioblasts과 나누어지는를 섞어 아래 피펫합니다. 37에 접시를 전송 ° C humidified 인큐베이터가 cardioblasts가 밤새 첨부할 수 있습니다. </li><li> 매일 10 MM NAM을 포함 hESC 심장 차별 미디어를 교체합니다. </li><li> 일 8시, NAM없이 hESC 심장 차별화 미디어로 교체하고, HESC 심장 차별화 미디어 E를 교체 계속아주 다른 일. 잔 cardiomyocytes는 NAM의 철수 이후 지속적으로 재배 1-2에 대한 주에 나타나는 시간과 수치가 증가하기 시작하며, 3 개월 이상 강한 리듬 수축을 유지 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : 니코틴은 (NAM) 전용 cardiomesodermal 표현형 (그림 2B)로 pluripotency에서 전환 정의된 문화 시스템에 유지 hESCs을 유발하기에 충분 렌더링됩니다. NAM에 undifferentiated hESCs의 노출시, 식민지 내의 모든 세포가 월 4의 표현을 다운 조절하고 심장 특정 전사 인자 (Csx) Nkx2.5과 α -을 표현하기 시작되는 큰 차별화된 세포 형태 변화를 받게 될 것이다 cardiomesoderm의 표현형 (그림 2B)과 일치 actinin. 이러한 차별화된 세포는 번식이 계속되고 식민지의 크기가 증가합니다. Nkx2.5의 증가 강도됩니다보통 세포 (그림 2B)가 무더기로 쌓이기 시작 식민지의 영역에서 관찰됩니다. 분리된 후, 남구 처리 hESCs는 심장 차별화 과정을 계속하기 위해 서스펜션 문화에 떠있는 세포 클러스터 (cardioblasts) 양식을 것입니다. cardioblasts이 첨부 허락하고 1 주일 NAM과 함께 치료를 계속하면, 박동 cardiomyocytes은 자연의 여러 혈통 분화에 비해 효율의 대폭 증가와 NAM의 철수 이후 지속적으로 재배 약 1-2 주후에 나타나기 시작합니다 같은 기간 (그림 2C) 이상 치료를하지 않고 hESCs. 박동 cardiomyocyte 클러스터 내의 세포는 Nkx2.5과 α - actinin (그림 2C)를 포함 cardiomyocytes의 특성 마커를 표현합니다. 박동 cardiomyocytes의 수축은 P 연상 정기 충동과 강한 리듬, 잘 조율된, 그리고 잘 개입하는 전기 프로필에 의해 확인되었다- QRS - T - 단지 임상 electrocardiograms의 신체 표면 전극에서 본 (그림 2C, 또한 비디오 참조). cardiomyocytes은 3 개월 이상 자신의 강력한 수축성을 유지 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 전문 기능성 세포 향한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 차별 화를위한 작은 분자 유도 방식 간의 기존 접근 방식의 전체 구조. 자연 배아 계층 분화를 통해 인간의 pluripotent 줄기 세포의 멀티 혈통 경사를 사용하여 종래의 접근 방식 (A) 설계도. 독점적으로 작은 분자의 간단한 규정에 의한 특정 임상 - 관련 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 잘 제어 효율 유도의 (B) 설계도. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 니코틴은 정의된 조건과 cardiomyocytes를 치고 향해 진행에 따라 pluripotency의 직접적인 심장 혈통 사양을 유도. (A) 도식은 hESCs의 지시 심장 분화의 프로토콜 시간 라인 묘사. (B) 정의된 문화 시스템에 따라 니코틴 (NAM)에 undifferentiated hESCs의 노출되면 큰 차별 월 4 식민지 이내 (적색) 부정적인 세포로 제어로 모의 - 대우 (DMSO) hESCs에 비해 등장하기 시작했다. 남구 유발 월 4 부정적인 세포는 초기에 심장 차별화와 일치하는 표현 Nkx2.5 (녹색)과 α - actinin (빨간색), 시작했다. Nkx2.5의 점진적 증가 강도는 일반적으로 세포가 무더기로 쌓이기 시작 식민지의 영역에서 관찰되었다. 모든 세포들은 핵의 DAPI의 얼룩 (파란색)으로 표시됩니다. (C) 남구 유도된 심장 - 헌신 hESCs는 세포 clus에 의해 평가, 효율성의 급격한 증가와 함께 뛰는 cardiomyocytes이 나왔고리듬 수축 (electrophysiological 프로필과 동영상을 참조), Nkx2.5 (녹색)과 α - actinin (적색)에 대한 immunopositive 표시 ters. 심장 근육을 수축 대표의 대표적인 대형 구타 cardiomyocyte 클러스터 및 높은 전력 이미지의 위상 이미지 (또한 해당 동영상 참조) 표시됩니다. 화살표는 electrophysiological 레코딩에 사용되는 대형 박동의 cardiomyocyte 클러스터를 나타냅니다. 박동 cardiomyocytes의 Electrophysiological 프로필 임상 electrocardiograms에서 본 P - QRS - T - 단지 연상 정기적으로 개입, 리듬 충동을 보여줍니다. 스케일 바 : 0.1 mm. 비디오 : 남구 유도 hESCs에서 차별 cardiomyocytes을 계약. 비디오 1, 2 쇼 대표 대용량 첨부 파일이 후 약 1, 3 달 cardiomyocyte 클러스터 박동. 비디오 3 높은 전력으로 심장 근육을 계약 4보기 담당자가. 비디오 5 typica을 보여줍니다리터 작은 구타 cardiomyocyte 클러스터는 저절로 제어로 NAM 치료없이 hESCs에서 차별. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">동영상 1 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">비디오 2를 볼하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">비디오 3 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">비디오 4 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">동영상 5 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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<li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언합니다. XHP는 Xcelthera의 창시자이다. XHP 및 EYS는 hESCs에 관련된 지적 재산권을 가지고.

발달 연구와 임상 번역 모두의 주요 과제 중 하나는 효율적이고 예측할 원하는 표현형에 pluripotent 인간 줄기 세포의 광범위한 차별 잠재력을 채널로하는 방법되었습니다. 이러한 세포에 여러 혈통 골재 단계를 통해 이동하여 모든 세균 레이어의 세포로 체외에서 자발적으로 구별 수 있지만 hESC - 파생 전용 멀티 혈통 집계 (embryoid 기관), 세포의 매우 작은 분수 (&lt;2 %) 자발적 cardiomyocytes 13-15 (그림 1A)로 구분. 다음 immunoselection, cardiomyocytes의 풍부한 인구가 동물 모델 13 마음에 분사 다음과 같은 기계적 및 전자 손상된 myocardium의 기능을 구조하기 위해 생물 학적 맥박 조정기와 같은 기능을 수있었습니다. 설치류 infarcted 모델, engrafted hESC - 파생 심장 progenies 살 및 12 주가 성숙 수 있었던, 그리고 부분적으로 remuscular부상자 마음을는 어때하고 수축성 기능 14,15을 향상시킵니다. 그러나, 다중 혈통 pluripotent 세포의 분화 및 tumorigenicity 다음 이식의 높은 위험을 통해 인간의 심장 - 최선을 다하고 세포를 생성하는 비효율 추가 임상 번역을 방해했습니다. 심장 표현형에 독점적으로하고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널 전략을 개발하는 것은 harnessing 심장 분야에서 hESC 생물학의 능력에 매우 중요합니다. 특정 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 일정한 변환을 달성하기 위해, 우리는 임상 - 관련 혈통 특정에 독점적으로 pluripotent의 hESCs의 잘 제어 효율 유도 조건을 식별하는 undifferentiated hESCs의 확산을 할려고 수있는 정의된 문화 시스템을 채용 작은 분자의 단순한 제공 (그림의 1B)에 의해. 우리는 직접 P로부터 유도된 심장 니코틴 - 혈통 노력을 발견더 높은 효율 (그림 2)와 함께 cardiomyocytes을 치고으로 진행되고 정의 문화에 따라 luripotent hESCs. Nkx2.5은 인간의 선천성 심장 질환 (CHD), 가장 일반적인 인간의 선천성 16과 관련된 유전자의 정상적인 심장 개발 및 돌연변이에 대한 필수 evolutionally 보존 homeobox의 전사 인자이다. Nkx2.5 표현까지 모든 척추 동물에서 검사 심장 전구체 세포에 대한 최초의 표지이며 적절한 심장 septation 및 형성 / 전기 전도 시스템 16 성숙을 위해 필수적입니다. 척추 동물에서 초기 Nkx2.5 표현의 증상과 패턴은 대략 초기 embryogenesis의 심장 사양의 타이밍 지역과 일치하고, Nkx2.5 유전자는 심장 16 개발을 통해 표현되고 있습니다. 우리 hESC 모델에서 NAM은 심장 특정 transcri의 표현을 장려하여 pluripotent hESCs에서 직접 심장병 유도를 실행하는 데 등장인간의 배아 cardiogenesis에 pluripotent epiblast에서 cardiomesoderm의 사양을 에뮬레이트 수 과정에 ption 팩터 Nkx2.5. 미래 연구는 재생 요법에 대한 임상 - 관련 lineages를 파생하면 hESC의 pluripotent 운명의 작은 분자 중재 직접 제어 및 모듈 레이션을위한 방법을 포장 수있는, 대안으로 인간 심장 개발 유전 및 epigenetic 조절 분자를 보여줄 것입니다. NAM 처리하지 않고, &lt;2 % hESCs가 cardiomyocytes 12-15을 치고으로 자발적인 차별을 받아야합니다. NAM 치료와 함께, 우리는 인간의 배아 심장 개발에 12 에뮬레이트 수도 과정에서 정의하는 문화에 따라 유지 hESCs에서&gt; 95% 배아 심장 엽 성의 전구 물질과&gt; 50 % 구타 cardiomyocytes를 생성할 수있게되었습니다. 최근 알려진 심장 - 운명 결정하는 유전자는 &lt;0.5 % 17, 18의 낮은 효율성 포스트 산후 박동 cardiomyocytes에 마우스 섬유아 세포를 transdifferentiate하는 데 사용되었습니다 &lt;/&gt;를 한모금. 그러나, 다시 프로그램 체세포 역사적으로 비정상적인 유전자 발현 및 장애 치료 유틸리티를 19-21로 가속 노화와 관련된되었습니다. 마지막으로, 우리가 여기 설립 프로토콜은 내부 세포 덩어리 (ICM) 또는 4,5 인간 blastocyst의 epiblast에서 파생된 pluripotent hESCs로 제한됩니다 이전 morula에서 파생된 동물 - 기원 ESCs, ESCs 등 다른 pluripotent 세포에 적용되지 않을 수도 있습니다 (8 셀) - 무대 배아 22, 그리고 인위적으로 다시 프로그램 세포 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> bioscience BD </td><td> 356,231 </td><td> 성장 요인은 감소 </td></tr><tr><td> 인간 laminin </td><td> 시그마 </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> 니코틴 </td><td> 시그마 </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM - KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> 노크 아웃 혈청 대체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> 가상 불필요한 아미노산 솔루션 (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> 가상 아미노산 솔루션 (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> 시그마 </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 트랜스페린 </td><td> 시그마 </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF - 100 - 18B </td><td></td></tr><tr><td> 인간 인슐린 </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 activin </td><td> PeproTech </td><td> 120 14E </td><td></td></tr><tr><td> 정의 FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073 - 03 </td><td></td></tr><tr><td> 6 잘 ultralow 첨부 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 잘 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

작은 분자와 유도 pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 cardiomyocytes의 효율 유도

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

날짜하려면 적합한 인간 심장 세포 소스의 부족 중 세포 기반 이식이나 심장 조직 공학 1-3으로 재생 인간 myocardium의 주요 좌절되었습니다. Cardiomyocytes은 출생 직후 말기 - 차별되고 세포 분열 따위에 의해 번식하는 능력을 잃게됩니다. 같은 골수 또는 탯줄 혈액 등 다른 소스에서 파생된 줄기 / 전구 세포가, 1-3 심장에 이식 다음과 수축성 심장 근육 세포에 야기할 수있는 증거는 없습니다. 손상된 심장 근육을 재생 또는 수리 필요는 성인 줄기 세포 치료, 중 내생 또는 1-3 셀 전송을 통해 충족되지 않았습니다. 유전자 안정적인 인간의 배아 줄기 세포 (hESCs)가 필요 혈통에 제한 인간의 체세포의 대형 공급의 체외의 유도에 대한 pluripotent 저수지를 proffering, 무제한 확장 능력과 무제한 소성을 가지고수리 및 재생 4,5니다. 기증 장기의 부족과 세계적으로 급성 심장 혈관 질환의 유행으로 인해, 다른 접근 방법으로 개발 hESC 기반 요법에 강렬한 관심이 있습니다. 그러나, 원하는 표현형에 효율적이고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널하는 방법을 개발 연구와 임상 번역 모두에 큰 도전을했습니다. 종래의 접근 방식은 종종 phenotypic 이질과 불안정, 따라서, tumorigenicity 6-8의 높은 위험 (에 회로도를 참조하여 다음입니다 비효율적과 지나치게 혈통 - 노력의 결과로, 자연 배아 계층 분화를 통해 pluripotent 세포의 멀티 혈통 기울기에 의존 그림. 1A). 또한, 정의되지 않은 외국인 / 동물 생물 학적 보조 및 / 또는 일반적으로 격리, 확장, 그리고 hESCs의 분화에 사용되었습니다 모이통는 세포 speciali 직접 사용 할 수 있습니다9-11 문제 환자에 이식 제드 자형의 것. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 임상 - 적합한 hESCs의 드 노보 유도를위한 플랫폼으로 제공, 필요한 hESCs의 epiblast pluripotence를 유지하기에 충분 정의된 문화 시스템의 요소를 해결하고 효과적으로 임상 - 관련 lineages 방향으로 균일하게 같은 hESCs를 지시하고있다 작은 분자로 12 (그림 설계도를 참조하십시오. 1B). 작은 분자와 성장 요인의 다양한 상영 후, 우리는 이러한 정의 조건이 있습니다 (그림 2 더 높은 효율과 인간의 박동 cardiomyocytes을 생성 cardioblasts로 진행 pluripotent의 hESCs에서 직접 cardiomesoderm의 사양을 유발하는 니코틴 (NAM)가 충분한 렌더링 발견 ). 우리는 잘 제어 효율적인 파생을 가능하게 개입 멀티 혈통 embryoid 바디 단계없이 pluripotent hESCs에서 직접 cardioblasts의 유도에 대한 조건을 정의세포 기반 치료제에 대한 개발 단계의 스펙트럼에 걸쳐 인간의 심장 세포의 대형 공급하고 있습니다.

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

현재까지 적절한 인간 심장 세포원의 부재는 세포 기반의... 를 통한 인간 심근 재생의 주요한 걸림돌이 되어 왔습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 저분자 유도 물질을 사용하여 다능성 인간 배아 줄기세포로부터 직접적이고 배타적으로 심장 계통의 후손 세포를 유도하는 것입니다. 이는 정의된 조건 하에서 유지된 미분화 인간 ES 세포에 니코틴아미드를 첨가함으로써 달성됩니다. 그 다음으로, 심장 분화 세포를 분리하여 부유 배양 상태의 부유 세포 클러스터인 카디오 블라스트(cardio blasts)를 형성합니다.형성된 심장모세포(cardioblasts)를 심장 분화 배지에 부착시키면 박동하는 심근세포로 계속 발달합니다. 최종적으로, 디콘볼루션(deconvolution) 또는 공초점 현미경을 이용한 면역형광 염색과 전기생리학적 기록을 통해 결과를 평가합니다. 이 기술의 주요 장점은 소분자 화합물을 간단히 제공함으로써 다능성 인간 배아줄기세포를 심장 계통으로만 효율적으로 유도할 수 있다는 점입니다.기존의 다분화 방법에서는 극소수의 세포만이 심장 표현형을 나타냅니다. 스톡 용액을 준비할 때 주의해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. Matrigel과 human laminin은 -80 °C에서 4 °C로 하룻밤 동안 천천히 해동하고, 배지는 4 °C에서 보관하며, 사용 전에는 항상 배지를 37 °C로 가온하십시오.또한, 인간 ES 세포 배지를 준비할 때 일부 보충제는 사용 직전에 첨가합니다. 여기에는 bFGF, 아스코르브산, human insulin 및 transferrin이 포함됩니다. 다음으로, 플레이트 코팅 직전에 Matrigel 또는 인간 laminin 작업 용액을 만듭니다.젤라틴이 사전 코팅된 조직 배양 플레이트가 준비되면, 5% carbon dioxide 조건의 37 °C에서 플레이트를 배양합니다. 젤라틴은 matrigel 또는 laminin 작업 용액으로 대체할 수 있습니다. 이 플레이트들은 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 코팅합니다.먼저 인간 ES 세포 콜로니를 5~7일 동안 배양한 후, 그 중 일부를 계대 배양할 준비를 합니다. 미분화된 인간 ES 세포가 75% 이상 포함된 콜로니를 선택하십시오. 이러한 콜로니는 보통 경계가 뚜렷하고 세포가 층을 이루며 쌓여 있어 약간 불투명하게 보입니다. 분화가 시작되었다는 신호로, 대부분 분화된 세포를 포함하는 흰색 콜로니는 보통 투명하게 보입니다.흰색이나 투명한 콜로니는 선택하지 마십시오. 플레이트를 빛에 비추어 보고, 플레이트 바닥면에 있는 약간 불투명한 콜로니의 외곽선을 따라 마커로 표시하십시오. 멸균된 P2 피펫 팁의 끝을 사용하여 인간 ES 세포 콜로니 주변의 섬유아세포 층을 분리하십시오.그런 다음 주변의 섬유아세포를 제거하고 콜로니의 분화된 부분들을 모두 제거합니다. 이제 분리된 분화 세포들이 포함된 기존 배지를 흡입하여 제거합니다. 다음으로 각 웰의 미분화 세포를 bFGF가 없는 인간 ES 세포 배지로 한 번 세척한 후, 사용 직전에 bFGF를 첨가한 신선한 인간 ES 세포 배지 3 mL를 추가합니다.이제 멸균된 P2 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 작은 조각으로 자르고 플레이트에서 떼어냅니다. 떼어낸 콜로니 조각들을 배지와 함께 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 각 웰당 1 mL의 배지로 추가 헹굼 과정을 수행하여 옮겨 담습니다.이제 세포를 저분자 화합물을 사용하여 추가로 분화시킬 준비가 되었습니다. 먼저 새로 코팅한 플레이트를 37 °C로 가온합니다. 플레이트에서 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, 콜로니 조각이 포함된 배지 4 mL씩을 각 웰에 분주한 다음, 플레이트를 흔들지 말고 조심스럽게 인큐베이터로 옮깁니다.세포가 안착할 수 있도록 플레이트를 흔들지 마십시오. 그다음, 세포가 잠겨 있을 정도의 양만 남기고 기존 배지를 대부분 제거합니다. 세포가 건조해지지 않도록 주의해야 합니다.basic FGF와 nicotinamide가 포함된 신선한 인간 ESL 배지를 혼합하고, 이 배지를 각 웰에 정해진 밀리리터만큼 분주합니다. 배지는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있으며, 이 기간 동안 이틀마다 세포 배양액을 교체하여 콜로니를 성장시킬 수 있습니다. 8~10일 후, 세포는 형태학적 변화를 거쳐 크고 분화된 세포들이 증식하고 층을 이루며 쌓이게 됩니다.그다음 부유 배양을 진행합니다. 부유 배양을 시작하려면, 자발적으로 분화되어 이동하여 섬유아세포 층을 형성한 세포들로부터 ESL 콜로니를 분리하십시오. 앞서 언급한 기술을 사용하여 멸균된 피펫 팁으로 처리한 후, 부유된 분리 섬유아세포들이 포함된 기존 배지를 흡입하여 제거합니다. HESC 배지로 세포를 한 번 세척하고, 이제 멸균된 P2 피펫 팁을 사용하여 3 mL의 HESC 배지에 세포를 재부유시킵니다.콜로니를 작은 조각으로 자르고 플레이트에서 분리합니다. 분리된 콜로니가 포함된 배지를 50 milliliter 원심분리관 하나에 모두 모읍니다. 웰을 1 milliliter의 배지로 헹구고, 이 세척액을 함께 모읍니다.그다음, 혼합된 세포 4 mL를 초저부착 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 4~5일 동안 배양합니다. 플레이트를 인큐베이터에 보관하여 부유 세포 클러스터 또는 심근세포 전구세포(cardioblasts)가 형성되도록 하여, 이들이 박동하는 심근세포 표현형으로 발달하도록 유도합니다. 이후 배지와 함께 이들을 50 mL 원추형 튜브에 모읍니다.그다음 세포를 1,400 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 기존 배양액을 가능한 한 많이 측정하여 제거하고, 10 millimolar nicotinamide가 포함된 신선한 심장 분화 배양액을 동일한 양으로 첨가합니다.피펫팅을 통해 부유하는 cardio blasts를 혼합한 다음, cardio blasts 현탁액 4 mL를 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 플레이트를 37 °C 가습 배양기에 옮겨 cardio blasts가 조직 배양 플레이트에 하룻밤 동안 부착되도록 합니다. 배양 중 이틀마다 반복합니다.8일 차에 10 mM nicotinamide가 포함된 심장 분화 배지를 교체하십시오. nicotinamide가 없는 심장 분화 배지로 변경하십시오. 이후 이틀마다 배지 교체를 계속하십시오.니코틴아미드 제거 후 2주 이내에 박동하는 심근세포가 나타나기 시작하며 그 수가 증가합니다. 니코틴아미드는 정의된 배양 시스템에서 유지되는 인간 ES 세포가 다능성 상태에서 오직 심장 중배엽 표현형으로 전이되도록 유도하는 데 충분한 것으로 나타났습니다. 분화되지 않은 인간 ES 세포를 니코틴아미드에 노출시켰을 때, 콜로니 내의 모든 세포가 형태학적 변화를 거쳐 OCT four의 발현이 하향 조절된 커다란 분화 세포로 변하였습니다. 또한 이 세포들은 심장 특이적 전사 인자인 NK X 2.5와 alpha actinin을 발현하기 시작했습니다.두 특성 모두 심장 중배엽 표현형과 일치합니다. 이러한 분화된 세포들은 세포가 쌓인 콜로니 영역에서 계속해서 증식하며 크기가 증가했습니다. NKX 2.5 발현은 더욱 강해졌습니다. 분리 후, 니코틴아미드 처리된 인간 ES 세포는 부유 배양에서 심장 모세포를 형성했습니다.심장아세포(cardio blasts)의 부착을 유도한 후, 심장아세포를 니코틴아미드(nicotinamide)로 1주일 동안 처리하였습니다. 니코틴아미드 처리를 중단하고 1~2주일이 지나자, 효율이 급격히 증가하며 박동하는 심근세포가 나타나기 시작했습니다. 이들은 리드미컬하게 수축하며 맥동하는 세포 클러스터 형태로 나타났으며, IDE 처리를 거치지 않은 세포의 자발적인 다분화에서는 이러한 특성이 나타나지 않았습니다. 박동하는 심근세포 클러스터 내의 세포들은 NK X 2.5 및 alpha actinin을 포함하여 심근세포의 특성 마커들을 발현하였습니다.박동하는 심근세포의 수축은 전기적 프로파일을 통해 강하고 리드미컬하며, 조화롭고 잘 동기화되어 있음이 확인되었으며, 임상 심전도의 체표면 전극에서 관찰되는 P-Q-R-S-T complex와 유사한 규칙적인 임펄스를 나타냈습니다. 또한, 심근세포는 기술이 숙달되면 3개월 이상 강한 수축력을 유지할 수 있었습니다. 이 기술을 적절히 수행하면 다능성 인간 배아줄기세포로부터 약 5주 만에 심장 전구세포와 박동하는 심근세포를 균일하게 생성할 수 있습니다.

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

여기에서는 소분자 조절 심장 분화와 포도당 결핍 매개 심근세포 정제를 결합하여 심혈관 질환 모델링 및 약물 스크리닝을 위해 정제된 심근세포를 생산할 수 있는 인간 심근세포 유도를 위한 강력한 프로토콜을 설명합니다.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

in vitro에서 만능 줄기 세포에서 심근 세포를 생성하면 기초 과학 및 임상 응용을 위해 많은 양의 in vitro 심장 조직에 접근할 수 있습니다.  이 프로토콜은 심방화 인자 Grem2를 사용하여 얻은 심근세포의 수를 증가시키고 심방 표현형을 가진 심근세포를 생성합니다.

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

여기에서는 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 위한 강력하고 빠르며 확장 가능한 심근세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 이 대규모 방법을 사용하여 파생된 심근세포는 인간 심혈관 질환 모델링, 고처리량 약물 스크리닝 및 잠재적인 임상 응용 분야에서 효과적으로 사용할 수 있는 충분한 세포 수를 제공할 수 있습니다.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

여기에 제시된 것은 고처리량, 다차원 형식으로 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 스페로이드(CS)의 생성 및 냉동 보존을 위한 일련의 프로토콜입니다. 이 3차원 모델은 질병 모델링, 고처리량 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼 역할을 하며 냉동 보존 후에도 기능을 유지합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

학습하세요 니코틴아미드를 이용한 작은 분자 유도법으로 인간 배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포와 수축성 심근세포를 효율적으로 분화시키는 방법을. 이 기술은 심혈관 재생 치료 연구에 활용됩니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

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