Name: 양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 배우세요 종양 조직 전체에서 단백질 발현의 이질성을 정량적으로 매핑하는 방법을. 면역형광과 AQUA 이미지 분석 시스템을 사용하여 암 바이오마커의 공간적 변화를 시각화하고 Simpson 지수로 이질성을 수치화합니다.

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,이 작품은 스코틀랜드 기금위원회 (부여 번호 HR07005에 의해 부분적으로 지원되었다 <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> , 의료 연구 스코틀랜드 () <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), 암 연구 영국의 실험 의학 암 센터 ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), 그리고 혁신적인 유방암 ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. 조직 준비 <ol class="lalpha"><li> Microtomy <ol class="lroman"><li> 제 포르말린 고정 파라핀은 로터리 마이크로톰를 사용하여 4 μm의 두께에 종양 블록을 내장. </li><li> 적극적으로 청구 현미경 슬라이드에 섹션을 놓습니다. </li><li> 37 ° C 오븐 새벽에 슬라이드를 품어. </li></ol></li><li> 저장 <ol><li> -18에 저장 섹션 ° C -25 ° C에 냉동고, 항원성의 손실을 방지하기 위해서. </li></ol></li></ol> 2. 조직 섹션의 Immunofluorescence <ol class="lalpha"><li> Dewaxing 및 Rehydration <ol class="lroman"><li> Dewax 5 분 두번 크실렌에서 슬라이드. </li><li> 99 % 99 % 80 %, 에탄올 50 %와 순서로 각 2 분 수돗물을 실행에 슬라이드를 Rehydrate. </li></ol></li><li> 항원 불러오기 <ol class="lroman"><li> MI 5 분 압력 밥솥에서 0.15 MM 나트륨 구연산, 산도 6.0 버퍼를 사용하여 열을 유발 항원 검색을 수행crowave. </li><li> 20 분에 대한 슬라이드를 시원한 시간을 보내세요. </li><li> 로커에서 5 분 0.05 %의 PBST에서 슬라이드를 씻어. </li></ol></li><li> 절차를 차단 <ol class="lroman"><li> 10 분 3 %의 과산화수소에 섹션을 처리합니다. </li><li> 로커에서 5 분 0.05 %의 PBST에서 슬라이드를 씻어. </li><li> Sequenza의 Immunostaining 걸이에 섹션을 추가합니다. </li><li> 10 분에 대한 혈청 단백질 무료로 블록에서 섹션을 처리합니다. </li></ol></li><li> 차 항체 인큐베이션 <ol class="lroman"><li> 부화 차 항체는 실온에서 1 시간 Dako의 항체 희석액에 최적의 희석에 희석. </li><li> 5 분마다 세 번 PBST 0.05 %로 린스. </li></ol></li><li> 상피 마스크 (Cytokeratin) 인큐베이션 <ol class="lroman"><li> 4 박 Dako의 항체 희석액에 1시 50분을 희석 부화 마우스 안티 팬 cytokeratin, ° C. </li></ol></li><li> 상피 마스크 시각화 <ol class="lroman"><li> 염소 방지 마우스 Alexa555 s의 1시 25분 희석 준비미리 희석에 econdary 항체 염소 - 토끼 HRP 항체 솔루션을 구상. 상온에서 1.5 시간 동안 짙은 어둠 속에서 슬라이드를 품어. </li><li> 5 분마다 세 번 PBST 0.05 %로 린스. </li></ol></li><li> 대상 시각화 <ol class="lroman"><li> Sequenza에서 습도 챔버에 슬라이드를 전송합니다. </li><li> 1시 50분 농도에서 대상 신호 증폭 희석제 (HistoRx 욕조 E)와 Cy5 Tyramide을 (HistoRx 튜브 F) 결합합니다. 철저하게 섞어 소용돌이. 상온에서 10 분 동안 짙은 어둠 속에서 슬라이드를 품어. </li><li> 5 분마다 세 번 PBST 0.05 %로 린스. </li><li> 1 분 80 %의 에탄올에 슬라이드를 탈수. </li><li> 어둠 속에서 공기가 건조 슬라이드. </li></ol></li><li> Counterstaining 및 coverslipping <ol class="lroman"><li> coverslips에 DAPI 장착 매체를 적용하고 조직 섹션을 통해 coverslips 넣습니다. </li><li> 어둠 속에서 하룻밤 건조 슬라이드. </li><li> 슬라이드는 실내에 매니큐어와 보안 건조 후반드시 장기 보존 및 4 ° C의 냉장고에 보관. </li></ol></li></ol> 3. 전체 섹션 검색을 사용하여 이미지 캡처 <ol class="lalpha"><li> Aperio ScanScope FL 슬라이드 스캐너의 슬라이드 카세트에서 다섯 슬라이드까지로드합니다. </li><li> 각 슬라이드 들어, ScanScope 콘솔의 인터페이스를 사용하여 이미지를 일반적인 영역을 선택합니다. 에 관계없이 패턴이나 샘플의 다른 측면을 관찰할 수 염색법의 슬라이드에있는 모든 조직을 포괄하는 지역을 선택합니다. </li><li> 각 채널 (DAPI, Cy3과 Cy5) 다음과 같은 최적의 노출을 결정을 위해, ScanScope 콘솔을 사용 : <ol class="lroman"><li> 심문하기 위해 조직의 영역을 선택 -이 영역은 이상, 최고의 표현을 제공하는 조직의 종양이 지역에 있어야합니다. </li><li> ScanScope 콘솔 autoexposure 기능을 사용하여 이미지 초점과 함께, 각 채널에 대한 제안 노출 시간을 평가합니다. </li><li> 공동 각 샘플의 3-5 지역까지 이상 반복가치의 안정성을 nfirm. </li></ol></li><li> 플랫 필드 보정 이미지가 각각의 필터에 대한 취득한 것입 배경 영역을 정의하려면 여전히 슬라이드의 coverslipped 지역 내에서 아직 멀리 조직에서 추가 지역 (로 ScanScope 콘솔 이미지에 블루 다이아몬드로 표시)를 선택합니다. </li><li> 이전 이미지 수집 이러한 이미지를 검토합니다. 이미지가 높은 배경이나 다른 이미지 유물을 보인다면, 이미지 지역은 이동과 새로운 이미지를 취득해야합니다. </li><li> 획득 디지털 슬라이드 이미지는 Aperio 스펙트럼 데이터베이스에 자동으로 업로드됩니다. </li></ol> 4. 아쿠아 자동 이미지 분석 <ol class="lalpha"><li> 스펙트럼 데이터베이스에 디지털 전체 슬라이드 이미지를보기 및 전체 조직 및 얼룩 패턴 (들)의 맥락에서 관심 종양 영역을 주석. </li><li> 두 엄지손가락을 클릭하여 스펙트럼 데이터베이스에 디지털 슬라이드 목록에서 AQUAnalysis를 사용하여 분석할 수있는 슬라이드를 선택손톱 이미지 (또는 이미지 옆의 체크 박스를 선택하고 선택한 다음 목록의 상단에있는 메뉴에서 '이미지보기'). 이것은 자동으로 ImageScope 소프트웨어와 조직 샘플의 색상 병합된 이미지를 엽니다. </li><li> 제공된 도구를 사용하여 이미지를 탐색할 수이 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 동반 H &amp; E을 (실제 슬라이드 또는 주석 이미지)를 사용하여 형광 이미지의 관심 영역을 주석. 관심의 여러 지역, 개인, 지역 동그라미 하나의 샘플에서 선택할 수 있습니다. 선택한 지역 내의 지역 (예 : 손상된 조직, 가난한 조직학의 영역이 아닌 종양 분야, 이물질 등) 제외하는 데 사용되는 '부정적인'도구도 있습니다. </li><li> 이미지에 주석 레이어 (들)을 저장합니다. </li><li> 스펙트럼 메인 메뉴로 돌아가기하고 주석했던 이미지 옆에있는 확인란을 선택합니다. 목록의 맨 위에있는 메뉴 스트립에서 '분석'을 선택합니다. </li><li> 분석 창에서있는가 sele을 것이다풀다운 메뉴에서 중부 표준시 "HistoRx 아쿠아 분석". </li><li> 주석의 여러 레이어가있는 경우, 분석을위한 적절한 레이어 (들)을 선택하십시오 확인란을 사용합니다. </li><li> '분석'버튼을 언제 시작할 준비를 누르십시오. </li><li> 이 시점에서, 최소화된 콘솔 창이 Windows 작업 표시줄에 나타납니다. 이것은 스펙트럼 데이터베이스에서 로컬 PC ( '당겨'작업)에 이미지의 전송의 진행 상황을 표시합니다. </li><li> 데이터가 전송되면 AQUAnalysis가 시작됩니다. 사용자는 이미지를 볼 탐색 및 분석하는 소프트웨어의 내부의 모든 기능을 사용할 수 있습니다. </li><li> 스펙트럼 데이터베이스에서 이미지의 주석이 지역은 512x512 픽셀의 이미지 타일로 깨진입니다 - 개별적으로 채점한다 각. </li><li> 이 연구에 대한 데이터 클러스터링을 기반으로 혼자 가잖아 아쿠아 점수 알고리즘은, 8 사용되었다. 이 알고리즘에서는 아쿠아 점수는 다음과 같이 생성됩니다 : <ol class="lroman"><li> 팬 - cytokeratin 이미지시gnal은 배경 위에 thresholded 있으며, 이러한 픽셀은 다음 후속 계산에 사용되는 종양 '마스크'를 정의하는 데 사용됩니다. 높은 표현 팬 - cytokeratin 픽셀은 또한 종양 세포의 세포질 / 비 핵 영역을 정의합니다. </li><li> 종양 마스크 내에있는 DAPI 채널에서 높은 신호 픽셀은 자연의 핵으로 식별됩니다. </li><li> 클러스터링 알고리즘은 DAPI의 얼룩이나 cytokeratin 표현과 부분적으로 핵이나 세포질 구획, 또는 배경 중 하나에 그들을 속성하려고 시도하거나 낮은 강도를 가지고 픽셀을 검사합니다. </li><li> 일단 모든 화소가 종양 구획이나 배경 중 하나, 대상 단백질 (ER 또는 HER2)에서 신호의 강도에 할당된 그때 따라서 아쿠아 점수를 생산, 구획의 각과 구획의 크기에 표준 시간 계산됩니다. </li><li> 충분한 종양 표현이 없었 이미지는 (같은 르있는 사람에 의해 정의된 점수되지 않았습니다SS 종양을 나타내는 픽셀의 5 % 이상). 이 지역은 '실패'라는 '최종 결과'가치를 생산하기 때문에 후속 통계 분석에서 제거할 수 있습니다. </li><li> 또한 검토한 경우, 운영자가 샘플이나 이미지 아티팩트 (예 : 접힌 조직, 이물질)에 의해 채점에 적합되지 않은 필드를 확인, 해당 필드는 채점에서 수정된와 '최종 결과', '실패'라는 생산되었다. </li></ol></li><li> 아쿠아 점수의 결과는 전체 조직 섹션 샘플 내에서 관심 영역의 각 512x512 픽셀 타일과 관련된 점수의 테이블입니다. 이러한 파일은. CSV 형식으로 다음 후속 통계 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 5. 통계 분석 : 모든 통계 분석은 SPSS에서 수행하는 (IBM) <ol><li> 가능하다면은, 큰 작업에, 데이터 조작 및 분석 단계를 수행하기 위해 SPSS 구문 코드 파일 (. SPS)를 생성합니다. 예제 구문 코드는 보충 파일로 제공됩니다. </li><li spss :><li> 지역이 '실패'의 '최종 결과'를 (위 참조)가 어디에, 수치 분석에서 그들을 제거 SYSMIS, 이러한 값을 표시합니다. </li><li> 집계 SPSS 형식으로 설정된 하나의 마스터 데이터로 각 마커 (ER 또는 HER2)에 대한 모든 슬라이드에 대한 모든 데이터입니다. 이후의 모든 계산이 마스터 파일을 사용합니다. </li><li> ER 또는 HER2 (부가 구문 파일을 참조) 데이터가 추가로 확인하고 다양성 심슨의 인덱스가 다음과 같이 계산 : SPSS 구문 파일 (각 마커에 대해 하나를 사용하여 <ol class="lroman"><li> 마스터 데이터 이전에 생성한 일련의 수정을 방지하기 위해, 마스터 분석 파일을 생성합니다. </li><li> 생성된 원시 데이터 및 이미지에 대한 설정 마스터 데이터를 확인합니다. </li><li> 각 샘플에 대한 아쿠아 점수 (분야의 개수에 대한 요약 통계를 생성 점수, 평균 점수, minimu을 의미m 점수, 최대 점수, 그리고 샘플에 대한 점수의 표준 편차). </li><li> 원래 원시 데이터를 출력 파일에 대한 점수와 RAW 이미지 데이터에 대한 결과의 무작위 표본을 확인합니다. </li></ol></li><li> 열지도 이미지 (그림 2, 3 참조) 생성하려면 : <ol class="lroman"><li> 여덟 개인 레벨로 '빈'아쿠아 점수 데이터 (SPSS에서 '비주얼 Binning'기능을 사용하여). ER 들어, 핵 점수는 HER2에 대한, 세포질 점수를 사용했고 사용되었습니다. </li><li> 각 방식은 전체 데이터 세트에서 제공 가지 경우 동일한 비율을 나타내는 것과 같은 방식을 도출. </li><li> 모든 후속 출력이 '당 슬라이드 / 샘플'수준에 될 수 있도록 SPSS 기능을 '분할 파일'을 사용합니다. </li><li> 그것이 할당된되었던에 빈에 해당하는 가치는 X, Y 좌표 및 색상 (그림 2 및 3 참조) 각 지역 (512x512 타일에 해당)를 플롯. </li></ol></li><li> 이질 점수를 생성하려면, 코드는 심슨의를 생성하도록 작성되었다아쿠아 점수를 사용하여 다양성 지수. <ol class="lroman"><li> 여기에 사용되는 다양성의 심슨의 인덱스는,로 정의됩니다 : <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="등식 1"> N은 주어진 샘플에 사용되며 n은 표준 점수 (아래 설명된대로 생산)의 주어진 그룹에 점수 / 필드의 번호입니다 점수 / 필드의 총 개수입니다. </li></ol></li><li> 마스터 분석 파일이 데이터 원본에 대한 위에서 설명한 사용합니다. 표시된 예제에서, 모든 ER 계산은 핵 아쿠아 점수와 세포질 아쿠아 점수를 사용하여 계산 HER2를 사용합니다. 각 샘플 / 슬라이드 아래의 계산을 수행합니다. </li><li> 형광 데이터가 분산 불안정에 따라 달라질 수 있기 때문에, 그러한 그 오류 진도는 진도와 전파, 모든 아쿠아 점수에 로그 (기본 2) 정상화를 적용합니다. </li><li> 또한 표준 (로그 변환) 데이터는 Z - (표준) 점수로 변환. <ol class="lroman"><li> Z - 점수 변환은 계산합니다의 다음과 : Z = (아쿠아 점수 - 예제에 대한 모든 점수의 평균) / 샘플에 대한 점수의 표준 편차. 이것은 제로 편차의 중심 가치를 주위에 편차의 분포로 점수의 분포를 변환합니다. </li></ol></li><li> 빈 이러한 Z - 점수 값 여섯 그룹 (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0-1, 1-2&gt; 2)로. </li><li> 각 방식에 대한 각각의 휴지통 및 합계에 할당된 값의 개수를 계산합니다. 색인에 ​​사용되는 여섯 방식 각각에 대한 값을 계산하기 위해, 필드의 총 개수와 함께,이 값을 사용합니다. </li><li> 이러한 값을 합계 다양성의 색인을 생성하기 위해 하나 뺍니다. </li><li> 다양성 지수는 특정 샘플에 대한 평균 점수 주위의 확산의 지표를 제공합니다. 따라서, 높은 지수는 점수의 광범위한 확산, 또는 표현의 이질 증가를 나타냅니다. 반대로, 낮은 인덱스는 표현 측정에 적은 변화와 샘플 균질 표현을 나타냅니다. 이 Figur에 삽화가이다초밖에 2 3. </li></ol> 6. 대표 결과 : 같은 tamoxifen과 trastuzumab과 같은 상대적으로 낮은 독성 대리인,와 타겟 치료는 난소 암 환자에 대한 치료의 표준되지 않습니다. 백금 - taxane 첫 선 화학 요법은 난소암 9-13 다른 화학 요법의 regimens에 우수하고, 환자의 70-80%는 초기 응답 대부분의 재발되며, 자신의 질병 죽는 동안 좋은 증거가있다. 대체 치료에 대한 응답을 예측할 수 생체 측정은 각 환자에 대한 개별적인 치료를 선택에 도움이 될, 그리고 종양에 대한 화학 요법 미치는 선택 압력 때문에, 살아남은 종양 세포는 다른 특성을 가지고 있으며 치료 전에 종양의 subpopulation을 나타내는 수 있으며, 이것을 quantifying 변화는 따라서 유용할 수 있습니다. 우리는 orde에 화학 요법 전후의 난소 암 표본의 응급실과 HER2 표현하기 위해 이질 매핑 방식을 적용R은 표현의 양적 변화를 측정하고 치료 전후 biomarker 표현 사이의 관계를 평가합니다. ER과 HER2 모두 개별 종양 내에 표시된 이질을 설명하고, 일부 종양에서 낮은 이질 상대적으로 높은 이질의 치료 후 심슨의 인덱스 변경, 심슨의 색인 점수를 (그림 2 및 3 참조) 감소로 표시. 이것은 clonal 선택 세포 독성 화학 요법에 대한 응답으로 발생하는 개념을 지원, 더 중요한 것은, 이것은 더 나은 암 환자에 대한 치료를 개인을 위해, 잔류 인구에 대한 타겟 치료를 사용하여 악용될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 변수 형태를 보여주는 같은 난소암의 여러 영역 그림 1. Hematoxylin 및 eosin 얼룩 photomicrographs. (A) x40 현미경은 형태 변화와 종양의 두 인접한 영역을 보여줍니다. 고전력보기 (x20조직의 하단 부분 (C)이 더 균질의 호산 구성 세포질과 젖꼭지 성장 패턴을 가지고 반면 0), 세포질 지우고 종양의 위쪽 부분 (B) 성장의 솔리드 패턴으로 세포를 공개. 이 종양은, 그러나, 더 이상 관리의 목적을 위해 묽은 젖꼭지 histological subtype으로 분류됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. cytokeratin 양성 난소 암 조직에서 ER 단백질 표현의 이질의 heatmaps 전 (위쪽 패널) 및 (하단 패널) 치료 후. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. HER2 단백질 cytokeratin - 양성 난소 암 조직에서 표현, 전 (위쪽 패널)과 후 (아래 패널) 치료의 이질의 heatmaps.

<ol><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%3A+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li>
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</ol>

JC, MG, CJ, 그리고 CS가 HistoRx, Inc의 직원 아르

방법은 여기에 종양 물질의 표준 포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 histologic 섹션에 분자 이질의 허가를 부량을 설명했다. 방법은 이것이 다음 biomarker 개발과 분석 변수로 고려 수 있도록 조직 섹션에 이질의 정도에 할당할 값을 수 있습니다. 일반적으로 그것이 조직의 생체는 분석이 샘플링 오류 또는 바이어스 적은 쉽습니다 있도록 표현과 관련하여 균질되는 것이 바람직하지만, 그것은 어떤 상황에서 매개 변수로 이질을 계량하는 것이 유용 하리라 생각됩니다. 예를 들어, 같은 ER과 HER2에 대한 설명의 예제와 같이, 일반적인 생체은 표현의 상당한 이질을 표시하고이 임상 결과를 또는 치료에 대한 응답에 대하여 독립적인 전조 또는 예측 요소 각각을 대표하는 여부를 현재 알 수있다. 마찬가지로, 그림과 같이, 치료 자체가 동적을 변경 수대상 농축의 구성 세포의 인구, 따라서 측정은 치료 결정을 유도에 유용하게 사용될 수 있습니다. 그러나, 기술은 전통적인 (예 : immunohistochemical 등) histopathological 또는 biomarker 분석을 제한 같은 요인에 의해 제한됩니다. 결과 유형, 크기 및 분석되는 조직의 품질, 따라서 하나의 조직 섹션에 의존하면 전체 종양의 대표되지 않을 수 있습니다. 사실, 심슨의 인덱스는 신체 조직의 크기 (캡처 및 아쿠아 점수가 측정 프레임 번호)에 의해 편향된 수 있습니다. 측정되는 epitopes의 immunogenicity는 artifactually 조직 부분 (예 : 감기 국소 빈혈 시간, 또는 고정 길이, 그리고 가장자리 유물 등)에 걸쳐 자신의 표현을 변경 지나치게 사전 분석 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 이것은 특히 악명 불안 정한 14, 15아르 phospho - epitopes에 대한 문제입니다. 따라서 기술은 더 적합 수도 있습니다절제술의 표본보다는 작은 biopsies하고, 오히려 하나 이상의 여러 섹션에서 수행. 궁극적으로, 3D 영상 기술은 더이 매개 변수를 정할 수있는 기회를 제공할 수 있습니다. 로 제시 기술은 또한 cytokeratin 마스킹 에피토프 표현의 다양성 등 생물 학적 요인에 의해 제한될 수 있습니다. 이것은 난소와 상피 - 투 - mesenchymal 전환 (EMT)을 받아야하거나 비 상피 구성 요소 또는 줄기 세포 16 풍부 아르 유방암을 포함하여, 그 암 특히 우려로 최근에 발생하는 표시되었습니다 수도 화학 요법 - 체외 17과 치료 18에 대한 응답으로 유방암 환자의 난소 암 치료. 이 제한은 이러한 구급대 16 upregulated 있습니다 cytokeratin 플러스 vimentin로 대체 마스킹 항체 (또는 항체의 칵테일)를 사용하여 극복할 수 있습니다. 또한, 조직의 다른 부품 (마이크 이후이러한 섬유아 세포 또는 혈관 내피 세포로 roenvironment)가도 점점 생물 학적 치료의 대상이되고, 기술은 또한 혈관 내피 세포 얼룩 이러한 PECAM / CD31와 같은 관심의 구획에 대한 구체적인 마스크를 사용하여 이러한 구성 요소를 점수로 확대 수 있습니다 . 심슨의 색인의 적응이 간단하기 때문에 현재의 프로토콜 이질의 척도로 사용되고 있지만, 이질의 다른 조치 (분산, 평균 등 평균) 등 중앙 경향의 간단한 측정으로 사용할 수 있습니다. 또한, 심슨의 인덱스 계산은 더 특정 테스트 인구에 맞게 수정할 수 있습니다. Z - 점수 변환의 사용은 이질이 데이터 집합에 대한 평균 주위 편차에 기반이기 때문에 채점 여러 마커에 대한 더 적용할 수 있습니다. 그러나, 점수의 전체 범위는 변환이 유형 제한될 수 있습니다. 일부 디자인은 더 나은 적합있을 수 있습니다단순히 특정 마커 세트의 모든 샘플에 대한 실제 아쿠아 점수를 빈 수 있습니다. 방식과 cutoffs의 수를 선택도 발생할 수 있습니다 값의 범위에서 제한하고 대체 실험 디자인에 최적화된 수 있습니다. 우리는 그들이 이미 병원에서 사용되기 때문에, 후보 생체로 현재의 연구에 응급실 및 HER2를 사용하여 타겟 요법의 효능과 관련하여 관련 임상 문제에 대한 해답을 얻을 수 있도록하고, 상당한 이질 변화를 전시한다고 알려져 있습니다이 기본 및 먼 19 질병. 그러나, 이질 최적의 마커가 결정 남아 있습니다. 다른 가능성은 이전에 계면 생선 연구 20에서 사용되는 것과 clonality의 cytogenetic 마커를 포함할 수 있습니다. 접근 방식은 더 이상 암 생물학이 매개 변수의 관련성을 확립하기 위해 크고 잘 주석 임상 동료 또는 임상 실험에서 추가 유효성 검사를 필요로합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> 사용으로 공급 업체의 시설 </td></tr><tr><td> 스펙트럼 </td><td> Aperio </td><td> 스펙트럼 </td><td> 구성 및 카탈로그 번호는 지역 기관들이 데이터베이스 및 IT 구조를 설정하는 방법에 따라 달라질 수 있습니다. </td></tr><tr><td> AQUAjustment와 함께 AQUAnalysis, </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> AQUAjustment 패키지 AQUAnalysis이 스펙트럼에 저장된 이미지를 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 400 희석 1 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 팬 cytokeratin </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 50 희석 1 </td></tr><tr><td> 항체 희석액 </td><td> Dako </TD&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 - 토끼 HRP를 구상 </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 블록 </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 안티 마우스 Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI 장착 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ - EMR1 - 00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza의 Immunostaining 센터 </td><td> 써모 과학 Shandon </td><td> 73300001 </td><td> 벤치 - 최고 immunofluorescence의 얼룩 여기 사용 </td></tr></tbody></table>

양적 immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

개별 종양 내에 Morphologic 이질은 외과 연습의 histopathologists에 의해 잘 인식됩니다. 이것은 종종 인식 histological subtypes에 뚜렷한 분화 영역의 형태로, 또는 다른 병리 학적 등급을 소요하는 동안 종종 정확한 분류 (그림 1)을 무시 표현형 더 미묘한 차이가있다. 형태가 기본 분자 표현형에 의해 결정되기 때문에 궁극적으로, 눈에 보이는 차이와 지역은 휴대 전화 기능과 동작을 조정 단백질의 표현의 차이, 따라서, 외모 동반 될 가능성이 높습니다. 예후에 대한 가시 성과 보이지 않는 (분자) 이질의 의미는 알 수 있지만, 최근의 증거는 적어도 유전자 수준에서 이질은 기본 종양의 1,2에 존재하며, 이러한 하위 클론의 일부가 전이성을 일으키다,하는 것이 좋습니다 ( 따라서 치명적인) 병. 또한, 일부 단백질은그들은 치료의 목표 (tamoxifen과 trastuzumab (Herceptin)에 대한 인스턴스 ER과 HER2, 각각에 대해) 때문에 생체로 측정. 이 단백질은 종양 내에서 변수 표현을 보여주면 치료 반응도 변수가있을 수 있습니다. immunohistochemistry을 위해 널리 사용되는 histopathologic 점수 제도도 무시, 또는 숫자 단백질 표현의 부량을 homogenize. 마찬가지로, 종양 샘플 (예 : 유전자 발현 프로 파일링 등) 균질 아르 파괴적인 기술에, 양적 정보 elucidated 수 있지만 공간 정보가 손실됩니다. 췌장암의 유전자 이질 매핑 접근 방식은 단일 세포 현탁액 3 세대에 의존하거나, 또는 macrodissection 4에있다. 최근 연구는 형태학 및 분자 매핑이 가능합니다 그 원리의 증거를 제공하고, 전립선 암 조직 5 morphologic와 분자 이질을지도하기 위해 양자 도트를 사용하지만, s를 떨어지고있다이질을 quantifying의 hort. immunohistochemistry이 있기 때문에, 최고만이 세미 양적 및 내부 및 간 관찰자 바이어스, 더 민감하고 정량 방법에 따라 정확하게 현장에서 조직 이질을지도와 수치하기 위해 필요합니다. 우리는 체계적으로 자동 정량 분석 (아쿠아) 시스템을 기반으로 6 종양 전체 조직 섹션에 단백질 표현의 이질을 계량하기 위해 개발하고 실험 및 통계 방법을 적용했습니다. 조직 섹션은 형광단 - 레이블 차 항체에 결합 cytokeratins와 관심 대상에 대한 감독 특정 항체와 표시하고 있습니다. 슬라이드는 슬라이드 전체를 형광 스캐너를 사용하여 몇 군데 있습니다. 이미지는 타일 수천 수백으로 세분화하고, 각 타일은 다음 조직의 상피 (종양) 구성 요소 내의 단백질 농도 측정하기위한 한 방법입니다 아쿠아 점수를 할당됩니다. Heatmaps은 심슨의 생물 다양성 지수 7을 기반으로 원래 생태학에서 사용되는 이질의 통계 측정을 사용하여, 단백질 및 할당 이질 점수의 조직 표현을 나타내기 위해 생성됩니다. 현재까지 histological 준비에 체계적으로 단백질 표정으로 나란히이 다양​​성을지도와 수치 아무런 시도를 한번도 가본 적이있다. 여기서 우리는 ER과 난소암에서 HER2 biomarker의 표현에 적용 방법의 첫 번째 사용을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 예후와 치료에 대한 반응의 예측에 이질의 중요성을 확립하기 위해, translational 연구 biomarker의 표현의 연구에서 독립 변수로 이질을 분석하는 방법을 불법 체류자.

여기 수량 immunofluorescence, 이미지 분석, 이질의 통계 측정을 사용하여 종양이 자료 histological 섹션에 분자 이질을 계량하는 방법을 설명합니다. 방법은 임상 biomarker 개발 및 분석에 사용하기위한 것입니다.

양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

개별 종양 내의 형태학적 이질성은 외과적 실무에서 조직병리학자들에 의해 잘 인식되고 있습니다. 이는 흔히 ...의 형태를 띠지만

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 암 조직 전체 절편에서 바이오마커 발현을 정확하게 정량화하여 단백질 발현의 이질성 정도에 수치적 값을 부여하는 것입니다. 이는 먼저 전체 슬라이드 형광 스캐너를 사용하여 면역 형광 염색된 암 조직 절편을 스캔함으로써 수행됩니다. 그다음, 종양 내에서 평가할 관심 영역(regions of interest)을 선택합니다.그 후, aqua 분석 자동 이미지 분석 시스템을 사용하여 침습적 종양 부위 내의 표적 단백질 발현량을 정량화합니다. 궁극적으로, 이 방법은 조직 절편 전반에 걸쳐 매우 불균질한 경우가 많은 암 조직 내의 바이오마커 발현 지도를 작성하는 데 사용될 수 있습니다. 색상 및 계량 시각화 시약을 이용한 면역조직화학 염색과 같은 전통적인 방법보다 이러한 기술을 사용했을 때의 주요 장점은 면역형광법이 더 정량적이고 더 민감하다는 점입니다.이러한 분석 방법들을 전체 절편 면역형광 스캐닝과 결합하면, 조직 전반에 걸친 바이오마커 발현의 미세한 변화를 정밀하게 매핑할 수 있습니다. Histo RX 실험실의 운영 총괄 책임자인 Mark Gustafson이 이러한 절차를 처음으로 시연합니다. 암 조직 생검 표본을 마이크로톰으로 절편화하고 관심 바이오마커의 발현을 확인하기 위해 면역형광 염색을 수행한 후, 염색된 절편이 담긴 슬라이드를 최대 5장까지 슬라이드 스캐너의 슬라이드 카세트에 적재하십시오.그런 다음 scan scope 콘솔의 인터페이스를 사용합니다. 각 슬라이드에 대해, 염색 패턴이나 샘플의 다른 관찰 가능한 양상에 관계없이 슬라이드 상의 모든 조직을 포함하는 영역을 선택하십시오. 다음으로, scan scope 콘솔을 사용하여 조직의 평가 영역을 선택하는데, 이때 최선의 대표성을 제공할 수 있도록 가급적 조직의 종양 영역 내에서 선택하십시오.이제 스캔 스코프 콘솔의 자동 노출 기능을 사용하여 각 채널의 노출 시간과 이미지 초점을 결정하십시오. 스캔 스코프 콘솔 이미지의 파란색 다이아몬드를 사용하여 조직에서 떨어져 있으면서도 커버 슬립 아래의 슬라이드 영역 내에 있는 추가 영역을 선택하여 평면 보정(flat field correction) 이미지를 획득할 배경 영역을 정의하십시오. 각 필터에 대해 노란색 사각형으로 표시된 조직 영역에 초점 포인트를 추가하여 이미지 캡처를 최적화하십시오. 이미지에 배경 신호가 높거나 다른 이미지 아티팩트가 나타나는 경우, 이미지 영역을 이동하여 새로운 이미지를 획득해야 합니다.그 후 조직을 스캔하며, 획득한 디지털 슬라이드 이미지는 Aperio spectrum 데이터베이스로 자동 업로드됩니다. spectrum 프로그램의 썸네일 이미지를 더블 클릭하여 spectrum 데이터베이스의 디지털 슬라이드 목록에서 분석할 슬라이드를 선택하십시오. 그런 다음 함께 제공된 h 및 D 주석 이미지를 사용하여 형광 이미지 상의 관심 영역(region of interest)에 주석을 추가하십시오.단일 샘플에서 개별 원으로 구분된 여러 관심 영역을 선택할 수 있습니다. 주석이 달린 이미지는 스펙트럼 데이터베이스에 자동으로 저장됩니다. 이제 화면 상단의 메뉴 바에서 Analyze를 선택하고, 분석 창이 나타나면 드롭다운 메뉴에서 histo RX aqua analysis를 선택하십시오.시작할 준비가 되면 분석(analyze) 버튼을 누르십시오. Windows 작업 표시줄에 최소화된 콘솔 창이 나타나 Spectrum 데이터베이스에서 로컬 컴퓨터로 이미지가 전송되는 진행 상황을 표시합니다. 데이터 전송이 완료되면 aqua 분석이 시작되어, 샘플의 1차 임계값(배경 이미지 신호보다 높은 pan cytokeratin 이미지 신호)의 데이터 클러스터링을 기반으로 하는 비지도 aqua 스코어링 알고리즘을 통해 aqua score를 생성합니다. 이를 통해 픽셀을 사용하여 종양 마스크를 정의할 수 있으며, 정의된 마스크는 이후의 계산에 사용될 수 있습니다.고발현 pan cytokeratin 픽셀을 사용하여 종양 세포의 세포질 또는 비핵 영역을 함께 정의하십시오. 여기에서 보는 바와 같이, 종양 마스크 내에 있으며 DPI 채널에서 높은 신호를 보이는 픽셀은 핵 성분으로 식별됩니다. 검토 과정에서 시료 또는 이미징 아티팩트로 인해 점수 산정에 적합하지 않은 영역이 발견되면, 해당 영역은 점수 산정에서 제외되며 최종 결과는 '실패(fail)'로 처리됩니다.aqua scoring 결과는 전체 조직 절편 샘플 내 관심 영역에 있는 각 512 by 512 픽셀 타일과 연관된 점수 표로 나타나며, 이는 저장되어 후속 통계 분석에 사용될 수 있습니다. 이 hematoxylin 및 eosin 염색 광학 현미경 사진은 동일한 난소암의 서로 다른 영역이 어떻게 다양한 형태를 보일 수 있는지를 보여줍니다. Figure B의 우측 상단 고배율 뷰는 종양 상단부에서 세포질 투명화와 고형 성장 패턴을 보이는 세포들을 강조하여 보여줍니다.그러나 그림 C의 오른쪽 하단 섹션에서 확대된 조직의 아랫부분은 더 균질한 호산성 세포질과 유두상 성장 패턴을 보입니다. 여기에서는 화학요법 치료 전과 후의 난소암 조직 절편 내 ER 발현의 이질성 히트맵이 각각 상단과 하단 패널에 표시되어 있습니다. 상단 그림에서는 절편 전체에 걸쳐 고발현 및 저발현 영역이 혼재되어 ER 발현이 가변적이었으나, 하단 그림에서는 빨간색으로 표시된 높은 ER 발현이 균일하게 분포하는 것으로 변화했음에 유의하십시오.이러한 변화의 수치적 표현은 왼쪽의 Simpsons 지수 감소로 나타나 있습니다. 이 그림에서는 난소암 조직 절편 내 HER two의 이질성 히트맵을 치료 전과 후로 나누어 각각 상단과 하단 패널에 다시 보여줍니다. 상단 그림에서는 절편 전체에 걸쳐 고발현 및 저발현 영역이 모두 존재하는 가변적인 HER two 발현 양상을 보이다가, 하단 그림에서는 HER two 고발현이 균일하게 분포하는 상태로 변화한 점에 다시 주목하십시오.심슨 지수(Simpsons index)가 다시 한번 감소하는 것을 확인할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 컴퓨터 분석을 통해 생성된 데이터의 품질은 염색의 품질에 좌우되므로, 염색 작업이 높은 기술적 표준으로 이루어져야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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