양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질 발현의 이질성 정도에 수치를 할당하기 위해 인간 암의 전체 조직 절편에서 바이오마커 발현을 정확하게 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 전체 슬라이드 형광 스캐너를 사용하여 암 조직의 면역 형광 표지 부분을 스캔함으로써 달성됩니다. 종양 내의 다음 관심 영역이 평가를 위해 선택됩니다.

그런 다음 침습성 종양 영역 내에서 관심 단백질의 발현을 아쿠아 분석 자동 이미지 분석 시스템을 사용하여 정량화합니다. 궁극적으로 이 방법은 조직 단면 전반에 걸쳐 매우 이질적인 암 조직에서 바이오마커 발현을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다. 색상 및 미터법 시각화 시약을 사용하는 면역조직화학과 같은 기존 방법에 비해 이러한 기술을 사용하는 주요 이점은 면역형광이 더 정량적이고 더 민감하다는 것입니다.

이러한 분석 방법을 전체 섹션과 결합하는 면역형광 스캔을 통해 조직 전반에 걸친 바이오마커 발현의 미묘한 변화를 미세하게 매핑할 수 있습니다. Histo RX 연구소의 운영 책임자인 Mark Gustafson이 처음으로 이러한 절차를 시연했습니다. 마이크로톰, 암 조직 생검 절편 및 관심 바이오마커 발현을 위한 검체의 면역형광 염색 후, 염색된 절편의 슬라이드를 최대 5개까지 슬라이드 스캐너의 슬라이드 카세트에 로드합니다.

그런 다음 스캔 범위 콘솔의 인터페이스를 사용합니다. 각 슬라이드에 대해 염색 패턴 또는 샘플의 기타 관찰 가능한 측면에 관계없이 슬라이드의 모든 조직을 포함하는 영역을 선택합니다. 다음으로, 스캔 범위 콘솔을 사용하여 먼저 조직의 종양 영역 내에서 이상적으로 평가할 조직 영역을 선택하여 최상의 표현을 제공합니다.

이제 스캔 스코프 콘솔 자동 노출 기능을 사용하여 이미지 초점과 함께 각 채널의 노출 시간을 결정하고, 스캔 스코프 콘솔 이미지의 파란색 다이아몬드를 사용하여 조직에서 멀리 떨어져 있지만 커버 슬립 아래의 슬라이드 영역 내에 있는 추가 영역을 선택하여 플랫 필드 보정 이미지가 획득될 배경 영역을 정의합니다. 각 필터에 대해 노란색 사각형으로 표시되는 조직 영역에 초점을 추가하여 이미지 캡처를 최적화합니다. 이미지에 높은 배경 또는 기타 이미지 아티팩트가 있는 것으로 보이는 경우 이미지 영역을 이동하고 새 이미지를 획득해야 합니다.

그런 다음 조직을 스캔하고 획득한 디지털 슬라이드 이미지를 Aperio 스펙트럼 데이터베이스에 자동으로 업로드합니다. 스펙트럼 프로그램의 썸네일 이미지를 두 번 클릭하여 스펙트럼 데이터베이스의 디지털 슬라이드 목록에서 분석할 슬라이드를 선택합니다. 그런 다음 함께 제공되는 h 및 D 주석이 달린 이미지를 사용하여 형광 이미지의 관심 영역에 주석을 추가합니다.

개별 원으로 묘사된 여러 관심 영역을 단일 샘플에서 선택할 수 있습니다. 주석이 달린 이미지는 스펙트럼 데이터베이스에 자동으로 저장됩니다. 이제 분석 창이 나타나면 화면 상단의 메뉴 표시줄에서 분석을 선택하고 풀다운 메뉴에서 histo RX aqua 분석을 선택합니다.

시작할 준비가 되면 분석 버튼을 누르면 Windows 작업 표시줄에 최소화된 콘솔 창이 나타나 Spectrum 데이터베이스에서 로컬 컴퓨터로의 이미지 전송 진행 상황을 표시합니다. 데이터가 전송되면 아쿠아 분석이 시작되어 샘플 첫 번째 임계값의 데이터 클러스터링을 기반으로 하는 비지도 아쿠아 스코어링 알고리즘을 사용하여 아쿠아 스코어를 생성하며, 이는 배경 이미지 신호 위의 범 사이토케라틴 이미지 신호입니다. 이렇게 하면 픽셀을 사용하여 종양 마스크를 정의할 수 있으며, 이는 후속 계산에 사용할 수 있습니다.

고발현 pan cytokeratin 픽셀을 사용하여 종양 세포의 세포질 또는 비핵 영역도 정의할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 종양 마스크 내에 있는 DPI 채널에서 신호가 높은 픽셀은 본질적으로 핵으로 식별됩니다. 검토 시 샘플 또는 이미징 아티팩트로 인해 채점에 적합하지 않은 필드가 식별되면 해당 필드는 채점에서 삭제되고 최종 실패 결과도 생성됩니다.

아쿠아 스코어링의 결과는 전체 조직 절편 샘플 내의 관심 영역에서 각 512 x 512 픽셀 타일과 관련된 점수 표로 표시되며, 이를 저장하여 후속 통계 분석에 사용할 수 있습니다. 이러한 hemat toin 및 eoin 염색 사진 현미경 사진은 동일한 난소암의 다른 영역이 어떻게 다양한 형태를 나타낼 수 있는지 보여줍니다. 그림 B의 오른쪽 상단에 있는 고출력 보기는 세포질이 투명하고 종양의 상부에서 견고한 성장 패턴이 있는 세포를 강조합니다.

그러나 그림 C의 우측 하단 섹션에서 확대된 조직의 하부는 더 균일한 호산구성 세포질과 유두 성장 패턴을 가지고 있습니다. 여기서, 화학요법 치료 전후의 난소암 조직 절편에서 ER 발현의 이질성 히트맵이 각각 상부 및 하부 패널에 표시됩니다. 상단 그림에서 높은 발현과 낮은 발현 영역이 있는 섹션을 가로지르는 가변 ER 발현에서 아래 그림에서 빨간색으로 표시된 높은 ER 발현의 균일한 분포로 변경된 것을 주목하십시오.

이 변화의 숫자 표현은 왼쪽에 Simpsons 지수의 감소로 표시됩니다. 이 그림에서는 난소암의 조직 절편에 있는 HER의 두 개의 이질성 히트맵이 각각 상부 및 하부 패널에서 볼 수 있듯이 치료 전과 후에 다시 표시됩니다. 다시 주목하라, 위 그림에서 높은 표정과 낮은 표정의 영역이 있는 섹션을 가로지르는 변수 HER 2 표정에서 아래 그림의 높은 HER 2 표정이 균일한 분포로 변화한 것을 주목하라.

다시 한 번, 심슨 가족 지수는 하락하는 것으로 보입니다. 이 절차를 시도하는 동안 컴퓨터 분석에 의해 생성된 데이터의 품질은 염색의 품질만큼 우수하다는 점을 기억하는 것이 중요하며, 이는 높은 기술 표준이어야 합니다.