인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

이 절차는 3차원 세포 배양 시스템을 사용하여 in vivo 세포 동역학을 모방합니다. 콜라겐 ENC 코팅된 비드로 세포를 배양하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 세포와 비드를 회전식 세포 배양 시스템에 로드하고 저전단, 저난류 환경에서 3D 세포 응집체를 증식합니다.

마지막으로, 전형적인 단층에서 성장한 세포의 유전자 발현 및 세포 분화와 비교하여 다운스트림 응용 분야에 사용하기 위해 세포를 수확합니다. 그 결과 생성된 3D 배양은 해당 장면과 매우 유사한 세포 역학 및 거동을 보여줍니다. 생체 내에서.

우리는 RCCS를 사용하여 다양한 인간 상피 조직의 생물학적으로 의미 있는 3D 모델을 엔지니어링했습니다. 제 공동 연구자인 시드니 모리스 박사의 연구실에서 전 대학원생인 제시카 워너 박사는 이제 50밀리리터 원뿔형 튜브 오토클레이브 250밀리그램의 마이크로 캐리어 사이토 덱스 3개의 비드를 12밀리리터로 EVT 세포와 함께 이 절차를 시연할 예정입니다. DPBS를 사용하면 준비된 비드가 부풀어 오르고 실온으로 냉각될 수 있습니다.

그런 다음 멸균 상태에서 총 부피를 12.5밀리리터로 가져옵니다. 이제 DPBS를 사용하여 여분의 융모 영양막 세포의 80% 융합 배양을 수확합니다. 트립신 분해를 사용하여 준비된 사이토 덱스 3개의 비드를 부드럽게 혼합하고 넓은 팁 10ml 혈청학적 피펫을 사용하여 2.5ml를 15ml 원뿔형 튜브에 전달합니다.

사이토 덱스 후 3개의 구슬이 튜브 바닥에 가라앉습니다. cyto Dex 3 개의 구슬을 방해하지 않고 DPBS의 최상층을 피펫으로 제거합니다. EVT 세포를 cyto Dex 3개의 비드와 혼합합니다.

실온에서 주기적인 혼합으로 30분 동안 배양한 다음 세포 배양 인큐베이터에서 가끔 혼합하여 30분 동안 배양합니다. 10mL RCCS를 멸균 6웰 배양 플레이트에 넣고 큰 마개를 제거합니다. 이제 가열된 GTSF 두 개의 배지를 추가하여 세포 비드 혼합물의 총 부피를 10ml로 만들고 대형 포트를 통해 RCCS로 로드합니다.

큰 포트 스토퍼를 교체하고 작은 포트를 닫습니다. 다음 위치, 두 개의 작은 포트에 3 밀리리터 주사기를 비우십시오. 각 주사기에 미디어를 추가합니다.

두 개의 밸브를 천천히 열고 실린지 피스톤을 교체합니다. 내부 챔버에서 모든 기포가 배출될 때까지 하나의 주사기에서 매체를 부드럽게 추가합니다. RCCS를 들고 옆면을 가볍게 두드리면서 회전시켜 기포가 있는지 확인합니다.

기포가 작은 포트 아래에 있을 때까지 RCCS를 회전하여 남아 있는 기포를 제거합니다. 그런 다음 반대쪽에 있는 주사기를 부드럽게 눌러 거품을 포트로 밀어 넣고 챔버 밖으로 빼냅니다. 한쪽 포트를 계속 닫고 다른 주사기 피스톤을 부드럽게 눌러 용기에 소량의 양압을 주입하고 압력을 가하면서 두 번째 밸브를 닫습니다.

마지막으로 RCCS를 로터에 로드합니다. 최적의 배양 조건을 위해 세포 배양 인큐베이터에서 19 RPM으로 회전을 시작합니다. 처음 3일 동안은 격일로 미디어를 보충하고 그 이후에는 매일 미디어를 보충합니다.

먼저 로터를 끄고 RCCS를 제거합니다. 피스톤을 위로 당겨 흡입력을 만듭니다. 각 작은 포트에서 주사기를 제거하고 RCCS를 비스듬히 놓고 비드가 큰 포트의 반대쪽에 놓이도록 합니다.

이제 작은 밸브 중 하나를 열어 비드를 방해하지 않고 RCCS에서 매체의 2/3를 폐기물 용기로 방출합니다. 작은 밸브를 닫은 다음 큰 포트를 엽니다. RCCS에 미디어를 추가하고 스토퍼를 교체하고, 앞서 표시된 대로 모든 기포를 배출하고, 배양기를 인큐베이터의 회전기에 배치합니다.

응집체가 성장하기 시작하면 회전 속도를 눈에 띄게 증가시켜 세포가 현탁 상태를 유지하도록 합니다. 세포를 수확하기 위해. 로터에서 RCCS를 분리합니다.

각 작은 포트에서 주사기를 버리고 RCCS를 비스듬히 배치하여 비드가 큰 포트 반대편으로 향하도록 합니다. 비드가 모두 가라앉은 후 작은 밸브 중 하나를 열고 매체의 1/3을 폐기물 용기로 배출합니다. 작은 밸브를 닫고 큰 포트를 엽니다.

용기를 부드럽게 소용돌이쳐 응집체를 용액으로 다시 분산시키고 세포를 멸균 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 수집된 응집체가 원뿔형 튜브에 침전되도록 한 후 상등액을 사용하여 배양 용기를 다시 철저히 세척하여 응집체의 회수를 극대화합니다. 넓은 구멍의 피펫 팁을 사용하여 다운스트림 기능 분석을 위해 응집체를 즉시 분취합니다.

S-G-H-P-L 4개의 영양막아세포 세포주는 세포와 같은 여분의 융모 영양막아세포의 한 예입니다. cyto X three의 RCCS에서 성장한 일반적인 응집체에서는 많은 beads가 증식 세포로 완전히 덮여 있습니다. 투영은 주 클러스터에서 멀어지도록 확장되고 인접 클러스터에 연결됩니다.

RCCS에서 제거되어 세포외 기질에 도금되면 3D 성장 세포와 같은 EVT가 공격적으로 침입하거나 이동합니다. 실제로, R-T-P-C-R 데이터는 기존의 세포 배양 단층과 달리 3D 응집체에서 볼 수 있는 MMP의 발현이 증가했음을 확인합니다. 흥미롭게도, 침입과 관련이 없는 유전자 역시 RCCS에서 상향 조절된다.

이 동영상을 시청한 후에는 세포주 일차 세포 또는 줄기 세포와 함께 RCCS를 사용하여 in vivo 세포 동역학을 보다 밀접하게 모방하는 3차원 세포 배양을 얻는 방법을 명확하게 이해하게 될 것입니다.