Name: 인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 배우세요 회전 세포 배양 시스템(RCCS)을 이용한 3D 인간 세포 배양 기법으로, 저전단력 환경에서 extravillous trophoblast 세포의 분화 및 유전자 발현을 분석하는 방법입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 보건 부여 NIH / NICHD # HD051998 (CAM)을 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 콜라겐 비드 준비 <ol><li> 이전 3 차원 세포 배양에 대해로드 EVTs에, 하나는 Cytodex - 3 microcarrier 비즈를 준비해야합니다 : <ol><li> 실험에 필요한 Cytodex - 3 구슬의 해당 금액을 달다. 이 프로토콜은 구슬 0.05g이 필요하는, 10ml RCCS 선박에 대한 적응이다. 50ml RCCS 선박 들어, 그에 따라 규모. 50mL autoclavable 원뿔 튜브에 12mL Dulbecco 인산 250 MG Cytodex - 3 구슬을 혼합하면 용액 (DPBS)를 버퍼. 이 금액은 5 RCCS 선박에 대한 충분합니다. </li></ol></li><li> 압력솥 프로세스가 증발하게됩니다대로 적절한 볼륨의 원뿔 튜브에 존재 확인하십시오. 대충 110 10 분 튜브와 압력솥을 캡 ° C. </li><li> 압력솥주기의 완성에있는 원뿔 튜브를 제거하고 Cytodex - 3 비드 솔루션 괜찮아 수 있습니다. </li><li> 원뿔 튜브 룸 온도 냉각 후 1X DP를 사용하여 12.5mL로 전체 볼륨을 가져다 멸균 기술을 사용하여BS. </li><li> 모자와 실온에서 준비 Cytodex - 3 구슬을 저장합니다. 준비 비즈를 사용하기 전에 실내 온도 팽창하고 냉각 허용합니다. Cytodex - 3 구슬 위의 준비 다섯 10mL RCCS 혈관을위한 것입니다. 우리는 콜라겐이 약 한달 후 불안정하므로 상온에서 Cytodex - 3 구슬의 확장 스토리지, 성능 저하가 발생합니다 것이 관찰했습니다. 133-215 μm의 크기에서 Cytodex - 3 구슬이 다​​양합니다. </li></ol> 2. 미디어 준비 <ol><li> 플러스 보조제 및 60% L - 15 Leibovitz의 미디어 (22에서 적응), 40 % 가상 알파 구성되어 GTSF - 2 미디어 (22에서 적응), 최적화된 RCCS의 1L를 준비합니다. 첫째, 함께 보충 가상 알파의 전체 볼륨에서 400mL 준비 : 21.2mM 나트륨 탄산수 소 0.06 %의 펩톤 0.7mM Fructose와 1.4mM 갈락토 오스 5.6mM 포도당 1 % HEPES 1퍼센트 L - 글루타민 0.5 % ITS 10 % FBS </li><li> ITS의 재고 솔루션을 준비하려면, 빙초산 (약 0.05mL)를 추가로 준비 5mL 멸균 산성 H 2 O에 용해. 디졸브로 소용돌이, 45mL 멸균 물을 따르십시오. </li><li> 조직 문화 학년 H 2 O.의 용해에 의한 매체의 600ml 정도로 L - 15 Leibovitz의 분말 달아서 나누다 </li><li> L - 15 Leibovitz의 매체 1L로 세포 배양 매체의 전체 볼륨을 가져와. 필터 소독과 4 ° C 저장을 어둠 속이라서. 사용하는 매체의 각 나누어지는 개별적으로 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> GTSF - 2 미디어 이외의 대부분의 미디어 공법이 성공적으로 RCCS에서 테스트되었습니다. 개인 실험실 실험이 수행되고 최적의 어떤 매체에 스스로 결정해야합니다. </li></ol> 3. 세포 비드 인큐베이션 <ol><li> ~ 80 % confluency에 EVTs을 전파, trypsinize 및 접수 세포 배양 방법을 사용하여 계산합니다. </li><li> 따뜻한의 4mL에 1x10 6 EVTs을 중지에드 미디어. </li><li> 부드럽게 준비 Cytodex - 3 구슬을 섞는다. 무균 기술을 사용하여 다양한 팁, 10mL 피펫 serological 및 미사용 15mL 원뿔 튜브로 전송을 사용하여 준비 구슬 2.5mL를 제거합니다. 그들은 피펫에 연결과 같은 구슬의 작은 손실이있을 수 있습니다. </li><li> Cytodex - 3 구슬은 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 침전 후 Cytodex - 3 구슬을 방해하지 않고 DPBS의 최상위 층을 제거하는 pipettor을 사용합니다. </li><li> 준비 Cytodex - 3 구슬과 미디어 1x10 6 준비 EVTs를 섞습니다. </li><li> 30 분 상온에서 휴대 비드 혼합를 품어. 주기적으로 부드럽게 섞는다. 37 ° C와 5% CO 2에서 추가로 30 분 알을 품다. 주기적으로 부드럽게 섞는다. </li></ol> 4. RWV를로드 <ol><li> 층류 흐름 캐비닛에서 포장에서 10mL의 RCCS를 제거하고 안정성을위한 살균, 6 - 물론 문화 판에 넣습니다. RC의 표시 그림 1 그림을 참조하십시오CS. </li><li> 포트에서 큰 마개를 제거합니다. </li><li> 예열 미디어와 10mL에 잠복기 휴대 비드 혼합의 전체 볼륨을 가져와. </li><li> 큰 포트를 통해 RCCS에 셀 / 비드 - 혼합을로드합니다. RCCS가에 기울어져 있어야 45 ° 각도 (대형 포트 이상) 잠재적인 기포의 제거에 도움에 로드할 때. 천천히 그리고 꾸준히 혈관을 작성하여 긍정적인 압력 업 빌드를 방지합니다. </li><li> 큰 포트에 마개를 교체합니다. </li><li> 3 - ML 주사기의 피스톤을 제거하고 작은 포트에 빈 주사기를 놓습니다. 각각의 주사기에 미디어의 1 3mL 추가합니다. 천천히 두 밸브를 엽니다. 부드럽게 주사기에 주사기 피스톤을 교체하십시오. 모든 거품이 내부 챔버에서 제거되기 전까지는 한 주사기에서 미디어를 추가합니다. </li><li> RCCS를 들고 거품 확인하기 위해 앞에서 그것을 회전하면서 부드럽게 측면을 누릅니다. 모든 거품이있다면 공기 방울이 형성 O 방해하므로, 당신은 챔버의 그들을 받아야합니다F 셀 집계가와 전단 세력을 소개합니다. 거품이 작은 포트에 따라 때까지 RCCS를 회전하여 거품을 제거합니다. 그런 다음 부드럽게 챔버의 항구 밖으로 거품을 강제로 반대편에있는 주사기 아래로 밀어. </li><li> 한쪽 포트를 닫습니다. 부드럽게 형성에서 거품을 방지 용기로 긍정적인 압력의 작은 금액을 소개하는 다른 주사기 피스톤을 아래로 밀어. 둘째 밸브를 닫습니다. </li><li> 회전자에 RCCS을로드합니다. 37 ° C CO 2 배양기에서 19rpm에서 회전을 시작합니다. </li></ol> 5. 미디어 변경 <ol><li> 매일 이후 다음 첫 사흘 동안 매일 미디어를 변경합니다. </li><li> 날개를 끄고 RCCS를 제거합니다. 일부 흡입을 만드는 각각의 작은 항구에서 주사기를 제거하고 구슬이 큰 포트의 반대를 해결 있도록 각도에 RCCS을 배치 피스톤을 당겨. </li><li> 비즈 모두 해결되면 작은 밸브 중 하나를 열고미디어가 RCCS 및 폐기물 용기 밖으로 흘러 수 있습니다. 이러한 방식으로 미디어의 2 / 3를 제거합니다. 구슬을 방해하지 않도록하고 집계를 폐기하지 않는해야합니다. </li><li> 작은 밸브를 닫고 큰 포트를 엽니다. 다시 큰 포트를 통해 RCCS에 미디어를 추가합니다. 큰 포트에 마개를 교체합니다. </li><li> 4.9 - 4.6 단계를 반복합니다. </li><li> 집계 크기가 증가로서 최적의 속도에서 작은 순환 패턴에서 이상적으로, 항상 정지에서 그들을 유지하기 위해 회전 속도를 증가해야합니다. 집계가 가시 성장 시작되면 일반적으로, 각 수유 후 0.3-0.7 RPM 사이의 속도를 향상시킬 수 있습니다. </li></ol> 6. 수집 세포를 전파 <ol><li> 회전자에서 RCCS를 제거합니다. 각각의 작은 포트에서 주사기를 제거하고 구슬이 큰 포트의 반대를 해결 수 있도록 각도에 RCCS 놓으십시오. </li><li> 비즈 모두 해결되면 작은 밸브 중 하나를 열고 미디어가 흐름 수RCCS 및 폐기물 컨테이너에. 이러한 방식으로 미디어의 1 / 3을 제거합니다. </li><li> 작은 밸브를 닫고 큰 포트를 엽니다. 부드럽게 소용돌이 선박 다시 솔루션에 집계를 해산합니다. 멸균 50ml 원뿔 튜브에 비어있는 액체 혼합물. 수집된 집계 철저하게 집계의 회복을 최대화하기 위해 문화 용기를 씻어 표면에 뜨는 사용하기 전에 원뿔 튜브에 정착하도록 허용합니다. 집계는 같은 유동세포계측법, 침공 assays, immunofluorescence 및 기타로 바로 하류 assays에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 Cytodex - 3 구슬에 RCCS 재배 EVT 같은 세포 (SGHPL - 4 trophoblast 세포 라인)의 예제는 그림 2에 표시됩니다. EVT 같은 세포 라인은 떨어져 주요 클러스터에서 확장하고 인접 클러스터에 연결 계획을 표시합니다. 구슬의 대부분이 완전히 전파 세포로 덮여있다. 일단 RCCS 및 괞찮아에서 제거테드는 세포외 기질에 EVT 같은 3 - D 성장 세포가 적극적으로 및 / 또는 마이 그 레이션을 (그림 3) 침공. RT - PCR 데이터는 기존의 세포 배양 monolayers (그림 4) 반대로 3 - D 집계에서 본 MMPs의 증가 표현을 확인합니다. 흥미롭게도, 침략과 연관되지 않은 유전자도 RCCS에 upregulated입니다 (표 1)과 trophoblasts 세포를 침입과 면역 상호 작용 등의 영역을 delineating에 도움이됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 회전 세포 배양 시스템 (RCCS)의 만화 묘사. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. RCCS 5 일 성장 후 대표 골재의 위상 콘트라스트 현미경. 화살표가 침입 세포를 표시하고 *은 Cytodex - 3 microcarrier 비즈를 나타냅니다. <img files> 그림 3. RCCS 들어라 집계는 섬유소의 젤에 포함되었습니다. 섬유소 젤을 통해 침공은 (A) 24시간 후 섬유소를 포함 빠르면 준수하고 (B) 48 시간 동안 계속되었다. 화살표가 침입 세포를 표시하고 *은 Cytodex - 3 microcarrier 비즈를 (심판에서 허가, 적응. 7) 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. monolayer와 RCCS의 비교 젤라틴 zymogram는 SGHPL - 4 EVT 같은 세포를 증식. MMP - 2와 MMP - 9의 프로 - 적극적인 형태는 RCCS 성장 trophoblast 세포 (참조. 7, 허가, 적응)에 의해 분비되었다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 1. RCCS 재배 SGHPL - 4 세포 (참조. 7, 허가, 적응)에서 microarray 결과의 요약. <ol class="lalpha"><li d monlayer :><li> monolayers의 감지 한계 이하되었습니다 유전자를 나타냅니다. </li></ol>

<ol><li>Knofler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).</li>
<li>Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+at+the+maternal-fetal+interface%3A+relevance+to+human+pregnancy+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders.</a> Reproduction. 140, 803-803 (2010).</li>
<li>Harris, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFPA+Gabor+Than+Award+lecture%3A+Transformation+of+the+spiral+arteries+in+human+pregnancy%3A+key+events+in+the+remodelling+timeline%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline.</a> Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).</li>
<li>Whitley, G. S., Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast-mediated+spiral+artery+remodelling%3A+a+role+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis.</a> J. Anat. 215, 21-21 (2009).</li>
<li>Apps, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32, 33-33 (2011).</li>
<li>Bilban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+invasion%3A+assessment+of+cellular+models+using+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures.</a> Placenta. 31, 989-989 (2010).</li>
<li>LaMarca, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+growth+of+extravillous+cytotrophoblasts+promotes+differentiation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion.</a> Placenta. 26, 709-709 (2005).</li>
<li>Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-8+%28CXCL8%29+stimulates+trophoblast+cell+migration+and+invasion+by+increasing+levels+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%292+and+MMP9+and+integrins+alpha5+and+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1.</a> Reproduction. 139, 789-789 (2010).</li>
<li>Husslein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+regulation+and+functional+characterization+of+matrix+metalloproteinase-3+of+human+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast.</a> Placenta. 30, 284-284 (2009).</li>
<li>Barrila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+3D+cell+culture+models%3A+using+the+rotating+wall+vessel+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).</li>
<li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+culture%3A+the+rotating-wall+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).</li>
<li>Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+tissues+in+microgravity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Growing tissues in microgravity.</a> Nat. Med. 4, 901-901 (1998).</li>
<li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).</li>
<li>Bentrup, H. önerzu, K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+models+of+human+colonic+epithelium+to+study+the+early+stages+of+enteric+salmonellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis.</a> Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).</li>
<li>Carterson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates%3A+alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).</li>
<li>Myers, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+phenotypic+gap+between+transformed+neuronal+cell+lines+in+culture+and+untransformed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).</li>
<li>Hjelm, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+three-dimensional+organotypic+human+vaginal+epithelial+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model.</a> Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).</li>
<li>Straub, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+infectivity+assay+for+human+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).</li>
<li>Nickerson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+assemblies%3A+novel+models+for+the+study+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis.</a> Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).</li>
<li>Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+for+the+study+of+attach+and+efface+lesion+formation+by+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli.</a> Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).</li>
<li>Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Huh7+cell+culture+system+for+the+study+of+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection.</a> Virol. J. 6, 103-103 (2009).</li>
<li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTSF-2%3A+a+new%2C+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li>
<li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTSF-2%3A+a+new%2C+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li>
<li>GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbooks%22">Handbooks</a>. , Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks">http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks</a> (2005).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

여기에 제시 문화 기술은 고도로 침입 EVT 같은 세포와 수사관을 제공합니다. 그것은 지금은 차별화의 손실 세 차원 (꼭대기의, 기저, 그리고 측면 세포 표면) 10,13의 화학 및 분자 단서에 세포 반응의 억제에 의한 monolayers에서 발생되는 인정되었습니다. 이 기술은 EVT 세포를 침해에 대한 utero에 명시된 바와 같이 특징을 반영합니다. 절차는 기존의 monolayer 조직 문화 시간 속도론을 모방한 것이었지만, 차등 표정으로 세포를 제공으로 비교 assays는 고용 수 있습니다. 셀 클러스터는 언제든지 실험에 사용하기 위해 수확 수 있습니다. 클러스터 또는 콜라겐 저하가 단일 세포 현탁액으로 세포를 분리하기 위해 고용 수 있으므로 그들은 사용할 수 있습니다. Cytodex - 3 microcarrier 비즈는 개인 실험실 &#39;특정 이익에 더 도움이되는 수도 있습니다 다른 세포외 매트릭스 (ECMS)로 코팅 공사장 공중 발판을하거나 microcarrier 비즈로 대체 수...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Cytodex microcarrier 비즈 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> 회전 세포 배양 시스템 (RCCS) </td><td> Synthecon </td><td> RCCS - D </td><td> 회전자베이스, 전원 공급 장치, 4 일회용 RCCS 단위를 포함 </td></tr><tr><td> RCCS 일회용 단위 </td><td> Synthecon </td><td> 연락처 Synthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3ml Luer - 잠금 팁 주사기 </td><td> BD </td><td> 309,585 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml 넓은 팁 serological 피펫 </td><td> BD </td><td> 357,504 </td><td></td></tr><tr><td> 가상 알파 </td><td> Invitrogen </td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz의 L - 15 배지, 분말 </td><td> Invitrogen </td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O, 내독소 무료 </td><td> 어부 </td><td> MT - 25-055 - CM </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S - 7795 </td><td></td></tr><tr><td> 펩톤 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP1420 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> Fructose와 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> F3510 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 갈락토 오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G5388 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G7528 - 250 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> 인슐린 - 트랜스페린 - 나트륨 Selenite (ITS) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10,437 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,140 </td><td></td></tr></tbody></table>

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 trophoblast 셀

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

인간 trophoblast 연구 분야는 placentation 동안 설립 복잡한 환경을 이해 에이즈. 이러한 연구의 성격으로 인해, 생체내 실험에서 인간이 불가능합니다. 차 문화, explant 문화와 trophoblast 세포 라인 1 조합은 질 벽에 2의 침략과 임신의 성공 구축에 필요한 extravillous trophoblast 세포 (EVTs)에 의해 자궁 나선형 동맥 3,4의 리모델링에 대한 우리의 이해를 지원합니다. 이러한 모델에서 gleaned 지식의 풍부한에도 불구하고, 그것은 자신의 생체내의 대응에 5,6에 비해 EVT 같은 세포 라인을 사용하여 시험 관내 세포 배양 모델에서 세포 속성을 변경 표시 허용됩니다. 회전 세포 배양 시스템 (RCCS)에서 교양 세포가보다 밀접하게 U에서 차별 모방되는 EVT 같은 세포 라인의 형태학의 phenotypic 및 기능 속성을 표시침략 (예 : 매트릭스 metalloproteinases (MMPs))와 trophoblast 차별 7, 8, 9을 중재 유전자의 증가 표현과 tero의 EVTs. 셍 조르즈 병원 Placental 세포 라인 4 (SGHPL - 4) (친절하게 박사 가이 휘틀리 박사 주디스 카트 라이트에 의해 기증) RCCS의 테스트에 사용되었다 EVT 같은 세포 라인입니다. RCCS 문화 선박의 디자인은 장기와 조직은 3 차원 (3 - D) 환경에서 작동하는 원리에 따라 달라집니다. 3 차원에 재배 생리학 관련 전단 조건을 포함한 선박의 동적 문화 조건, 세포에 의한 자연 세포 동질성을 기반으로 집계를 형성하고 organotypic 조직과 같은 어셈블리 10,11,12으로 구분. 유체 궤도의 유지 보수 생체내에서 발견 조건과 비슷한 낮은 전단, 낮은 난기류 환경을 제공합니다. 배양해 세포의 침전이 회전을 조정하여 반박입니다세포의 지속적인 자유 낙하를 보장하기 위해 RCCS 속도. 가스 교환은 생물 반응기의 뒷면에있는 투과 소수성 막을 통해 발생합니다. 생체내 자신의 부모의 조직과 마찬가지로, RCCS - 성장 세포들은 다공성 microcarrier 비즈의 표면에 양식 때문에 삼차원 (그들, 혀끝의 기초, 그리고 측면 표면에서 IE)에서 화학 및 분자 그라디언트에 응답할 수 있습니다. 플라스틱처럼 스며들지 않는 표면에 2 차원 monolayers으로 성장하면 세포들은 기저 표면에서이 중요한 커뮤니케이 션의 박탈됩니다. 따라서, 환경에 의해 부과된 공간적 제약이 심히 따라서 3 차원 환경 13 중요한 역할을 암시, 주변 microenvironment에서 세포의 감각과 디코딩 신호 방법에 영향을 미칩니다. 우리는 다양한 인간의 상피 조직 7,14,15,16의 생물 학적 의미 3 - D 모델을 엔지니어링하는 RCCS를 사용했습니다. 사실, 많은 이전 리포트는 민주 공화국을 가지고RCCS의 교양 세포가 다른 모델 10,17-21 가능하지 않은 생리학 관련 phenotypes을지지 수 onstrated. 요약에서 RCCS의 문화는 실험 조작의 다양한 의무 아르 차별화된 세포의 큰 번호를 제공하는 쉽고 재현성, 높은 처리량 플랫폼을 나타냅니다. 다음과 같은 프로토콜, 예를 들어 EVTs를 사용하여, 우리는 명확하게 RCCS 세 - 치수 문화 자기편 세포에 필요한 단계를 설명합니다.

전통적인 2 차원 세포 배양 기술은 종종 차별화 마커, 크린 시토킨 및 성장 요인과 관련하여 변경된 특성의 결과. extravillous trophoblast 세포 라인과 함께 그림과 같이 회전 세포 배양 시스템의 세 가지 차원 세포 배양 (RCCS)는 이러한 요소 중 많은 표현 reestablishes.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

인간 영양막 세포 연구 분야는 태반 형성 과정에서 구축되는 복잡한 환경을 이해하는 데 도움을 줍니다. 이러한 ...의 특성으로 인해

이 절차는 생체 내 세포 역학을 모방하기 위해 3차원 세포 배양 시스템을 사용합니다. 먼저 collagen ENC가 코팅된 비드와 함께 세포를 배양합니다. 그다음 세포와 비드를 회전식 세포 배양 시스템에 넣고, 전단력과 난류가 낮은 환경에서 3D 세포 응집체를 증식시킵니다.마지막으로, 일반적인 단층 배양으로 성장시킨 세포의 유전자 발현 및 세포 분화와 비교하기 위해 하위 응용 단계에서 사용할 세포를 수확합니다. 결과물인 3D 배양물은 in vivo 상황과 매우 유사한 세포 역학 및 거동을 보여줍니다.우리는 RCCS를 사용하여 다양한 인간 상피 조직의 생물학적으로 유의미한 3D 모델을 제작해 왔습니다. 제 협력자인 Dr.Sydney Morris 연구실의 전 대학원생인 Dr.Jessica Warner가 이제 EVT 세포를 이용한 이 절차를 시연하겠습니다. 50 milliliter 원추형 튜브에 12 milliliters의 DPBS와 함께 250 milligrams의 micro carriers cyto dex three beads를 넣고 오토클레이브하십시오. 준비된 비즈가 팽창하여 실온까지 식도록 둡니다.그다음 멸균 조건 하에서 총 부피를 12.5 milliliters로 맞춥니다. 이제 DPBS를 사용하여 80% 밀도로 배양된 extra villus trophoblast 세포를 회수합니다. 트립신 소화를 이용하여 준비된 cyto dex three 비드를 부드럽게 혼합하고, 입구가 넓은 10 milliliter serological pipette을 사용하여 2.5 milliliters를 15 milliliter conical tube로 옮깁니다.Cyto Dex 3 비드가 튜브 바닥에 가라앉은 후, Cyto Dex 3 비드가 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액의 DPBS를 피펫으로 제거합니다. EVT 세포를 Cyto Dex 3 비드와 혼합합니다.주기적으로 혼합하면서 실온에서 30분 동안 배양한 후, 간헐적으로 혼합하며 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 더 배양합니다. 10 mL RCCS를 멸균된 6-웰 배양 플레이트에 넣고 큰 마개를 제거합니다. 이제 따뜻하게 데워진 GTSF two 배지를 추가하여 세포 비드 혼합물의 총 부피를 10 mL로 맞춘 후, 큰 포트를 통해 RCCS에 로딩합니다.대형 포트 스토퍼를 교체하고 소형 포트들을 닫습니다. 다음 단계로, 3 mL 주사기 세 개를 두 개의 소형 포트에 연결하여 비웁니다. 각 주사기에 배지를 추가합니다.두 밸브를 천천히 열고 시린지 피스톤을 다시 끼웁니다. 내부 챔버에서 모든 기포가 제거될 때까지 한쪽 시린지에서 배지를 조심스럽게 주입합니다. RCCS를 들어 올려 회전시키면서 측면을 가볍게 두드려 기포가 있는지 확인합니다.RCCS를 회전시켜 기포가 작은 포트 아래로 올 때까지 움직여 남은 기포를 제거합니다. 그 다음 반대편의 시린지를 부드럽게 눌러 기포를 포트 밖으로 밀어내어 챔버에서 배출시킵니다. 이어서 한쪽 포트를 닫고 다른 쪽 시린지 피스톤을 부드럽게 눌러 용기 내부에 약간의 양압을 가한 상태에서 두 번째 밸브를 닫습니다.마지막으로 RCCS를 로터에 장착합니다. 최적의 배양 조건을 위해 세포 배양 인큐베이터에서 19 RPM으로 회전을 시작합니다. 처음 3일 동안은 이틀에 한 번씩, 그 이후부터는 매일 배지를 보충합니다.먼저 로터를 끄고 RCCS를 제거합니다. 피스톤을 위로 당겨 흡입력을 생성합니다. 각 작은 포트에서 주사기를 제거한 다음, RCCS를 기울여 비드가 큰 포트의 반대편에 가라앉도록 합니다.이제 작은 밸브 중 하나를 열어 비드에 영향을 주지 않도록 RCCS 내 배지의 3분의 2를 폐기물 용기에 배출하십시오. 작은 밸브를 닫은 후, 큰 포트를 엽니다. RCCS에 배지를 추가하고 스토퍼를 닫은 다음, 앞서 설명한 대로 모든 기포를 제거하고 배양 용기를 인큐베이터 내의 회전 장치 위에 배치하십시오.응집체가 성장하기 시작하면, 세포가 부유 상태를 유지할 수 있도록 회전 속도를 가시적으로 높여주십시오. 세포를 수확하려면 로터에서 RCCS를 분리하십시오.각 소형 포트에서 시린지를 제거하고, 비드가 대형 포트 반대 방향으로 향하도록 RCCS를 기울입니다. 비드가 모두 가라앉은 후, 소형 밸브 중 하나를 열어 배지의 1/3을 폐기물 용기에 배출합니다. 소형 밸브를 닫고 대형 포트를 엽니다.용기를 가볍게 흔들어 응집체를 다시 용액 속으로 분산시킨 후, 세포를 멸균된 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 원추형 튜브 내에서 수집된 응집체가 가라앉을 때까지 기다린 후, 상층액을 사용하여 배양 용기를 다시 충분히 세척함으로써 응집체 회수율을 최대화합니다. 광구 파이펫 팁(wide bore pipette tip)을 사용하여 응집체를 즉시 분주하여 후속 기능 분석에 사용합니다.S-G-H-P-L 4 영양막 세포주는 외융모 영양막 세포 유사 세포의 한 예입니다. Cyto X Three가 포함된 RCCS에서 배양된 전형적인 응집체에서는 많은 비드가 증식하는 세포들로 완전히 덮여 있습니다. 주 응집체로부터 뻗어 나와 인접한 응집체에 부착되는 돌기들에 유의하십시오.RCCS에서 제거되어 세포외 기질 위에 도말되면, 3D로 성장한 EVT 유사 세포들은 공격적으로 침습 및 이동합니다. 실제로, R-T-P-C-R 데이터는 기존의 세포 배양 단층과 비교하여 3D 응집체에서 MMP의 발현이 증가했음을 확인시켜 줍니다. 흥미롭게도 침습과 관련이 없는 유전자들 또한 RCCS에서 상향 조절됩니다.이 영상을 시청하신 후에는 RCCS를 사용하여 세포주, 일차 세포 또는 줄기세포로 생체 내 세포 역학을 더욱 밀접하게 모방하는 3차원 세포 배양을 구현하는 방법을 명확히 이해하시게 될 것입니다.

rotating-cell-culture-systems-for-human-cell-culture-human

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 고립과 blastocysts에서 trophoblast의 줄기 세포의 유도를 보여줍니다. 우리는 또한 줄기 세포 속성의 유지 보수뿐만 아니라 문화에 분화의 유도에 대한 조건을 설명합니다.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

이 프로토콜에서는, 우리는 Percoll 기울기를 사용하여 trophoblast 세포의 분리에 이어 임신 d10.5에 마우스에서 placentae의 절개를 설명합니다. 우리는 matrigel의 침공 분석에서 분리 된 세포의 사용을 보여줍니다.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

이 원고는 저산소증/재산소화 하에서 배양된 면역정제된 인간 융모 세포영양아세포 세포의 독특한 체외 모델을 제시합니다. 이 모델은 멜라토닌과 같은 유망한 치료법이 산화 스트레스 증가 및 태반 기능 변화와 관련된 임신 합병증에 대한 보호 효과를 연구하는 데 적합합니다.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.

태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

오가노이드는 장기 개발, 약물 발견 및 질병 연구를 위한 맞춤형 조직 모델링에 혁명을 일으켰습니다. 오가노이드 엔지니어링은 복잡한 합성 조직을 만드는 것으로 발전합니다. 목표는 형태 형성, 조립체 기술 및 생체 매트릭스를 통합하여 조직 공학을 발전시키는 것입니다. 이 프로토콜은 간 기관 형성을 모델링하고 합성 조직 구축에 대한 지침을 수립하는 데 도움이 됩니다.

인간 세포주를 사용하여 간 기관 형성 모델링, 조립체 구축 및 합성 조직 설계를 위한 체외 배양 기술

이 프로토콜은 3차원(3D) 프린팅 골격으로 두 종류의 부착 세포주의 생물학을 재현할 수 있는 새로운 체외 실험 모델을 보여줍니다. 이 모델의 구성과 세포 준비 및 세포 배양에서 분석 및 평가에 이르는 운영 절차에 대해 설명합니다.

두 가지 유형의 부착 세포주를 사용한 공동 배양 모델

이 프로토콜은 인간 기저 배반의 소추모 및 융모막에서 1차 HLA-G+ 외 영양층(EVT)의 정제, 특성 분석 및 배양을 가능하게 합니다. 1차 EVT 배양은 96시간 동안 생존 가능성을 유지하여, 샘플이 일치한 모체 면역세포와의 공동 배양과 이들의 상호작용에 대한 유동 세포 및 분자 분석을 가능하게 합니다.

표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G+ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

배우세요 회전 세포 배양 시스템(RCCS)을 이용한 3D 인간 세포 배양 기법으로, 저전단력 환경에서 extravillous trophoblast 세포의 분화 및 유전자 발현을 분석하는 방법입니다.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

더 많은 동영상 탐색