Name: 멀티 컬러의 신경 회로 지형을 공개 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 WGA-Alexa 형광 추적자를 이용한 생체 내 신경 회로 매핑 방법을 통해 소뇌, 대뇌피질, 뇌간 및 척수의 토포그래픽 투영을 시각화하는 기술입니다. 이 방법은 고강도 삼중 라벨링과 즉각적인 전체 장착 이미징이 가능합니다.

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이 작품은 RVS로 시작 자금 예시바 대학 의과 알버트 아인슈타인 대학에서 새로운 조사에 의해 지원되었다.

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 성공 axonal와 dendrite 신속하게 개발하고 성인 생쥐의 신경 전망을 라벨에 대한 소설 형광 기반의 접근법을 사용 추적에 필요한 수술과 기술 세부 사항을 설명합니다. WGA - 알렉사를 사용하여 우리는 추적기와 마커는 높은 해상도로 패턴 회로 지형을 분석하고 3 차원에 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 대부분의 추적기는 콜레라 독소의 subunit의 B, Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHAL), fluororuby, fluoremerald 및 fluorogold를 포함한 회로의 연결을 추적하실 수 있습니다. 또한, 최근 유전자 및 바이러스 기반의 추적기는 molecularly 별개의 연결 집합은 topographically 큰 정밀도와 자신의 목표에 연결되어있는 것을 증명하고있다. 일부 신경 추적기는 주로 중 anterograde 또는 역행 방향 (3000 MW 비교 예 BDA 10,...

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비 / 시약 </td><td> 모델 / 카탈로그 번호를 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> 비드 살균기 </td><td> 모델 250 고양이를 Steri. # 18000-45 </td><td> 파인 과학 도구 </td></tr><tr><td> Cauterizer </td><td> 고양이. # 18000-00 </td><td> 파인 과학 도구 </td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 모세관 </td><td> 고양이. # 300056 </td><td> 하버드 장치 </td></tr><tr><td> 듀얼 스테이지 유리 Micropipette 풀러 </td><td> 모델 001 - PC - 10 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 마이크로 미터 주사기 </td><td> 고양이. # GS - 1100 </td><td> Gilmont 인 스트 루먼트 </td></tr><tr><td> 작은 동물 Stereotaxic 악기 </td><td> 모델 940 - A </td><td> Kopf 계측 </td></tr><tr><td> 전극 속이는 사람 </td><td> 모델 960 </td><td> Kopf 계측 </td></tr><tr><td> Vetcare 챔버 </td><td> 고양이. #340,508 </td><td> 하버드 장치 </td></tr><tr><td> 손난로 </td><td> 고양이. # 341241 </td><td> 하버드 장치 </td></tr><tr><td> Leica DFC360 FX 카메라 </td><td> DFC360 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC490 카메라 </td><td> DFC490 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DM5500 현미경 </td><td> DM5500 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX 카메라 </td><td> DFC3000 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA 현미경 </td><td> MZ16 FA </td><td> Leica </td></tr><tr><td> CY3 필터 </td><td> 모델 # 11600231 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> FITC 필터 </td><td> 모델 # 11513880 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> A4 DAPI / UV 필터 </td><td> 모델 # 11504162 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> 밀 배아 agglutinin, 알렉사 형석 488 공액 </td><td> 고양이. # W11261 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 밀 GERm agglutinin, 알렉사 형석 555 공액 </td><td> 고양이. # W32464 </td><td> Invitrogen </td></tr></tbody></table>

멀티 컬러의 신경 회로 지형을 공개

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

신경 회로는 기능 지형지도로 구성되어 있습니다. 복잡한 회로 아키텍처를 시각화하기 위해 우리는 여러 지형 예측의 글로벌 patterning을 안정적으로 라벨 접근 방식을 개발했습니다. 소뇌는 신경 회로의 질서 배열을 연구하는 이상적인 모델입니다. 예를 들어, spinocerebellar 이끼 낀 섬유의 compartmental 조직은 이끼 낀 섬유 patterning을 연구를위한 필수적인 시스템으로 입증되었습니다. 우리는 최근 그 알렉사 555 및 488에 복합 밀 배아 agglutinin (WGA)이 개발하고 성인 마우스에 spinocerebellar 이끼 낀 섬유 계획을 추적 사용할 수 있습니다 보여주었다 (Reeber 외. 2011)를. 우리는 신경 전망을 라벨에 대한 WGA - 알렉사 추적하는 바람직한 도구를 만드는 세 가지 주요 속성을 발견했습니다. 첫째, 알렉사의 fluorophores은 집중하고 자신의 밝기를 직접 추적 후 wholemount 이미징을 허용합니다. 둘째, WGA - 알렉사 추적기 개발과 성인 신경 projectio의 전체 궤도 레이블을NS. 셋째, WGA - 알렉사으로 추적은 빠르게 역행하고 anterograde 두 방향으로 수송됩니다. 여기, 우리는 추적기와 기타 필요한 도구, spinocerebellar 추적에 대한 수술을 수행하는 방법과 최상의 방법을 3 차원에 투영 이미지를 추적하기 위해 준비하는 방법을 자세히 설명합니다. 요약에서, 우리는뿐만 아니라 소뇌에서뿐만 아니라 대뇌 피질, brainstem 및 척수의 기능지도의 조직과 연결성을 파악하는 데 유용할 수있는 단계별로 추적 프로토콜을 제공합니다.

우리는 제공 추적기에 대한 실질적인 가이드를 제공합니다<em&gt; 생체내에</em&gt;와 생쥐에서 성공의 연결 회로 분석을위한 필수적인 단계를 보여주는 모델 시스템으로 spinocerebellar 경로를 사용합니다. 우리는 자세히 알렉사의 fluorophores에 복합 밀 배아 agglutinin (WGA)를 이용하는 우리의 다목적 추적 프로토콜을 설명합니다.

신경 회로는 기능적 지형도(topographic maps)로 구성되어 있습니다. 복잡한 회로 구조를 시각화하기 위해, 우리는 신뢰성 있게 ... 하는 접근법을 개발하였습니다.

본 절차는 Alexa 형광체와 결합된 밀 배아 글루테닌을 이용하여 신경 회로를 추적하는 다목적 in vivo 추적 프로토콜을 설명합니다. 먼저, 하부 흉부 영역과 상부 요추 영역에 절개를 가한 뒤, 근막과 표층 척수 근육을 절개합니다. 두 번째 단계로 후궁 절제술을 수행합니다.다음으로, 미세 전극을 준비하여 미세 조작기에 부착합니다. 이어서 신경 추적자를 척수 내로 압력 주입합니다. 본 절차의 마지막 단계는 회복 기간 동안 적절한 수술 후 관리를 제공하고, 추적자가 목표 신경로 전체로 운반될 수 있도록 충분한 시간을 주는 것입니다.최종적으로, 면역형광 현미경법을 통해 소뇌 피질, 뇌줄기 및 척수 내 지형도(topographic maps)의 조직과 연결성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. BDA 또는 W-G-A-H-R-P와 같은 기존 추적제와 비교했을 때 이 추적제의 주요 장점은 WGA Alexa 추적제가 충분히 밝아 추적 후 모든 마운트 이미징을 직접 수행할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 피질, 소뇌, 뇌줄기 및 척수 시스템 내부와 상호 간의 다중 지형 투사(topographic projections)의 전역적 패턴을 형성하는 기저 논리가 무엇인지와 같은 시스템 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시작하기 전에.모든 조작이 IACUC 가이드라인을 준수하는지, 수술을 위한 무균 영역이 확보되었는지, 그리고 사용될 모든 기구가 멸균되었는지 확인하십시오. 동물에게 승인된 마취제를 투여한 후 수술 전 과정에 걸쳐 무균 수술 기법을 사용해야 하며, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 적절한 마취 수준에 도달했는지 확인하십시오. 동물이 완전히 마취되면 발 반사(pedal reflex)가 소실되어야 합니다.이발기를 사용하여 수술 부위의 털을 깎습니다. 다음으로, 안쪽에서 바깥쪽으로 원을 그리며 멸균 거즈 패드 위에 동물을 등 쪽이 위로 오도록 눕힙니다. 깎아낸 부위를 알코올 솜 두 세트로 닦아낸 후, 70% alcohol Betadine으로 닦습니다.그 후 다시 한번 알코올 솜으로 닦아내고, 동물의 준비가 완료되면 작은 구멍이 뚫린 멸균 거즈 패드를 동물 위에 덮어 수술 부위를 명확하게 구분합니다. 이러한 방식으로 수술을 진행하며 적절한 멸균 수술 기법을 유지합니다. 핀셋을 사용하여 피부를 들어 올리고, 하부 흉부 및 상부 요추 부위 바로 위의 정중선에 가위로 절개창을 냅니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

서로 다른 피질 레이어에서 네트워크 감각 정보를 인코딩하는 방법 피질 회로에 대한 우리의 이해에 근본적인 문제가 있습니다. 여기, 우리는 대뇌 피질의 레이어를 식별하는 단일 단위 및 지역 현장 잠재력 및 현재의 분석을 기록하는 멀티 문의 판상 전극을 이용 electrophysiological 기법을 설명합니다.

사용하는 로컬 네트워크 처리를 검토 멀티 연락처 판상 전극 기록

본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석​​ 할 수 있습니다.

레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

신경 회로는 topographically 특정 분자 프로필과 기능적 구획으로 구성되어 있습니다. 여기서는 다양한 wholemount immunohistochemical 염색법 접근 방식을 사용하여 글로벌 뇌의 지형을 드러내는을위한 실용적이고 기술적인 단계를 제공합니다. 우리는 잘 이해 cytoarchitecture과 소뇌의 회로를 사용하는 방법의 유틸리티를 보여줍니다.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다.

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

신피질(neocortex)의 일차 감각 영역은 발달 과정에서 독특한 자발적 활동을 보입니다. 이 기사에서는 생체 내 신생아 마우스의 영역별 동기 활동을 분석하기 위해 개별 뉴런 활동과 주요 감각 영역을 시각화하는 방법을 설명합니다.

단일 뉴런 해상도에서 신생아 마우스 감각 피질의 자발적 활동에 대한 In vivo 시각화

여기서는 HD-MEA를 사용하여 대규모 신경 앙상블, 특히 해마, 후각 전구 회로 및 인간 신경 네트워크의 계산 역학을 탐구합니다. 계산 도구와 결합된 시공간 활동을 캡처하면 신경 앙상블 복잡성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능에 대한 이해를 높여 잠재적으로 신경 장애에 대한 바이오마커 및 치료법을 식별합니다.

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

배우세요 WGA-Alexa 형광 추적자를 이용한 생체 내 신경 회로 매핑 방법을 통해 소뇌, 대뇌피질, 뇌간 및 척수의 토포그래픽 투영을 시각화하는 기술입니다. 이 방법은 고강도 삼중 라벨링과 즉각적인 전체 장착 이미징이 가능합니다.

멀티 컬러의 신경 회로 지형을 공개

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