Name: 영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 배우세요 G-CaMP2를 발현하는 생쥐의 VNO 조직 슬라이스를 준비하여 페로몬 반응을 칼슘 이미징으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 뉴런 활동을 실시간으로 관찰하여 포유류의 화학적 의사소통 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

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동물 사육 및 기술 서비스에 대해 훌륭한 지원을 제공해 주신 Andrea Moran과 Stowers Institute의 실험동물서비스센터(LASF) 구성원들에게 감사드립니다. 본 연구는 Stowers Institute와 NIH(NIDCD 008003)로부터 CRY가 받은 연구비 지원을 통해 수행되었습니다. 본 콘텐츠의 책임은 전적으로 저자들에게 있으며, 국립청각 및 기타 의사소통 장애 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 반드시 대변하는 것은 아닙니다. tetO-G-CaMP2 마우스에 대해 Stowers Institute, CRY 및 LM의 미국 특허가 출원 중입니다.

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<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
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<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
</ol>

선언된 이해상충 없음.

Dulac과 Axel에 의해 발견된 이후 5, 대다수의 서골비강 수용체(vomeronasal receptors, VRs)는 여전히 오판 수용체(orphan receptors)로 남아 있습니다. 이러한 화학감각 수용체의 페로몬 리간드와 동물의 행동을 매개하는 이들의 역할은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다. 지금까지는 단 한 쌍의 리간드/수용체인 ESP1 펩타이드와 그 인지 수용체인 Vmn2r116 (V2Rp5)만이 확인되었으며, 이들이 특정한 사회적 정보를 전달한다는 것이 입증되었습니다 19,23. 또 다른 수용체인 V1rb2는 암컷 생쥐의 소변에 풍부한 것으로 추정되는 2-heptanone에 반응하는 것으로 나타났습니다 24. 그러나 이 리간드에 의해 전달되는 구체적인 정보는 여전히 불분명합니다. 본 연구에서 개발한 방법은 수많은 자극에 대한 VNO 뉴런의 반응 특성화와 활성화 패턴 분석을 가능하게 합니다. 이 방법을 사용하여, 특정 세포들이 수컷 또는 암컷의 소변에 특...

영상의 연결 응답 vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

서골비기관(vomeronasal organ, VNO)은 동일 종 내 개체들의 사회적, 성적 및 생식 상태에 대한 정보를 담고 있는 화학 감각 신호를 감지합니다 1,2. 페로몬이라고 하는 이러한 종 내 신호와 일부 포식자로부터 오는 신호는 3 매우 높은 특이성과 민감도로 서골비 감각 신경세포(vomeronasal sensory neurons, VSNs)를 활성화합니다 4. 화학 감각 단서를 감지하는 과정을 매개하기 위해 V1R, V2R 및 FPR 5-14의 최소 세 가지 서로 다른 G-단백질 결합 수용체 가족이 VNO 신경세포에서 발현됩니다. VNO가 페로몬 정보를 어떻게 인코딩하는지 이해하기 위해서는, 다양한 자극에 대한 개별 VSN의 반응 프로필을 분석하고 이러한 반응을 매개하는 특정 수용체를 식별하는 것이 매우 중요합니다.
VNO의 신경상피는 한 쌍의 서골(vomer bones)에 둘러싸여 있습니다. VNO의 반맹관 구조는 비강과 연결되는 하나의 개구부(서비관, vomeronasal duct)를 가지고 있습니다. VSN은 수지상 돌기를 VNO의 내강 부분까지 뻗으며, 이곳에서 페로몬 신호가 수지상 돌기 노브(dendritic knobs)에 발현된 수용체와 접촉하게 됩니다. VSN의 세포체는 가층층 구조를 형성하며, V1R과 V2R이 각각 정단층과 기저층에 발현됩니다 6-8. 감각 자극에 대한 VSN의 반응을 모니터링하기 위해 여러 기술이 활용되어 왔습니다 4,12,15-19. 이러한 기술들 중에서 급성 절편 제작법(acute slice preparation)은 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 분리된 VSN 3,17과 비교하여 절편 제작법은 뉴런을 본래의 형태대로 유지하며 세포의 수지상 돌기가 상대적으로 온전하게 보존됩니다. 둘째, 상피 전체나 전체 마운트(whole-mount) 제작법에 비해 12,20 VNO의 관상 절편(coronal slice)에서는 VSN의 세포체에 쉽게 접근할 수 있어 전기생리학적 연구와 이미징 실험이 가능합니다. 셋째, 이 방법은 분자 클로닝 기술과 결합하여 수용체 식별을 가능하게 할 수 있습니다.
감각 자극은 VSN에서 수용체 활성화를 나타내는 강력한 Ca2+ 유입을 유도합니다 4,21. 이에 따라 우리는 VSN을 포함한 후각 sensory neuron에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 마우스를 개발하였습니다 15,22. 이 프로브의 민감도와 유전적 특성은 Ca2+ 이미징 실험을 크게 용이하게 합니다. 이 방법은 이전 연구들 4,21에서 사용된 염료 로딩 과정을 제거하였습니다. 또한 우리는 VNO 절편에 다양한 자극을 가할 수 있는 리간드 전달 시스템을 채택하였습니다. 이 두 가지 기술의 결합을 통해 수많은 자극에 반응하는 여러 뉴런을 동시에 모니터링할 수 있습니다. 마지막으로, 이미지 프로세싱을 돕기 위한 반자동 분석 파이프라인을 구축하였습니다.

서골비기관(VNO)은 사회적 및 생식 정보를 전달하는 종내 화학 신호를 감지합니다. 본 연구진은 VNO 조직에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하여 Ca2+ 이미징 실험을 수행하였습니다. 이러한 접근 방식을 통해 수많은 페로몬 자극에 대한 서골비 뉴런의 복잡한 반응 패턴을 분석할 수 있습니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

서골비기관(vomeronasal organ, VNO)은 ... 내 개체들의 사회적, 성적 및 생식 상태에 관한 정보를 전달하는 화학감각 신호를 감지합니다.

본 절차의 전반적인 목적은 MRO 비기관 뉴런의 페로몬 반응을 이미지화하기 위해 살아있는 조직 슬라이스를 준비하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 GCaMP two 유전적 칼슘 지표를 발현하는 마우스로부터 살아있는 MRO 비기관 또는 VNO 조직 슬라이스를 준비함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 슬라이스 유지, 자극 적용 및 이미지화를 위해 현미경 스테이지 위에 관류 시스템을 설정하는 것입니다.반응 단계입니다. 이후 다양한 페로몬 자극을 통해 타임랩스 이미징 실험을 수행하고, 이미징 결과에 대한 데이터 분석을 진행합니다. 최종적으로 서로 다른 페로몬 자극에 대한 VNO 뉴런의 반응 패턴을 도출합니다.이 기술의 주요 장점 또는 칼슘 D 로딩이나 분리된 세포에서의 이미징과 같은 기존 방법의 장점은 세포의 온전한 형태를 보존하고, 슬라이스의 건강 상태를 더 잘 유지하며, 더 강한 신호를 얻을 수 있다는 점입니다. 이 방법은 리간드와 그 수용체를 식별하고 개별 벌레 코 뉴런의 반응을 프로파일링하는 것과 같이, 벌레 코 시스템 연구의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한 이 방법은 후각, 혈청 또는 뇌 건선과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.일반적으로, 이 방법을 처음 접하는 연구자는 양질의 건선 표본을 확보하고 관류 시스템을 설정하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 동봉된 원고에 따라 마우스, 인공 뇌척수액 링거액, 4% 저융점 아가로스 및 페로몬 자극제를 포함하여 필요한 용액들을 준비하십시오. 그 후, 저융점 아가로스가 담긴 튜브 두 개를 가열 블록 위에 놓습니다.온도를 60°C 이상으로 설정하여 아가로스(agarose)를 녹입니다. 겔이 액체 상태가 되면 튜브를 37°C 히팅 블록으로 옮깁니다. VNO 슬라이스를 준비합니다.안락사시킨 GCaMP two 마우스의 머리를 절단한 후, 가위로 하악골을 잘라 아래턱을 제거합니다. 다음으로, 능선 모양의 상구개 조직을 벗겨내어 비강을 노출시킵니다. 그런 다음 두 앞니 사이에 수술용 칼날을 삽입하여 턱뼈를 분리합니다.턱뼈를 조심스럽게 제거하여 VNO를 노출시킵니다. 이때 미골 부분을 잡고 비강에서 VNO 전체를 들어 올립니다. VNO를 차갑게 산소화된 생쥐 A CSF 용액으로 옮깁니다.해부 현미경 아래에서 핀셋의 팁을 비강격벽(septal bone)의 벽을 따라 조심스럽게 밀어 두 개의 vno를 분리합니다. VNO 조직을 감싸고 있는 취약골(vulner bone)을 벗겨냅니다. 그런 다음 뼈 강에서 전체 VI NO 조직을 조심스럽게 들어 올립니다.신경 상피가 손상되지 않도록 이 단계에서 각별한 주의를 기울여야 합니다. 다음으로, 조직 표면에 남아 있는 작은 골편들을 완전히 제거하십시오. 남아 있는 파편들을 포매하기 전에.절단 날에 조직이 걸려 aros 블록에서 조직이 빠져나올 수 있습니다. 그 후, 포셉을 사용하여 VNO 조직의 후단을 잡고 녹은 aros에 천천히 담급니다. 튜브를 얼음 위에서 빠르게 냉각시키십시오.aros를 응고시키기 위해, 매몰 및 냉각 과정은 2분 이내에 완료되어야 합니다. 그런 다음 VNO가 포함된 aros 블록을 다듬고 조직 홀더에 접착합니다. 이어서 조직 홀더를 금속 실린더에 삽입하고, 남은 공간을 추가적인 저융점 aros로 채웁니다.저융점 aros가 얼음 위에서 응고되면 즉시 절편 제작을 진행하십시오. 조직 절편기(tissue slicer)의 절편 챔버에 산소가 공급된 mouse A CSF를 즉시 공급하고, 각 절편을 180에서 200 micron 두께로 자릅니다. 그런 다음 절편들을 수집하여 배양 챔버로 옮깁니다. 이 절편들은 실온의 산소 공급 mouse A CSF 내에서 6~8시간 동안 생존 가능합니다.본 절차에서는 먼저 VNO 절편을 관류 챔버 중앙에 놓고 절편 앵커로 절편을 고정합니다. 앵커의 나사산은 절편의 저융점 aros 부분에만 닿아야 하며, VNO 조직을 압박해서는 안 됩니다. 그런 다음, 입구 포트를 통해 산소화된 마우스 A CSF를 초당 약 100 µL의 속도로 관류 챔버에 공급합니다.흡입 바늘을 통해 배출구 포트로 액체를 배출하여 신선한 마우스 A CSF가 지속적으로 흐르게 합니다. 다음으로, 30밀리리터 주사기에 링거 용액을 채우고 주사기 펌프에 고정합니다. 펌프 속도를 분당 300에서 600마이크로리터로 설정하십시오.슬라이스 위에 링거 용액을 지속적으로 흐르게 하려면, 링거 장치의 배출구를 A-H-P-L-C 주입 루프에 연결하십시오. 주입 루프 제어 장치에는 두 가지 유로가 있습니다. 로드 위치에서 Hamilton 정밀 시린지를 사용하여 마우스 소변 샘플을 샘플 루프에 로드하십시오.과잉 샘플은 샘플 루프를 통해 폐액 배출구로 나갑니다. 시린지 펌프에 의해 주입된 링거액(Ringer's solution)은 샘플 루프를 우회하여 주입 위치의 관류 팁(perfusion tip)과 연결된 배출구로 직접 이동합니다. 펌프 용액은 샘플 루프를 통해 흐르며 페로몬 자극제를 배출구로 밀어냅니다.이미징 실험 전, 관류액의 원활한 흐름을 보장하기 위해 기포를 제거하십시오. 그런 다음 5배 또는 10배 렌즈 하에서 관류 팁을 조정하여, 팁이 vien O 슬라이스로부터 약 1mm 떨어지도록 하십시오.시료 지연 시간과 형광 염료 로딩 지속 시간을 측정하기 위해, 0.1% Rhodamine 6G 염료를 시료 루프에 주입합니다. 그런 다음 밸브를 주입 위치로 전환합니다. 이미지 획득 시작 5초 후, 10초에서 30초 사이에 형광 신호를 검출합니다.형광 신호의 매끄러운 곡선은 디핑 렌즈 아래에서 난류가 거의 발생하지 않으며, 산소가 공급된 마우스 A CSF가 슬라이스에 충분히 관류되고 있음을 나타냅니다. 본 연구실에서는 GAMP 2 신호를 검출하기 위한 타임랩스 이미징에 10x 또는 20x 워터 디핑 렌즈가 장착된 Zeiss Axio scope FS two 현미경을 사용합니다. 필터는 450에서 490 nanometers 범위의 표준 GFP 밴드패스 필터를 사용합니다.에피 형광 이미지는 GCaMP two의 발현 수준에 따라 1x1 또는 2x2 빈닝을 적용하여 CCD 카메라로 획득합니다. 먼저, 획득 속도를 초당 1프레임으로 설정하십시오. GCaMP two 신호의 퇴색과 세포의 광손상을 최소화하도록 빛의 세기를 조절하십시오.그다음, 실험 세트 내의 모든 시행에서 일관된 시간 지연을 얻기 위해 특정 시점에 밸브를 주입 위치로 전환합니다. 이제 링거액을 자극제로 사용하여 테스트 실행을 수행하고, 샘플 주입 중에 움직임 아티팩트(movement artifact)가 발생하면 관류 설정을 재조정합니다. 그 후, 서로 다른 샘플 간의 교차 오염을 방지하기 위해 1:100로 희석한 마우스 소변으로 양성 대조군 실행을 수행합니다.하나의 자극제를 로딩한 후, Hamilton 시린지를 링거 용액으로 최소 3회 세척하십시오. 마찬가지로, 다른 자극제를 적용하기 전에 샘플 루프를 링거 용액으로 최소 3회 세척하십시오. 다음 자극을 주기 전에는 MRO 비강 감각 뉴런이 회복될 수 있도록 4분에서 10분 동안 대기하여, 하나의 슬라이스에서 획득한 모든 이미지의 이미지 등록(image registration)을 수행하십시오.이 과정을 자동화하기 위해 Avision에서 작성된 맞춤형 VBA 스크립트가 사용됩니다. 이 경우, 동일한 실험 내의 모든 이미지 프레임은 응답 세포를 식별하기 위한 이미지 감산(image subtraction)을 수행하기 위해 elastic 기능을 이용하여 선택된 공통 참조 프레임에 정렬됩니다. 이 과정을 자동화하기 위해 ImageJ 버전 1.42의 맞춤형 매크로가 사용됩니다.각 스택에 대해 최소 투영 영상을 생성하며, 원본 스택에서 최소 투영 영상을 뺀 후 반응하는 세포들이 나타납니다. 다음으로, 감산된 스택에서 관심 영역(ROI)을 식별하고 Image J의 multi mesure 플러그인을 사용하여 ROI 좌표를 얻습니다. 그런 다음 한 실험에 대한 모든 스택을 처리하고 모든 ROI 좌표를 ROI 마스터 리스트에 저장합니다. 그 후, 맞춤 제작된 매크로와 Image J의 multi mesure 플러그인을 사용하여 ROI 마스터 리스트를 기반으로 원본 이미지 스택에서 세포 반응을 측정합니다. 마지막으로 matlab에서 반응 곡선과 히트맵을 작성합니다.여기에 4마리의 개별 마우스로부터 수집한 소변 샘플을 이용한 VNO 이미징 실험의 예시가 제시되어 있습니다. 약 80개의 세포가 적어도 하나 이상의 소변 자극에 반응을 보였으며, 이들의 반응 delta F/F 값이 히트맵에 표시되었습니다. 여기 세포 1, 2, 3의 반응 추적 곡선이 있으며, 이는 소변 자극에 의한 시간 경과별 활성화를 보여줍니다. 세포 1은 암컷 소변 샘플 모두에 반응을 보였으나, 수컷 샘플에는 반응하지 않았습니다.반면 세포 2는 반대되는 활성화 패턴을 보이며 두 남성 샘플 모두에 반응합니다. 오직 세포 3만이 개별 남성 및 여성 샘플 모두에 의해 활성화됩니다. 숙련되면, 슬라이스는 30분 만에 준비될 수 있으며, 적절히 수행될 경우 피아노 뉴런을 6~8시간 동안 생존 상태로 유지할 수 있습니다.이 방법을 시도할 때, 조직 배양 등급의 시약을 사용하고 조직 표본이 조직 고정 시약과 접촉하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마우스에서 G Camp를 발현하는 비엔나 뉴런의 열 반응 이미징을 위해 살아있는 조직 건선 표본을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 - 리간드 식별 편리합니다.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을...

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

배우세요 G-CaMP2를 발현하는 생쥐의 VNO 조직 슬라이스를 준비하여 페로몬 반응을 칼슘 이미징으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 뉴런 활동을 실시간으로 관찰하여 포유류의 화학적 의사소통 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

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