Name: 영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 배우세요 G-CaMP2를 발현하는 생쥐의 VNO 조직 슬라이스를 준비하여 페로몬 반응을 칼슘 이미징으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 뉴런 활동을 실시간으로 관찰하여 포유류의 화학적 의사소통 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

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동물 사육 및 기술 서비스에 대해 훌륭한 지원을 제공해 주신 Andrea Moran과 Stowers Institute의 실험동물서비스센터(LASF) 구성원들에게 감사드립니다. 본 연구는 Stowers Institute와 NIH(NIDCD 008003)로부터 CRY가 받은 연구비 지원을 통해 수행되었습니다. 본 콘텐츠의 책임은 전적으로 저자들에게 있으며, 국립청각 및 기타 의사소통 장애 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 반드시 대변하는 것은 아닙니다. tetO-G-CaMP2 마우스에 대해 Stowers Institute, CRY 및 LM의 미국 특허가 출원 중입니다.

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</ol>

선언된 이해상충 없음.

Dulac과 Axel에 의해 발견된 이후 5, 대다수의 서골비강 수용체(vomeronasal receptors, VRs)는 여전히 오판 수용체(orphan receptors)로 남아 있습니다. 이러한 화학감각 수용체의 페로몬 리간드와 동물의 행동을 매개하는 이들의 역할은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다. 지금까지는 단 한 쌍의 리간드/수용체인 ESP1 펩타이드와 그 인지 수용체인 Vmn2r116 (V2Rp5)만이 확인되었으며, 이들이 특정한 사회적 정보를 전달한다는 것이 입증되었습니다 19,23. 또 다른 수용체인 V1rb2는 암컷 생쥐의 소변에 풍부한 것으로 추정되는 2-heptanone에 반응하는 것으로 나타났습니다 24. 그러나 이 리간드에 의해 전달되는 구체적인 정보는 여전히 불분명합니다. 본 연구에서 개발한 방법은 수많은 자극에 대한 VNO 뉴런의 반응 특성화와 활성화 패턴 분석을 가능하게 합니다. 이 방법을 사용하여, 특정 세포들이 수컷 또는 암컷의 소변에 특...

영상의 연결 응답 vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

서골비기관(vomeronasal organ, VNO)은 동일 종 내 개체들의 사회적, 성적 및 생식 상태에 대한 정보를 담고 있는 화학 감각 신호를 감지합니다 1,2. 페로몬이라고 하는 이러한 종 내 신호와 일부 포식자로부터 오는 신호는 3 매우 높은 특이성과 민감도로 서골비 감각 신경세포(vomeronasal sensory neurons, VSNs)를 활성화합니다 4. 화학 감각 단서를 감지하는 과정을 매개하기 위해 V1R, V2R 및 FPR 5-14의 최소 세 가지 서로 다른 G-단백질 결합 수용체 가족이 VNO 신경세포에서 발현됩니다. VNO가 페로몬 정보를 어떻게 인코딩하는지 이해하기 위해서는, 다양한 자극에 대한 개별 VSN의 반응 프로필을 분석하고 이러한 반응을 매개하는 특정 수용체를 식별하는 것이 매우 중요합니다.
VNO의 신경상피는 한 쌍의 서골(vomer bones)에 둘러싸여 있습니다. VNO의 반맹관 구조는 비강과 연결되는 하나의 개구부(서비관, vomeronasal duct)를 가지고 있습니다. VSN은 수지상 돌기를 VNO의 내강 부분까지 뻗으며, 이곳에서 페로몬 신호가 수지상 돌기 노브(dendritic knobs)에 발현된 수용체와 접촉하게 됩니다. VSN의 세포체는 가층층 구조를 형성하며, V1R과 V2R이 각각 정단층과 기저층에 발현됩니다 6-8. 감각 자극에 대한 VSN의 반응을 모니터링하기 위해 여러 기술이 활용되어 왔습니다 4,12,15-19. 이러한 기술들 중에서 급성 절편 제작법(acute slice preparation)은 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 분리된 VSN 3,17과 비교하여 절편 제작법은 뉴런을 본래의 형태대로 유지하며 세포의 수지상 돌기가 상대적으로 온전하게 보존됩니다. 둘째, 상피 전체나 전체 마운트(whole-mount) 제작법에 비해 12,20 VNO의 관상 절편(coronal slice)에서는 VSN의 세포체에 쉽게 접근할 수 있어 전기생리학적 연구와 이미징 실험이 가능합니다. 셋째, 이 방법은 분자 클로닝 기술과 결합하여 수용체 식별을 가능하게 할 수 있습니다.
감각 자극은 VSN에서 수용체 활성화를 나타내는 강력한 Ca2+ 유입을 유도합니다 4,21. 이에 따라 우리는 VSN을 포함한 후각 sensory neuron에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 마우스를 개발하였습니다 15,22. 이 프로브의 민감도와 유전적 특성은 Ca2+ 이미징 실험을 크게 용이하게 합니다. 이 방법은 이전 연구들 4,21에서 사용된 염료 로딩 과정을 제거하였습니다. 또한 우리는 VNO 절편에 다양한 자극을 가할 수 있는 리간드 전달 시스템을 채택하였습니다. 이 두 가지 기술의 결합을 통해 수많은 자극에 반응하는 여러 뉴런을 동시에 모니터링할 수 있습니다. 마지막으로, 이미지 프로세싱을 돕기 위한 반자동 분석 파이프라인을 구축하였습니다.

서골비기관(VNO)은 사회적 및 생식 정보를 전달하는 종내 화학 신호를 감지합니다. 본 연구진은 VNO 조직에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하여 Ca2+ 이미징 실험을 수행하였습니다. 이러한 접근 방식을 통해 수많은 페로몬 자극에 대한 서골비 뉴런의 복잡한 반응 패턴을 분석할 수 있습니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

서골비기관(vomeronasal organ, VNO)은 ... 내 개체들의 사회적, 성적 및 생식 상태에 관한 정보를 전달하는 화학감각 신호를 감지합니다.

본 절차의 전반적인 목적은 MRO 비기관 뉴런의 페로몬 반응을 이미지화하기 위해 살아있는 조직 슬라이스를 준비하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 GCaMP two 유전적 칼슘 지표를 발현하는 마우스로부터 살아있는 MRO 비기관 또는 VNO 조직 슬라이스를 준비함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 슬라이스 유지, 자극 적용 및 이미지화를 위해 현미경 스테이지 위에 관류 시스템을 설정하는 것입니다.반응 단계입니다. 이후 다양한 페로몬 자극을 통해 타임랩스 이미징 실험을 수행하고, 이미징 결과에 대한 데이터 분석을 진행합니다. 최종적으로 서로 다른 페로몬 자극에 대한 VNO 뉴런의 반응 패턴을 도출합니다.이 기술의 주요 장점 또는 칼슘 D 로딩이나 분리된 세포에서의 이미징과 같은 기존 방법의 장점은 세포의 온전한 형태를 보존하고, 슬라이스의 건강 상태를 더 잘 유지하며, 더 강한 신호를 얻을 수 있다는 점입니다. 이 방법은 리간드와 그 수용체를 식별하고 개별 벌레 코 뉴런의 반응을 프로파일링하는 것과 같이, 벌레 코 시스템 연구의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한 이 방법은 후각, 혈청 또는 뇌 건선과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.일반적으로, 이 방법을 처음 접하는 연구자는 양질의 건선 표본을 확보하고 관류 시스템을 설정하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 동봉된 원고에 따라 마우스, 인공 뇌척수액 링거액, 4% 저융점 아가로스 및 페로몬 자극제를 포함하여 필요한 용액들을 준비하십시오. 그 후, 저융점 아가로스가 담긴 튜브 두 개를 가열 블록 위에 놓습니다.온도를 60°C 이상으로 설정하여 아가로스(agarose)를 녹입니다. 겔이 액체 상태가 되면 튜브를 37°C 히팅 블록으로 옮깁니다. VNO 슬라이스를 준비합니다.안락사시킨 GCaMP two 마우스의 머리를 절단한 후, 가위로 하악골을 잘라 아래턱을 제거합니다. 다음으로, 능선 모양의 상구개 조직을 벗겨내어 비강을 노출시킵니다. 그런 다음 두 앞니 사이에 수술용 칼날을 삽입하여 턱뼈를 분리합니다.턱뼈를 조심스럽게 제거하여 VNO를 노출시킵니다. 이때 미골 부분을 잡고 비강에서 VNO 전체를 들어 올립니다. VNO를 차갑게 산소화된 생쥐 A CSF 용액으로 옮깁니다.해부 현미경 아래에서 핀셋의 팁을 비강격벽(septal bone)의 벽을 따라 조심스럽게 밀어 두 개의 vno를 분리합니다. VN

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연구

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Neuroscience

신경과학

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 - 리간드 식별 편리합니다.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을...

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

배우세요 G-CaMP2를 발현하는 생쥐의 VNO 조직 슬라이스를 준비하여 페로몬 반응을 칼슘 이미징으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 뉴런 활동을 실시간으로 관찰하여 포유류의 화학적 의사소통 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

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