상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

이 실험 절차의 전반적인 목표는 정밀하게 보정된 일정한 광학력을 이용하여 길이가 100 nanometers인 짧은 DNA 분자를 조작하는 것입니다. 이를 위해 DNA의 한쪽 끝은 커버 슬립에, 다른 쪽 끝은 폴리스티렌 미세구체에 결합시킵니다. 그다음, 광학 집게를 정렬하고 보정합니다.

그 후, 마이크로구체에 작용하는 경사력(gradient forces)과 산란력(scattering forces)의 조합으로 인해 DNA가 표면으로부터 늘어납니다. 마지막으로, 비드를 포텐셜의 선형 영역에 가둠으로써 DNA를 확장시킵니다. 이 프로토콜은 DNA의 기계적 특성과 DNA-단백질 결합 역학을 연구하는 데 사용되어 왔으며, 짧은 DNA 구조체의 탄성에 있어 경계 조건의 중요성을 규명하는 데에도 유용하게 활용되었습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 일정 힘 광학 집게(constant force optical tweezers)의 정렬과 보정이 어렵고 복잡하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 광학 집게는 1064 nanometer 레이저 빔을 두 개의 서로 직교하는 편광 빔으로 분할하여 사용합니다. 하나는 생체 분자를 조작하는 데 사용되며, 다른 하나는 보정 목적으로 사용됩니다.

조작 빔의 강도는 AO 광학 편향기 또는 OD로 제어됩니다. 그 후 빔들은 또 다른 편광 빔 분할기를 통해 다시 결합됩니다. 이 빔들은 plan APO 60 x 1.4 오일 침수 현미경 대물렌즈에 의해 샘플 셀 위로 정밀하게 집속됩니다. 이 트위저 설정은 할로겐 램프의 조명이 콘덴서에 의해 샘플 챔버로 집속되는 자체 제작된 명시야 현미경과 결합되어 있습니다.

명시야 이미지는 다이크로익 거울에 의해 레이저 광과 분리된 후 두 개의 CCD 카메라로 이미징됩니다. 하나의 CCD는 데이터 획득을 위한 기본 수단으로 작동하며, 정밀한 샘플링 속도를 구현하기 위해 소프트웨어로 트리거됩니다. 다른 CCD는 고정된 단일 기준 미세구를 이미징하는 데 사용되며, 이 미세구의 위치는 현미경의 드리프트를 보정하는 피드백 제어 시스템의 역할을 합니다.

시료는 XY 스테이지를 통해 대물렌즈에 대해 대략적으로 위치를 잡은 후, 내장된 3차원 piezo 스테이지를 통해 정밀하게 위치를 조정할 수 있습니다. 전방 산란광과 투과 레이저광을 명시야 응축기로 수집하여 광검출기에 집중시킴으로써 비드의 크기를 보정하고, 인산염 완충 식염수에 희석된 직경 800 nanometer의 폴리스티렌 미세구체 분산액을 시료 챔버에 채웁니다. 10분에서 15분 동안 그대로 둔 다음 버퍼로 가볍게 세척합니다.

과잉 마이크로스피어를 제거하기 위해, 커버 글라스에 무작위로 부착된 마이크로스피어를 찾아 마이크로스피어가 초점에서 약 1 µm 아래에 위치할 때까지 시료 챔버의 높이를 조절합니다. LabVIEW를 사용하여 이미지의 겉보기 크기를 측정하기 위한 디포커스 이미지를 생성하려면, 우선 기하학적 패턴 매칭 기능을 사용하여 마이크로스피어의 중심을 찾습니다. 다음으로, 360도를 평균화하여 마이크로스피어의 방사형 강도 프로파일을 생성합니다.

각 단면의 중심에 맞게 방사형 프로파일을 2차 함수로 피팅하며, 이는 각 명시야 이미지의 흰색 링에 해당합니다. 밝기 피크를 찾기 위해, 이 피크와 중심 사이의 거리를 보정된 piso 스테이지를 이용한 비드의 겉보기 크기 측정값으로 사용할 수 있습니다. 마이크로구체의 축 방향 위치를 점진적으로 증가시키고, CCD 카메라를 사용하여 각 축 위치에서 이미지를 획득하십시오. 각 연속 이미지에 대해 이미지 분석을 반복하여 마이크로구체의 겉보기 크기와 축 방향 위치 간의 상관관계를 분석하십시오.

이 방법으로 얻은 축 방향 분해능은 약 1.4 nanometers입니다. 조작 빔의 광학적 포텐셜을 매핑하려면, 먼저 조작 빔을 끈 상태에서 조작 빔과 보정 빔을 동일 선상으로 정렬하십시오. 훨씬 더 강한 보정 빔의 트랩 내에 자유 마이크로구체를 가둡니다. 이제 조작 빔을 켭니다.

보정 빔보다 훨씬 약하기 때문에, 마이크로구체의 축 방향 위치가 약간 변동될 것입니다. 결과적으로 발생하는 축 방향 위치의 변화는 이미 설명한 바와 같이 디포커스 명시야 이미지(defocused bright field images)를 통해 측정할 수 있습니다. 축 방향 초점을 이동시키며 반복하고, 보정 빔 초점의 축 방향 위치에 따른 변위 delta X를 도식화하십시오.

마이크로구체의 최대 변위에 해당하는 축 방향 위치는 광학 트랩의 선형 영역 중심을 결정합니다. DNA 샘플을 신장시키려면 표면에 결합된 DNA 분자가 포함된 챔버를 장착하고, 명시야 이미지를 관찰하면서 망원경을 조정하여 조작 빔의 초점을 신장되지 않은 마이크로구체보다 약간 위에 둡니다. 그 다음, 마이크로구체 중 하나가 포획될 때까지 스테이지의 위치를 조정합니다. 마이크로구체를 광학 트랩의 XY 평면 중심에 대략적으로 위치시킨 후, LabVIEW에서 일련의 사각파를 생성하여 A OD로 전송함으로써 레이저 빔을 반복적으로 켜고 끕니다.

트랩을 반복적으로 켜고 끄면서 미세구체의 움직임을 관찰하십시오. 그리고 X축과 y축 방향으로 미세구체의 위치를 반복적으로 조정하는 동안, 레이저가 미세구체의 운동에 특정 방향성을 유도하는지 확인하십시오. 피조 스테이지(piso stage)를 제어하면, 레이저가 켜져 있을 때 움직임이 눈에 띄게 제한되더라도 X-y 평면에서 미세구체의 무작위 운동은 등방성(isotropic)을 띠어야 합니다.

다음으로, Z 방향으로 비드를 정렬합니다. 다시 레이저 빔을 펄스 형태로 켜고 끕니다. 이때 마이크로스피어의 축 방향 변위를 동시에 실시간으로 측정합니다.

DNA 램프를 신장시킬 때 Z 변위가 최대가 되는 지점인 선형 영역 내에 스테이지를 중심시킵니다. A OD에 0V에서 0.5V까지 0.025V 간격으로 전압 신호를 보내 레이저 강도를 조절합니다. 초당 100프레임의 속도로 400프레임을 기록하고 이를 평균 내어 축 방향 변위를 구합니다. 마지막으로 힘-신장 곡선을 도식화하고 이를 수정된 웜-라이크 체인(worm-like chain) 모델에 맞게 피팅합니다.

여기에 짧은 길이의 DNA 구간인 1, 298 base pairs 및 247 base pairs 길이의 2D NA 서열에 대한 힘-신장 곡선이 제시되어 있습니다. 일반적인 웜-라이크 체인(WLC) 모델은 이러한 길이 규모에서 유한 크기 효과와 경계 제약으로 인해 발생하는 제로 힘 신장을 고려해야 하므로 힘-신장 관계를 충분히 설명하지 못합니다. 따라서 힘-신장 측정값은 보조 자료에 더 자세히 설명된 유효 지속 길이와 제로 힘 신장을 피팅 파라미터로 사용하는 수정된 WLC 모델을 사용하여 피팅해야 합니다.

D-S-D-N-A의 윤곽 길이가 길 때, 유효 지속 길이(effective persistence length)는 단순히 공칭 지속 길이인 약 50 nanometers이며, 수정된 WLC 피팅에서 영점 힘 신장(zero force extension)은 무시될 수 있습니다. 개발 후, 298 base pair DNA의 유효 지속 길이는 35 nanometers였으며, 247 base pair DNA의 경우 25 nanometers였습니다. 이 방법은 조절 단백질 매개 DNA 루프의 형성 및 붕괴 역학 연구를 포함하여, DNA 및 DNA-단백질 복합체에 대한 다양한 나노 기계적 측정의 길을 열어주었습니다.