Name: 상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 배우세요 상수 강제 축 방향 광학 족집게를 이용하여 100나노미터 길이의 짧은 DNA 분자를 정밀하게 스트레칭하는 방법을. 이 기술은 DNA의 기계적 특성과 단백질 결합 동역학 연구에 활용됩니다.

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우리는 축 광학 핀셋과 관련하여 도움이이 원고에게 스트레칭 데이터의 일부를 기여를위한 Dr Yih-팬 첸 감사드립니다. 이 작품은 NSF 부여 PHY-0957293 및 FOCUS 부여 PHY-0114336 후원했다.

1. 핀셋 설정 <ol><li> 1064 nm의 레이저에서 빔은 두 개의 직교 편광 빔으로 분할되어 있습니다. 하나는 다른이 (그림을 참조하십시오. 2) 보정 목적으로 사용되는 동안 생체 분자를 조작하는 데 사용됩니다. </li><li> 각 빔의 위치 및 포커스가 독립적으로 각각 빔 조향 거울과 광학 망원경에 의해 제어되는 동안 조작 빔의 강도는 음향 광학 향기 (AOD)에 의해 제어됩니다. </li><li> 빔 그런 다음 다른 편광 빔 스플리터와 재결합하고 약간 현미경 대물의 뒷면 조리개를 너무 많이 넣다하기 위해 텔레 스코핑 광학의 마지막 세트에서 추가로 에어컨이 있습니다. 조작 빔에 대한 약간 작은 요소, 약 20 %가 선형 잠재력 큰 실행 가능한 영역으로 변환하는 얕은 초점을 제공하면서 보정 빔을위한 50 % 너무 많이 넣다가 꼭 광학 트랩에 연결됩니다. 빔은 단단하게 PlanApo 60x/1.4 오일 집중 현미경 OBJ에 중점을두고 있습니다샘플 셀에 ective. </li><li> 이 핀셋 설정은 콘덴서에 의해 샘플 챔버에 초점을 맞춘 할로겐 램프의 조명을 제공하는 홈 구축 brightfield 현미경과 결합되어 있습니다. brightfield 이미지는 이색 성 거울로 레이저 빛으로부터 분리 후 두 CCD 카메라에 이미징된다. 다른 CCD는 이미지를 가진 위치 현미경에서 드리프트를 보상하도록 피드백 제어 시스템 역할을하는 단일 붙어 참조 microsphere에 사용되는 동안 하나의 CCD 데이터를 취득 우리의 주요 수단으로 역할을하고, 정확한 샘플링 속도를 얻을 수 있도록 실행 소프트웨어입니다. </li><li> 샘플 coarsely XY 스테이지의 목적과 관련하여 위치하고 정확하게 포함 된 입체 압전 단계에 위치 할 수 있습니다. </li><li> 앞으로 분산 및 전송 레이저 광은 brightfield 응축기이 수집하여 광 검출기에 초점을 맞추고 있습니다. 그 결과 신호는 100 kHz에서에서 안티 앨리어싱 필터를 통해 필터링 증폭되고DAQ 카드를 사용하여 200 kHz에서에서 cquired. </li></ol> 2. 축 방향 위치에 비드의 확실한 크기를 보정 <ol><li> 이 인산염에 희석 800 nm의 직경 폴리스티렌 마이크로의 솔루션을 분산과 샘플 챔버 (9)를로드하는 것은 염분 버퍼. 10-15분에 앉아 후 가볍게 초과 마이크로을 제거하는 버퍼를 플러시 보자. </li><li> 무작위로 coverglass에 붙어 microsphere를 찾아서 microsphere가 defocused 이미지를 생성 할 수있는 초점을 아래에 약 1 μm까지의 샘플 챔버의 높이를 조정합니다. </li><li> 이미지의 명백한 크기를 측정하려면 먼저 LabView에서 기능을 일치 기하학적 패턴을 사용하여 microsphere의 중심을 찾으십시오. </li><li> 다음으로, 각 단면의 중심에 대해 360 °를 평균하여 microsphere의 방사상 강도 프로필을 생성합니다. brightfield 이미지의 각에 흰색 링에 해당하는 방사형 프로필, 찾을 이차 함수 장착 할 수 있습니다밝기 피크. 이 정상과 중심 사이의 거리가 구슬의 명백한 크기의 척도로 사용할 수 있습니다. </li><li> 보정 piezostage를 사용하여 서서히 microsphere의 축 위치를 증가시키고 CCD 카메라 각 축 위치에 이미지를 획득. </li><li> (그림을 참조하십시오. 3)의 축 위치를 microsphere의 명백한 크기를 상관 관계 각 연속 이미지의 이미지 분석을 반복합니다. 방법에 의해 얻은 축 해상도는 1.4 nm의 약 7입니다. </li></ol> 3. 조작 빔의 광학 가능성을 매핑 <ol><li> collinearly 조작 빔 및 보정 빔을 정렬하여 시작합니다. 조작 빔이 훨씬 약한있을 동안 보정 빔이 목표의 뒤쪽 구멍 50 주변 MW해야 10 MW이라고합니다. </li><li> 조작 빔이 스위치 오프로 교정 빔의 많은 엄격한 트랩 내에서 무료 microsphere를 한정. </li><li> 이제 마니 켜pulation 빔. 조작 빔이 보정 빔보다 훨씬 약한이기 때문에, microsphere의 축 위치는 약간 어리둥절합니다. 축 위치에 결과 변경으로 이미 설명 defocused brightfield 이미지에서 측정 할 수 있습니다. </li><li> 조작 빔을 해제하고 여전히 보정 빔에 갇힌 microsphere와 함께 망원경 렌즈를 조정하여 보정 빔의 축 포커스를 이동. , 조작 빔을 켜 microsphere와 반복의 후속 변위를 측정합니다. </li><li> 변위의 ΔX는 보정 빔의 초점의 축 위치에 역모를 꾸몄다 할 수 있습니다. microsphere의 가장 큰 변위에 해당하는 축 위치는 광학 트랩의 선형 지역 (그림을 참조하십시오. 4)의 중심을 결정합니다. </li><li> 축 위치의 함수로 조작 빔의 광학 힘을 얻기의 마지막 단계의 강성을주의 깊게 측정이 필요보정 빔. 이를 구하려면 조작 빔이 스위치 오프 상태에서 망원 렌즈를 조정하여 표면 위의 마이크로 미터 주위에 보정 빔에 갇혀 microsphere를, 이동합니다. </li><li> 광 검출기로 전송 빛의 강도를 측정하여 microsphere의 열 축 움직임을 기록합니다. </li><li> 신호의 자기 상관가 변동의 일정한 시간을 부여 하나의 지수 감쇠 함수에 장착 할 수 있습니다. τ Z </li><li> 유체 마찰 계수 ζ, microsphere의 대부분은 표면 5,10에 마이크로 근접을 위해 수정 될 수 있습니다. 보정 트랩의 강성 그 다음 κ Z = ζ / τ Z (참조 보충 자료 A와 B)에 의해 주어진다. </li><li> 교정 트랩의 강성을 아는 것은 한 힘 ƒ으로 생의 Z = κ Z ΔX 통합 이전에 측정 축 변위를 변환 할 수 있습니다S 커브가 조작 빔의 축 광학 가능성 (그림을 참조하십시오. 4)의 공간 매핑을 산출. </li></ol> 4. DNA 샘플 스트레칭 <ol><li> 챔버 (9)가 포함 된 표면이 닿는 DNA 분자를 (&lt;1 kbp) 마운트하고, brightfield 이미지를 관찰하면서 망원경을 조정하여 약간 unstretched 마이크로 위의 조작 빔의 초점을 배치합니다. 그런 다음 마이크로 중 하나가 갇혀 될 때까지 무대의 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 대략 광학 트랩의 XY 평면의 중심에있는 microsphere의 위치. LabView의 광장 파도의 일련을 생성하고 반복적으로 레이저 빔을 켜거나 끌 AOD로 보낼 수 있습니다. 조심스럽게 레이저 및 샘플 챔버의 가열을 방지하기에 국가의 기간의 강도를 제어합니다. 일반적으로, 레이저 전력 (목적의 뒤쪽 구멍에서 측정) 2 MW 주위에 사용하고 200 밀리 초 (에서), 500 MS (해제)의 펄스를 보낼 수 있습니다. 광장 w의 진폭번가는 AOD로 전송하면 0.5 주변해야 V. </li><li> 함정이 반복적으로 해제 켜져되어로 microsphere를 감상하고 레이저 microsphere의 움직임에 어떤 특혜 방향을 유도하는 경우 확인합니다. 반복적으로 X와 Y 방향 모두에서 microsphere 위치를 조정하는 동안 piezostage을 제어하여 microsphere의 임의의 움직임은 레이저가 켜져있을 때하지만 현저하게 제한 XY 평면에서 등방성 수있게됩니다. </li><li> 다음, Z 방향으로 구슬을 맞 춥니 다. 이 시간, 동시에 실시간으로 마이크로 축 변위를 측정하면서 다시 레이저 빔을 맥박과 해제. 선형 지역 내 센터 무대되는데,이 Z 변위가 가장 높은 지점입니다. </li><li> Z 방향으로 신중 정렬 후 트랩 여전히 XY 평면에 중심 있는지 확인하기 위해 필수적입니다. XY 정렬이 변경 한 경우 microsphere가 세 따라 적절히 중심으로 될 때까지, XY와 Z 정렬 모두 반복해야합니다축. </li><li> DNA에 이르는를 들어, 그들을 축 변위를 얻기 위해 기록, 0.025의 단계 V. 각 단계에서 0 V에서 0.5 V까지 AOD 400 100 프레임의 프레임과 평균 전압 신호를 전송하여 레이저 강도를 두는. </li><li> 힘 확장 곡선은 이제 (B 보충 자료 참조) 해본 및 수정 WLC 모델 11에 맞게 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 1298 BP와 247 BP 순서, 우리는 reproducibly 신축 할 수 있었던 가장 짧은 시퀀스되는 후자 : 우리는 두 개의 DNA 시퀀스에 힘 확장 곡선을 제시한다. 이 길이 저울에 하나는 유한 크기의 효과와 경계 제약에서 발생하는 제로 힘 연장을 설명해야하기 때문에 DNA의 짧은 뻗어 들어, 기존의 웜 형태의 체인 (WLC)이 모델은 완전히 힘 확장 관계를 설명하지 않습니다. 힘 확장 측정 그러므로 effecti이 수정 WLC 모델을 사용하여에 맞게해야지속성 길이와 보충 자료에 자세한 설명 적합한 매개 변수로 제로 힘을 확장하고있어. dsDNA 큰 윤곽 길이를 들어, 효과적인 지속성 길이는 단순히 명목상의 지속성 길이 (~ 50 nm 정도)과 제로 힘을 확장 무시 될 수 있습니다. 그러나 윤곽 길이가 짧아 해짐에 따라, 효과적인 지속성 길이는,은 50 나노 미터 및 DNA 아래 감소도 영 힘에 따라, 상당한 확장을 보여줍니다. 힘 확장 곡선의 데이터와 해당 맞게이 그림에 표시됩니다. 두 시퀀스에 대해 5. 수정 WLC 맞는부터, 우리는 효과적인 지속성 길이는 1,298 BP DNA와 247 BP의 DNA 25 나노 35 나노 미터로 결정했습니다. 설명의 목적을 위해, 우리는 각 순서의 힘 확장 곡선의 한 대책을 제시하고 있습니다. 실제로, 하나는 측정을 여러 번 반복하여 표준 오류와 함​​께 평균 결과를 얻을 것입니다. 그것은 THA도 주목해야합니다t 각 곡선을 취득 후에는 microsphere 이전에 프로토콜에 설명 된대로 달리 microsphere가 realigned해야합니다 선형 영역 내에 갇혀 올바른 위치에 유지되도록 필수적입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 축 방향 광학 족집게의 그림 1 원칙. (왼쪽) 초점 근처 종래의 광학 핀셋 트랩. 구슬 그런 다음 장력을 발휘하는 coverslip으로 측면 이동합니다. (오른쪽) 축 광 핀셋에서 microsphere는 광학 가능성의 선형 영역에서, 초점에서 떨어져 갇혀있다. 이 구성에서는 폴리머는 확장 범위에 대한 지속적인 긴장에서 개최됩니다. 또한, 레이저 강도를 증가하면 축 방향으로 microsphere를 이동합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 의 그림 2 도식 표현축 방향 광학 족집게 레이저 광 (1064nm ND : YvO 4). 편광 빔 스플리터 (PBS)를 통과하여 두 기둥으로 분할되어 있습니다. 조작 빔, 음향 광학 편 향기 (AOD)를 통해 전달하고 보정 빔은 망원경 렌즈를 사용하여 독립적으로 조정할 수 있습니다. 두 빔 그런 다음 높은 NA의 목적으로 다른 PBS를 사용하여 재결합 및 샘플에 중점을두고 있습니다. 동시에, brightfield 조명이 microsphere를 추적하는 데 사용, 샘플을 통과 필터링 (IR) 적외선이며, 다음 피드백 제어 시스템의 일부로서 다른 행위 동안 측정을 소요 하나는 두 개의 CCD 카메라에 의해 이미징 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 3 축 방향 위치 보정을 그림. 축 위치를 보정하기 위해, 우리는 무대의 축 위치를 변화의 챔버 coverslip에 붙어있는 구슬의 defocused 이미지를 획득. 마이크로의 크기phere은 그 중심과 microsphere의 이미지 주위에 형성된 밝은 링에 대한 최고 강도의 위치 사이의 거리에 의해 주어진다. 삽입은 구슬의 크기를 제공하는 레이디 얼 강도 분포를 제공합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 광학 가능성을 매핑 뒤에는 네 원리를 그림. 조작 빔의 광학 힘을 매핑하려면이 훨씬 더 강력한 보정 빔 안에 갇힌 microsphere에 유도하는 축 변위가 측정됩니다. 이 변위는 최대 인 선형 지역의 센터에 자리 잡고 있습니다. 축 방향 위치 곡선 대 광학 힘이 광학 가능성을 찾기 위해 통합 할 수 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 5"> 그림 5 강제 확장 곡선. 데이터는 임의의 1298 BP와 247 BP (삽입) segmen에 표시됩니다dsDNA의 t는 축 광학 핀셋으로되었다. 데이터 포인트는 EQ의 수정 WLC 모델에 맞게되었습니다. 3 (고체 라인)과는 1298bp와 247bp 각각에 대해 34 나노 미터 및 25 나노 미터의 효과적인 지속성 길이를 나왔고.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

종래의 광 핀셋은 refractile 개체에 일정한 힘을 적용하는 중 아날로그 또는 컴퓨터 제어의 의견에 의존하고 있습니다. 이러한 적극적인 피드백 시스템은 단백질의 바인딩에서 DNA 또는 필라멘트를 따라 분자 모터의 급속한 스테핑으로, 예를 들어, 어려움 표본의 확장의 급격한 변화가 발생할 조건 하에서 수행되어 있습니다. 일정한 힘을 적용하기위한 다양한 수동 방법이 최근 개발되었습니다. basepair 해상도의 RNA 중합 효소의의 스테핑를 해결하는 데 사용되는 하나의 방법은, 가우스 레이저 빔 (12)의 광학 가능성의 선형 영역 내에서 작업 참여. 우리는 일정한 힘을 축 광 핀셋을 생성하여 짧은 분자의 조작을 위해이 방법을 적응하고 있습니다. 축 광 핀셋은 기존의 광학 방법으로 조작에 액세스 할 수 없습니다 DNA의 짧은 뻗어 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 그들은 성으로 사용 된udy 몇 백 기본 쌍 8과 같은 소형와 단백질로 인...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 코멘트 </th></tr><tr><td> ND : YVO4 레이저 </td><td> 스펙트럼 물리학 </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> 음향 광학 변류기 </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 목표 </td><td> 하늘 </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1.4 </td></tr><tr><td> 압전 단계 </td><td> 매드시 연구소 </td><td> 나노 LP100 </td><td> XYZ 단계 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> 광 검출기 </td><td> 전기 광학 기술 </td><td> 동부 표준시 - 3020 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리스티렌 비즈 </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm​​, streptavidin 광을 낸 </td></tr><tr><td> 안티 digoxigenin </td><td> 로슈 </td> 11333089001 <td> 양에서 </td></tr><tr><td> 프리 머 </td><td> MWG 오페론 </td><td> 사용자 oligos </td><td> 하나의 뇌관 : 비오틴 기타 : digoxigenin </td></tr><tr><td> PCR 시약 </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> DNA 형성 촉매의 효소 dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에 대한 다른 화학 물질 버퍼 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 보충 자료 A. 유체 마찰 계수 표면 근처 microsphere의 유체 마찰 계수를 결정하는 사람은 다음과 같은 확장 5,10를 사용할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="수식 1"> 있는 다음과 같은 속기 H로 도입되었습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="수식이"> 마찰 계수는 표면 위에 거리 η에 위치한 microsphere의 중심으로, 유체 점성 η과 microsphere의 반지름의 관점에서 정의됩니다. 십년 쯤 조건에 확장 할 때 합류가 합리적으로 잘 converges. 강성 보정에 축 방향 위치의 B.의 영향 트랩 강성의 교정 표면에서 증가 거리를 증가 교정의 정확성, 그리고 함정이 실험적으로 사용되는 실제 축 위치 사이의 효율이 줄어을 포함한다. 일반적으로 트랩이 실제 실험 조건보다 더 높은 표면, 800-1000 nm의 주위에 교정된다. C.는 웜 형태의 체인 (WLC) 모델을 수정 힘 확장 곡선은 수정 WLC m에 맞게 할 수 있습니다odel이 다음과 같이 제로 광학 힘에 볼륨 제외 효과를위한 계정 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="수식 3"> F 선택은 광학 힘이고, X O는 영 힘 확장에 적합한 매개 변수이며, X 선택이 힘을 아래의 확장, 전 DNA의 윤곽 길이이며, L * P는 "효과에 대한 두 번째 적합한 매개 변수입니다 "지속성 길이. F wlc 일반적인 WLC 모델 11에 의해 주어진다 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="수식 4"> 위치 ε 상대 DNA 확장입니다.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 dna의 짧은 시퀀스를 스트레칭

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

이하 kilobase보다 윤곽 길이의 DNA에 이르는위한 단일 분자 기술은 실험 어려움이 따른다 있습니다. 그러나, 이러한 히스톤 구속력과 DNA 1,2의 단백질로 인한 루핑 등 여러 흥미로운 생물학적 이벤트가,이 길이 규모 발생합니다. 최근에는 DNA의 기계적 성질은 소형 nucleosomes와 염색질 섬유 3,4로 DNA의 패키징과 같은 기본적인 세포 과정에 중요한 역할을하는 표시되었습니다. 분명 DNA의 짧은 뻗어의 기계적 성질을 이해 한 후 중요합니다. 이 논문에서, 우리는 몇 백 basepairs 짧은 등의 윤곽 길이와 DNA의 기계적 동작을 연구 개발 한 단일 분자 광 tweezing 기술에 실질적인 가이드를 제공합니다. DNA의 짧은 세그먼트를 스트레칭의 주요 장애물은 기존의 광 핀셋은 일반적으로 directio에 힘을 적용하도록 설계되어 있습니다N 무대 5,6에 측면 (그림을 참조하십시오. 1). 이 구조에서, 구슬과 coverslip 사이의 각도는, 그 DNA가 묶여있다하기 위해, submicron의 길이 DNA 매우 가파른됩니다. 축 위치는 현재 확장 가까이 coverslip에 microsphere를 끌 때문에, steric 효과가 향상되고 도전이 될 수있는 차지, 그리고해야합니다. 또한, 마이크로의 비대칭의 결과로, 측면 확장 생성합니다 확장 중에 반응성 힘 변화의 방향부터 광학 트랩 내에 인해 microsphere의 회전에 토크의 수준을 변화. 스트레칭 submicron의 DNA에 대한 대체 방법은 자신의 고유 한 장애물에 반대하는 실행합니다. 예를 들어, 듀얼 빔 광학 트랩이되는 두 트랩 사이 마이크로 사이의 빛의 분산에서 포인트 간섭 효과 큰 문제를 일으킬하기 시작, 파장 주위의 DNA에 이르는으로 제한됩니다. 트랩 중 하나를 교체micropipette으로 가능성이 가장 높은 유사한 문제로 고통 것입니다. 사람이 직접 D​​NA을 향상시킬 수있는 축 잠재력을 사용할 수 있지만, 적극적인 피드백 체계는 일정한 힘이의 대역폭은 특히 낮은 힘에서 매우 제한됩니다를 적용 할 필요됩니다. 우리는 직접 일정한 힘을 축 광학 핀셋 7,8를 사용하여 coverslip에서 떨어져 DNA를 당겨 이러한 근본적인 문제를 회피. 이 문제는 광학 힘이 일정한 힘있는이 레이저 파워를 조정하여 조정 될 수 있습니다 광학 가능성 선형 지역의 구슬을 수집에 의해 달성된다. 선형 영역 내에 트래핑은 또한 축 방향으로 약 350 나노 미터에 대한 확장 DNA에 모든 광학 힘 - 클램프 역할을합니다. coverslip에 붙어 참조 microsphere가 동일한 위치와 초점에 남아 있도록 동시에 정교하게 무대의 위치를​​ 조정하여 열 및 기계적 드리프트 보상거의 무한 관찰 기간 동안 llowing.

우리는 짧은 DNA 분자의 기계적 성질을 탐험 할 수있는 일정한 힘을 축 광 핀셋의 사용을 보여줍니다. 축 방향으로 DNA를 스트레칭함으로써, 우리는 우리 ~ 100 nm의 짧은으로 DNA 분자를 연구 할 수 있습니다 steric hindrances 및 종래의 측면 조작하여 발생하는 유물을 최소화합니다.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

컨투어 길이(contour length)가 1킬로베이스(kb) 미만인 DNA를 신장시키기 위한 단일 분자 기술은 실험적인 어려움이 많습니다. 하지만 많은...

이 절차의 전반적인 목표는 정밀하게 교정된 일정한 광학력을 이용하여 길이가 100 nanometers인 짧은 DNA 분자를 조작하는 것입니다. 이는 DNA의 한쪽 끝을 커버 슬립에, 다른 쪽 끝을 폴리스티렌 미세구체에 결합함으로써 수행됩니다. 그다음, 광학 집게(optical tweezers)를 정렬하고 교정합니다.그 다음, 마이크로구슬에 작용하는 구배력(gradient forces)과 산란력(scattering forces)의 조합을 통해 DNA를 표면으로부터 늘려줍니다. 마지막으로, 비드를 퍼텐셜의 선형 영역에 트랩핑하여 DNA를 연장시킵니다. 이 프로토콜은 DNA의 기계적 특성과 DNA-단백질 결합 역학을 연구하는 데 사용되어 왔으며, 짧은 DNA 구조체의 탄성에서 경계 조건의 중요성을 규명하는 데에도 유용하였습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인들은 정적 힘 광학 집게(constant force optical tweezers)의 정렬과 보정 과정이 어렵고 복잡하기 때문에 어려움을 겪게 됩니다. 광학 집게에는 1064 nanometer 레이저 빔이 포함되며, 이는 서로 직교하는 편광 빔 두 개로 분할됩니다. 하나는 생체 분자를 조작하는 데 사용되고, 다른 하나는 보정 목적으로 사용됩니다.조작 빔의 강도는 AO 광학 편향기 또는 OD로 제어됩니다. 그 후 빔들은 다른 편광 빔 분할기를 통해 다시 결합됩니다. 빔들은 plan APO 60 x 1.4 오일 침수 현미경 대물렌즈에 의해 시료 셀 위로 정밀하게 집속됩니다. 이 트위저 설정은 콘덴서에 의해 시료 챔버로 집속되는 할로겐 램프 조명을 제공하는 자체 제작 명시야 현미경과 결합되어 있습니다.명시야 이미지는 다이크로익 미러(dichroic mirror)에 의해 레이저 광과 분리된 후 두 대의 CCD 카메라에 이미지화됩니다. 하나의 CCD는 데이터 획득의 주된 수단으로 작동하며, 정확한 샘플링 속도를 구현하기 위해 소프트웨어적으로 트리거됩니다. 다른 CCD는 고정된 하나의 기준 미세구체를 이미지화하는 데 사용되며, 이 구체의 위치는 현미경의 표동(drift)을 보정하기 위한 피드백 제어 시스템의 역할을 합니다.XY 스테이지를 이용하여 대물렌즈에 대해 샘플의 위치를 대략적으로 잡은 후, 내장된 3차원 piso 스테이지를 통해 정밀하게 위치를 조정할 수 있습니다. 비드 크기를 보정하기 위해 전방 산란광 및 투과 레이저광을 명시야 콘덴서로 수집하여 광검출기에 집중시킵니다. 인산염 완충 식염수에 희석된 직경 800 nanometer의 폴리스티렌 미세구체 분산액을 샘플 챔버에 로딩합니다. 10분에서 15분 동안 그대로 둔 다음, 버퍼로 가볍게 세척합니다.과잉 마이크로스피어를 제거하기 위해, 커버 글라스에 무작위로 부착된 마이크로스피어를 찾고 마이크로스피어가 초점보다 약 1 µm 아래에 위치할 때까지 시료 챔버의 높이를 조정합니다. LabVIEW를 사용하여 이미지의 겉보기 크기를 측정하기 위한 디포커스(defocused) 이미지를 생성하려면, 먼저 기하학적 패턴 매칭 기능을 사용하여 마이크로스피어의 중심을 찾습니다. 그다음, 360도를 평균하여 마이크로스피어의 방사형 강도 프로파일을 생성합니다.각 단면의 중심을 기준으로, 각 명시야 이미지에서 흰색 링에 해당하는 방사형 프로파일을 2차 함수로 피팅합니다. 밝기 피크를 찾고, 이 피크와 중심 사이의 거리를 보정된 pico 스테이지를 사용하여 비드의 겉보기 크기의 척도로 활용할 수 있습니다. 미세구체의 축 방향 위치를 점진적으로 증가시키며 각 위치에서 CCD 카메라로 이미지를 획득합니다. 각 연속 이미지에 대해 이미지 분석을 반복하여 미세구체의 겉보기 크기와 축 방향 위치 사이의 상관관계를 분석합니다.이 방법을 통해 얻은 축 방향 분해능은 약 1.4 nanometers입니다. 조작 빔의 광학 포텐셜을 매핑하려면, 먼저 조작 빔을 끈 상태에서 조작 빔과 보정 빔을 공선 정렬하십시오. 보정 빔의 훨씬 더 강력한 트랩 내에 자유 마이크로구체를 가두십시오. 이제 조작 빔을 켭니다.보정 빔보다 훨씬 약하기 때문에 마이크로구체의 축 방향 위치가 약간 변동될 것입니다. 결과적으로 발생하는 축 방향 위치의 변화는 이미 설명한 대로 디포커스 명시야(defocused bright field) 이미지에서 측정할 수 있습니다. 축 방향 초점을 이동시키고 이를 반복하여, 보정 빔 초점의 축 방향 위치에 따른 변위 delta X를 그래프로 나타내십시오.마이크로구체의 변위가 가장 큰 지점에 해당하는 축 방향 위치가 광학 트랩 선형 영역의 중심을 결정합니다. DNA 샘플을 신장시키려면 표면에 결합된 DNA 분자가 포함된 챔버를 장착하고, 명시야 이미지를 관찰하면서 망원경을 조정하여 조작 빔의 초점을 신장되지 않은 마이크로구체보다 약간 위에 둡니다. 그 다음, 마이크로구체 중 하나가 트랩될 때까지 스테이지의 위치를 조정합니다. 마이크로구체를 광학 트랩 XY 평면의 중심에 대략적으로 위치시키고, LabVIEW에서 일련의 사각파를 생성하여 A OD로 보내 레이저 빔을 반복적으로 켜고 끕니다.트랩을 반복적으로 켜고 끌 때 미세구(microsphere)를 관찰하십시오. 그리고 X 및 y 방향으로 미세구의 위치를 반복적으로 조정하면서 레이저가 미세구의 운동에 특정 선호 방향을 유도하는지 확인하십시오. 피조(piso) 스테이지를 제어하면 미세구의 무작위 운동은 X-y 평면에서 등방성(isotropic)이 되어야 하며, 레이저가 켜져 있을 때는 눈에 띄게 제한될 것입니다.다음으로, Z 방향으로 비드를 정렬합니다. 다시 한번 레이저 빔을 단속적으로 조사합니다. 이때 마이크로구체의 축 방향 변위(axial displacement)를 실시간으로 동시에 측정합니다.DNA 램프를 신장시켰을 때 Z 변위가 최대가 되는 지점인 선형 영역 내에 스테이지를 중심시키고, A OD에 0V에서 0.5V까지 0.025V 단계로 전압 신호를 보내 레이저 강도를 조절합니다. 초당 100프레임으로 400프레임을 기록하고 이를 평균하여 축 방향 변위를 구합니다. 마지막으로, 힘-신장 곡선을 그리고 이를 수정된 웜-라이크 체인(worm-like chain) 모델에 맞춥니다.여기에 DNA의 짧은 구간인 1, 298 bp 및 247 bp 길이의 2D NA 서열에 대한 힘-신장 곡선(force extension curves)이 나타나 있습니다. 일반적인 웜라이크 체인(worm-like chain, WLC) 모델은 이러한 길이 규모에서 유한 크기 효과(finite size effects)와 경계 제약으로 인해 발생하는 제로 힘 신장(zero force extension)을 고려해야 하므로 힘-신장 관계를 완전히 설명하지 못합니다. 따라서 힘-신장 측정값은 수정된 WLC 모델을 사용하여 피팅해야 하며, 보충 자료에 자세히 설명된 바와 같이 유효 지속 길이(effective persistence length)와 제로 힘 신장을 피팅 파라미터로 사용합니다.D-S-D-N-A의 윤곽 길이가 길 경우, 유효 지속 길이는 단순히 공칭 지속 길이인 약 50 nanometers이며, 수정된 WLC 피팅에서 제로 힘 신장(zero force extension)은 무시될 수 있습니다. 개발 후, 유효 지속 길이는 1, 298 base pair DNA의 경우 35 nanometers, 247 base pair DNA의 경우 25 nanometers로 나타났습니다. 이 방법은 조절 단백질 매개 DNA 루프의 형성 및 붕괴 역학 연구를 포함하여, DNA 및 DNA-단백질 복합체에 대한 다양한 나노 기계적 측정의 길을 열어주었습니다.

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연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

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