인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램
2012년 2월 20일
우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.
이 비디오 기사에서는 인간 성인 섬유아세포가 레트로바이러스 벡터를 사용하여 만능 줄기세포를 생성하도록 재프로그래밍됩니다. 먼저, 인간 섬유아세포는 전사 인자를 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 형질주입됩니다. T 3 4, SOX 2, KLF 4 및 cmic.
감염된 섬유아세포는 14일에서 28일 동안 마우스 배아 영양 세포에서 배양됩니다. 이렇게 생성된 배양물은 TRA 180 1 항체로 염색되어 재프로그래밍된 세포의 콜로니를 식별합니다. 그런 다음 양성 콜로니는 확장을 위해 MEF 함유 플레이트로 전달됩니다.
Immuno cyto chemical staining은 다능성 마커의 발현과 만능 줄기 세포주의 확립을 확인합니다. 그런 다음 라인을 추가로 특성화하기 위해 추가 연구를 수행해야 합니다. 일반적으로 체세포 세포 프로그래밍과 인간 유도 만능 줄기 세포 배양을 처음 접하는 개인은 올바른 IPSC 콜로니를 식별하기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 Doctor O Fellow인 Dr.Sula Pollak이 맡을 것입니다. 10cm 플레이트당 약 7-800만 개의 세포 밀도로 Phoenix AM FO 세포를 10밀리리터의 고혈당 DMEM을 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하여 이 절차를 시작합니다. 다음날, T 3 4 SOX, 2 klf, 4 cmic 또는 GFP 유전자 중 하나를 인코딩하는 12 마이크로그램과 L 글루타민이 포함된 총 500 마이크로리터의 무혈청 고포도당 DMEM을 암호화하는 35 마이크로리터 소수의 유전자 6으로 구성된 형질주입 혼합물을 제조한다.
혼합물을 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 피닉스 세포를 형질주입하기 위해 DNA 복합체를 피닉스 세포가 포함된 플레이트에 부드럽게 피펫으로 주입하며, 이는 70-80% 융합되어야 합니다. 6-8시간 후에 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
배지를 흡인하고 항생제가 함유된 8ml의 고혈당 DMEM으로 교체하십시오. 그런 다음 배양 후 12시간 동안 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 피펫을 사용하여 바이러스가 포함된 배지를 흡인하고 수집합니다.
그런 다음 배지를 교체하고 배지가 4번 수집될 때까지 12시간마다 이 프로세스를 반복합니다. 매체를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 모든 배지가 수집되면 모든 부분을 결합한 다음 0.45마이크로미터 튜브 상단 필터를 통해 50ml 원추형 튜브에 붓고 분리된 세포와 파편을 제거합니다.
바이러스 입자가 포함된 여과된 매체는 감염 활동을 잃지 않고 2주 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다. 얼리는 것은 권장하지 않습니다. 형질도입 절차 전날, 성인 인간 섬유아세포의 동결된 재고를 해동하고 6개의 웰 젤라틴 코팅 플레이트의 각 웰당 5번째 세포에 10개의 1배를 첨가합니다.
다음 날 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 T four SOX 2, klf four 및 cmic 바이러스 배지를 각각 3.5 밀리리터씩 결합하고 폴리 브레인을 대조군으로 리터당 6 마이크로 그램의 최종 농도에 첨가합니다. 1ml의 GFP 바이러스 배지, 3ml의 배양액, 배지 및 폴리 브레인을 최종 농도 밀리리터당 6마이크로그램으로 준비합니다. 인간 섬유아세포를 포함하는 플레이트에서 배지를 흡인합니다.
그런 다음 4ml의 혼합 바이러스 배지를 추가하거나 원심분리 후 섭씨 20도에서 1시간 동안 1600G에서 플레이트를 대조군 배지로 원심분리합니다. 약 12시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 바이러스 배지를 섬유아세포 배양 배지로 교체하고 12시간 더 배양합니다.
감염에서 섬유아세포 배지에서 배양까지 이 과정을 마지막 감염 후 두 번 더 반복합니다. DMEM에서 섬유아세포를 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음 GFP 레트로바이러스 배지를 사용한 병렬 형질도입의 감염 효율성을 확인합니다.
다음으로 체세포에서 만능 세포로 재프로그래밍을 시작합니다. 감염된 섬유아세포는 인간 배아 줄기세포 배지 또는 HES 배지 종자 마우스 배아, 섬유아세포 또는 MEF에서 처리된 젤라틴 웰당 10 내지 5번째 세포의 약 2배 밀도로 배양됩니다. 다음날 섬유아세포 성장 배지에 있는 6개의 우물 판.
0.05% tripsin EDTA를 사용하여 감염된 인간 섬유아세포를 분할하고 섬유아세포 성장 배지에서 웰당 약 1.2배의 10배의 밀도로 파종합니다. 다음 날. 재프로그래밍의 초기 7일 동안 배지를 0.5 밀리몰 나트륨 부티레이트를 함유한 HES 배지로 교체합니다.
매체를 매일 교체하십시오. 배지를 부티르산나트륨이 없는 HES 배지로 교체하고 추가로 7-21일 동안 재프로그래밍을 계속합니다. 매일 매체를 교체하십시오.
형질도입된 세포의 형태학적 변화를 확인합니다. 세포의 군집은 형질도입된 섬유아세포를 영양세포로 옮기고 약 10일 후에 나타나기 시작합니다. 재프로그래밍된 세포를 포함하는 콜로니는 이제 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 인간 IPS 세포라고 합니다.
human IPS cell colony는 MEF feeder cell에 도금한 후 14-28일 내에 분리할 준비가 됩니다. 이 단계에서 human IPS cell colony는 MEF 함유 또는 matrigel covered plate로 전달될 수 있습니다. 섬유아세포 성장 배지에서 감마선 MEF 공급세포를 포함하는 human IPS cell colonies Seed 24 well plate를 선택하기 하루 전에 MEF 함유 플레이트로의 이동이 입증되었습니다.
인간 IPS 세포 군집이 선택되는 날에 5%CO2로 섭씨 37도에서 배양합니다. ME Fs에서 섬유아세포 성장 배지를 흡인하고 PBS로 헹구어 FBS의 흔적을 제거합니다. 그 후 0.5 밀리리터의 인간 배아 줄기 세포 또는 10 마이크로몰 암석 억제제 Y 2 7 6 3 2를 함유한 HES 배지를 각 웰에 첨가한 다음, 층류 후드에 장착된 현미경을 사용하여 인간 IPS 세포 콜로니 형성에 대한 재프로그래밍 플레이트를 검사합니다.
필요한 경우 21게이지 바늘로 인간 IPS 세포 군집을 둘러싼 섬유아세포를 제거합니다. 플레이트를 PBS로 헹구고 TRA 180 1 염색 살아 있는 특이적 항체를 함유한 새로운 HES 배지를 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 5%CO2로 인큐베이터로 되돌립니다.
30분 후, 배지를 10마이크로몰 암석 억제제가 보충된 새로운 HES 배지로 교체합니다. 그런 다음 형광 현미경으로 군체를 봅니다. TRA를 81개의 양성 식민지에 1로 표시합니다.
21 게이지 바늘을 사용하여 객관적인 마커를 사용합니다. TRA 180 1 positive human IPS cell colonies를 여러 개의 작은 조각으로 자릅니다. 다음으로, 자동 피펫을 사용하여 인간 IPS 세포 군집의 단편을 ME Fs가 있는 24웰 플레이트의 개별 웰로 이동합니다.
플레이트를 인큐베이터에 넣고 human IPS cell colonies가 24-36시간 동안 부착되도록 하고 매일 배지를 교체합니다. 정확한 HE 유사 형태를 가진 human IPS cell colonies는 21 게이지 니들 플레이트로 절단하여 6-8일마다 human IPS cell colonies를 24웰 플레이트로 처음 이식한 후 48시간 후에 볼 수 있습니다. 배양물을 12웰로 확장한 후 클론 확장 후 6웰 플레이트에서 확장
.그리고 human IPS 세포주를 확립하면 면역화학을 사용하여 다능성 마커 TRA 1, 60, SSEA 4, T 3, 4, SOX 2 및 nanog의 발현을 분석합니다. 상세한 특성화에는 in vitro 및 in vivo가 수반될 수 있습니다. 분화 분석, 핵형 분석, 전이유전자 침묵 메틸화 연구 및 유전자 발현 연구 분석.
레트로바이러스를 함유한 배지를 사용한 효율적인 transduction은 바이러스 transduction의 효능을 결정하기 위한 성공적인 재프로그래밍에 매우 중요합니다. Friedrichs 운동 실조증 환자에서 유래한 인간 성인 섬유아세포는 GFP 레트로바이러스 배지로 두 번 연속 감염된 후 시각화되었으며, 섬유아세포가 바이러스 배지를 사용한 간단한 배양으로 감염되었을 때 세포의 20% 미만이 transduction되었습니다. 그러나, GFP 레트로바이러스 배지를 즉시 첨가한 후 형질주입의 효율이 극적으로 증가하였습니다.
여기서 세포의 80% 이상이 형질도입되어 분리된 인간 IPS 세포 군집의 초기 특성화를 수행합니다. 인간 ES 세포의 특징인 다능성 마커의 발현은 여기에 나타난 바와 같이 면역화학에 의해 평가되었습니다. 고립된 인간 IPS 세포 콜로니는 다능성 마커에 대해 양성이었습니다.
T 3 4 SOX 2 nano SSEA 4 및 TRA 1 60 DNA. 상부 패널에 표시된 DPI를 사용한 Cos 염색은 인간 IPS 세포 집락과 공급세포 모두에서 검출됩니다. 이러한 결과는 이 재프로그래밍 프로토콜을 사용하여 얻은 인간 IPS 세포가 미분화된 인간 만능 줄기세포에 특징적인 적절한 다능성 마커를 발현한다는 것을 보여줍니다.
이 비디오를 시청한 후에는 레트로바이러스 거래를 사용하여 올바른 인간 유도 및 만능 줄기 세포 콜로니를 사용하여 인간 섬유아세포를 만능 줄기 세포로 성공적으로 재프로그래밍하고 HI PC의 초기 특성화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 인간 성인 섬유아세포를 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로 재프로그래밍하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 과정은 주요 전사 인자를 인코딩하는 벡터로 섬유아세포를 전달하고, 생체 염색을 통해 재프로그래밍된 세포를 식별하는 것을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 줄기 세포 생물학
- 세포 재프로그래밍
- 전사 인자 기능
배경
- 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)는 체세포에서 생성될 수 있습니다.
- 레트로바이러스 벡터는 재프로그래밍에서 유전자 전달에 일반적으로 사용됩니다.
- 관련된 주요 전사 인자에는 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-myc가 포함됩니다.
- 생체 염색 기술은 성공적으로 재프로그래밍된 세포를 식별하는 데 도움을 줍니다.
연구 목적
- 인간 섬유아세포로부터 hiPSC를 생성하기 위한 효율적인 프로토콜을 개발합니다.
- 전사 인자 도입을 위해 레트로바이러스 벡터를 활용합니다.
- 특정 항체를 사용하여 재프로그래밍된 세포를 식별합니다.
사용된 방법
- 레트로바이러스 벡터를 사용한 인간 섬유아세포의 전달.
- 마우스 배아 피더 세포 위에서 감염된 섬유아세포의 배양.
- 양성 콜로니를 식별하기 위한 TRA-1-81 항체를 사용한 배양 염색.
- 추가 확장을 위한 플레이트로의 양성 콜로니 이동.
주요 결과
- 섬유아세포를 hiPSC로의 성공적인 재프로그래밍이 이루어졌습니다.
- 염색을 통해 재프로그래밍된 콜로니의 식별이 확인되었습니다.
- 확장된 콜로니는 만능 줄기 세포의 특성을 보였습니다.
- 이 프로토콜은 hiPSC 생성에 있어 효율성을 보여주었습니다.
결론
- 개발된 프로토콜은 인간 체세포 재프로그래밍에 효과적입니다.
- 레트로바이러스 벡터는 필요한 전사 인자를 도입하는 실행 가능한 방법입니다.
- 생체 염색은 재프로그래밍된 세포를 식별하는 신뢰할 수 있는 기술입니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Reprogramming somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) enables disease modeling and target validation in early discovery. This protocol supports mechanistic de-risking by generating patient-specific pluripotent lines for pathway interrogation. Efficient colony isolation and expansion improve predictive confidence in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using patient-derived fibroblasts reprogrammed to pluripotency.
- Operational Value: Provides a renewable source of genetically defined human cells for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through characterization of pluripotency markers and differentiation potential.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized hiPSC lines suitable for assay development and compound screening.
- Operational Value: Enables scalable production of clonal cell lines for reproducible phenotypic readouts.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation using disease-relevant hiPSC models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of target modulation in human cellular contexts prior to in vivo studies.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of on-target effects and pathway modulation in genetically matched systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization by providing scalable, human-relevant cellular models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via reprogrammed patient and control fibroblast-derived hiPSC.
- Screening: Delivers assay-ready clonal colonies with consistent morphology and marker expression for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of pluripotency markers and differentiation outputs to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical work through expansion and characterization of established hiPSC lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating disease-specific cell lines across multiple targets and indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through generation of pluripotent cells with validated marker expression (TRA-1-60, SSEA-4, Oct3/4, Sox2, Nanog).
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined colony selection, isolation, and expansion steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets using human cellular models with defined genetic backgrounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, viral transduction, and immunofluorescence techniques.
- Dependent on retroviral vector production, fibroblast transduction efficiency, and feeder cell maintenance.
- Necessitates standardized protocols for colony picking, passaging, and marker analysis across teams.
- Involves adaptation considerations when applying to different cell types or disease models.
- Limited by the need for careful identification of true pluripotent colonies amid partial reprogramming or fibroblast contamination.
