풀다운 Calmodulin 결합 단백질의

이 절차의 전반적인 목적은 칼슘 의존적 방식으로 Cal Modlin에 결합하는 단백질을 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 관심 단백질을 수집함으로써 수행됩니다. 그다음 단백질 결합을 위해 calmodulin sero beads를 준비합니다.

그 다음, 단백질들을 calmodulin sero speeds와 함께 배양합니다. 마지막으로, 칼슘 의존적 방식으로 결합하는 단백질들을 용출시킵니다. 최종적으로, western blood 분석을 통해 칼슘의 존재 여부에 따라 calmodulin에 결합하는 단백질을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술이 칼럼 크로마토그래피나 면역 침전법과 같은 기존의 다른 방법들에 비해 가지는 주요 장점은 더 적은 양의 단백질과 더 짧은 시간이 소요된다는 점입니다. 이 방법은 칼슘 의존적 방식으로 어떤 단백질이 cow modlin에 결합하는지, 그리고 번역 후 변형이 cow modlin과의 결합에 어떤 영향을 미치는지와 같이 cow modlin 신호 전달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 비드 처리 단계가 필수적이며, 비드의 재현탁 및 회수 과정은 직접 보지 않고는 설명을 이해하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

관심 재조합 단백질을 발현하는 플라스미드가 포함된 바이러스를 통해 균질한 주입 오가노타입 해마 슬라이스를 위한 조직을 준비합니다. 본 예제에서 재조합 단백질은 GFP 태그가 붙은 Neuro Grandin입니다. 바이러스 주입 후 약 12~18시간 동안 조직이 단백질을 발현하도록 하 overnight, 페트리 접시에 1 mL의 해부 버퍼를 추가합니다.

인서트가 포함된 배양 조직을 페트리 접시에 옮기고, 메스를 사용하여 조직이 잠길 수 있도록 인서트에 해부 완충액 2 mL를 추가합니다. 역전된 파스퇴르 피펫으로 인서트 막에서 조직을 조심스럽게 긁어내어 5~10개의 기관 유사 해마 조직 절편을 수집합니다. 부유된 조직을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 샘플을 1500 RCF에서 1분 동안 원심분리합니다. 조직을 해부 완충액과 분리하기 위해 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 이때 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.

사용하는 각 슬라이스에 대해, 팁을 자른 1 mL 피펫을 사용하여 조직을 30 내지 60 µL의 균질화 완충액에 넣은 다음, 페스틀을 사용하여 완전히 균질화한 후 균질물을 원래 튜브로 옮깁니다. 세포 파편을 제거하기 위해 남은 균질물을 1100 RCF에서 10분 동안 원심 분리하고, 펠렛에 의한 오염이 되지 않도록 주의하며 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 상층액의 10%를 분주하여 입력 시료로 사용합니다.

cal sero 비즈를 사용할 준비를 하는 동안 남은 상층액을 얼음 위에 보관하십시오. 이후, 각 풀다운(pull down) 단계에서 표면적을 최대화하고 배양 중 용액과 비즈의 상호작용을 높이기 위해 바닥이 비교적 평평한 2 mL 미세원심분리 튜브에 현탁된 cal Modlin Sero 비즈 400 µL를 피펫으로 옮깁니다. 미세원심분리 튜브를 옆으로 눕혀 굴려 비즈를 적신 다음, 21,000 ×g의 RCF에서 30초 동안 원심분리하십시오.

그리고 흡입을 통해 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 비드를 건드리지 않도록 주의하며, 칼슘 칼모듈린 결합 단백질을 침강시키는 데 사용되는 비드에는 2 mM calcium chloride가 포함된 해당 균질화 버퍼 100 µL로, 또는 apo 칼모듈린 결합 단백질을 침강시키는 데 사용되는 비드에는 알려진 칼슘 킬레이터인 2 mM EDTA가 포함된 해당 균질화 버퍼 100 µL로 비드를 세척합니다.

튜브를 가볍게 쳐서 재현탁합니다. 비드를 부유시킨 후 1500 RCF에서 1분간 원심분리합니다. 풀다운을 위해 단백질을 calmodulin spheros에 결합시키기 위해, 비드가 흐트러지지 않도록 주의하며 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

먼저 SNAT를 두 개의 동일한 부피로 나눕니다. 각 분주액의 조건에 따라, 상층액에 염화 칼슘 또는 EDTA를 최종 농도가 2 mM이 되도록 적절한 양을 첨가합니다. 상층액을 적절한 균질화 완충액이 들어 있는 세척된 비드에 첨가합니다.

튜브를 가볍게 쳐서 혼합합니다. 샘플을 셰이커 위에서 4 °C로 3시간 동안 배양합니다. 결합 효율을 높이기 위해 약 30분마다 비드를 부유시킵니다.

다음으로 샘플을 1500 RC F에서 3분 동안 원심분리합니다. 비결합 단백질 샘플로서 상층액 50 µL를 취하고, 남은 상층액은 흡입하여 조심스럽게 제거한 후 폐기합니다. 이전과 동일하게 적절한 균질화 완충액 100 µL를 사용하여 비드를 3회 세척합니다.

이 절차에서 가장 어려운 단계는 표적 단백질을 효율적으로 용출시키는 것입니다. 성공을 보장하는 최선의 방법은 비드 손실을 최소화할 수 있는 적절한 종류의 튜브를 사용하고, 미리 데워둔 용출 버퍼에 비드를 적절히 재현탁하는 것입니다. 용출 버퍼를 미리 가온하는 것 또한 단백질 용출에 큰 도움이 될 수 있습니다. 비드에 50 µL의 용출 버퍼를 가하여 단백질을 용출합니다.

칼슘이 포함된 완충액에서 균질화 및 결합된 시료는 EDTA가 포함된 완충액에 넣고, EDTA가 포함된 완충액을 사용한 시료는 칼슘이 포함된 완충액에 넣습니다. 비드를 셰이커 위에서 실온으로 30분 동안 배양합니다. 약 5분마다 튜브를 가볍게 두드려 비드를 섞어줍니다.

비드를 1500 RCF에서 3분 동안 원심 분리하고, 흡입을 통해 결합된 단백질 샘플을 위한 50 µL의 SNAT를 조심스럽게 제거하십시오. 이때 비드가 흐트러지지 않도록 주의하십시오. SDS page 및 western blotting을 수행하여 대조군 조건에서 목적 단백질이 양성 대조군으로 식별되는지 확인하십시오.

Prop Pro 단백질은 Cal Modlin과 결합하는 것으로 알려져 있습니다. 이 그림은 내인성 neuro Grandin과 비교하여 GFP TAG Neuro Grandin의 Cal MODLIN 결합력을 테스트한 Cal Modlin 풀다운 분석의 예시를 보여줍니다. 균질한 입력 시료는 내인성 neuro Grandin의 알려진 결합 특성에 따라 예상된 대로, 내인성 neuro grandin 및 칼슘 칼모듈린 의존성 인산화효소 2 외에 GFP neuro Grandin이 발현되었음을 보여줍니다.

GFP 표지된 Neuro Grandin은 칼슘이 없는 상태에서 용출되었으며, 칼슘이 존재하는 상태에서는 결합하지 않았습니다. 반대로, 대조군인 칼슘-칼모듈린 의존성 인산화효소 2(calmodulin dependent kinase two)는 칼슘이 존재하는 상태에서만 용출되었으며, 칼슘이 없을 때는 결합하지 않았습니다. 이는 칼모듈린 비드가 적절하게 작동했으며 EEU가 효율적이었음을 보여줍니다.

가장 중요한 점은, GFP neurogrinin이 내인성 형태와 유사한 방식으로 Apoch Calmodulin에 결합한다는 것이며, 이는 GFP 태그가 재조합 단백질의 기능을 변화시키지 않았음을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 SDS page 및 Western blot 분석을 제외한 모든 과정을 적절히 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 칼슘 농도의 작은 변화만으로도 실험 전체가 실패할 수 있으므로 모든 시료와 튜브에 해당 조건에 맞는 라벨을 부착하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 특정 단백질이 칼슘 의존적 방식으로 CAL 모듈에 결합하는 능력을 효율적으로 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

관심 단백질을 수집하고, 적절하게 준비된 co modulant SRO speeds와 함께 배양한 후, 결합된 단백질을 용리하여 Western blot 분석으로 테스트합니다.