Name: 풀다운 Calmodulin 결합 단백질의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 학습하세요 칼모듈린 풀다운 분석법을 통해 칼슘 의존적 단백질 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 CaM 결합 단백질을 효율적으로 식별하여 세포 신호 전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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저자는이 프로토콜을 최적화하는 그녀의 도움 티파니 체리 감사드립니다. 이 작품은 국립 노화 연구소 (AG032320)뿐만 아니라 건강한 위스콘신를 발전하여 기금을했다.

homogenate와 프로 시저 시작의 기본 도식 1 그림을 참조하십시오. 세포 추출물의 준비에서 CAM 바인딩된 단백질의 용출에 예상 시간은 약 6~7시간 있습니다. 1. 조직 준비 <ol><li> 재조합 단백질의 관심 (이 예제에서는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 잉)과 조직이 야간 단백질을 표현할 수있는 표현 플라스미드를 포함하는 바이러스 organotypic hippocampal 조각 주사. </li><li> 약 12-18시간 바이러스 주사 후 (바이러스성 표현 시간에 따라), 조직을 수집 준비. 페트리 접시에 1mL 해부 버퍼를 (5 % O 2 2 95 % CO와 기름 10mM 포도당, 4mm짜리 KCl, 26mM NaHCO3, 233mM 자당, 5mM MgCl 2, 1mM CaCl 2, 페놀 - 붉은 0.1 %) 추가합니다. 페트리 접시에 교양 조직 / 삽입을 전송하고 잠수함 조직에 삽입하는 2mL 해부 버퍼를 추가합니다. </li><li> Collec부드럽게 메스를 사용하여 삽입 막의 조직 무료로 근근이 살아가고에 의해 t organotypic hippocampal 조직 (5 사이의 10 슬라이스). 특히 관심의 특정 지역 (예 : CA1)을 제거하면 옵션입니다. 거꾸로 파스퇴르 피펫을 사용하여 1.5mL microcentrifuge 튜브에 정지 조직을 전송합니다. </li><li> 해부 버퍼에서 조직을 별도로 1 분 1500 rcf에서 샘플을 원심 분리기. 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 각 슬라이스가 사용 들면, 균질화 버퍼 (150mM NaCl, 20mM 트리스 산도 7.5, 1mM DTT, 1μg/mL 류펩틴, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL의 pepstatin,, 1 % 트리톤 X의 30-60 μL를 추가 조직 -100) 및 유봉과 함께 철저히 homogenize. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해서는 10 분 1100 rcf에 남아있는 homogenate를 원심 분리기 및 펠렛의 오염을 피할하면서 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거합니다. </li><li> 입력 (예제 1) 예제로 뜨는의 10 %를 가져가라. 3 단계에 사용하기 위해 CAM - 세파 로스 구슬의 준비 기간 동안 얼음에 남아있는 뜨는을 저장합니다. </li></ol> 참고 : 여기에 사용되는 조직이 organotypic hippocampal 슬라이스입니다. 그러나, 하나는 dissociated 뉴런 또는 다른 세포 culturing 시스템을 사용할 수 있습니다. 이러한 경우에는 적절한 방식으로 조직을 수집 후 단계 1.4에서 시작합니다. 2. 풀다운을위한 구슬의 준비 비즈 처리에서는, 그것은 구슬을 구조하고 튜브의 측면에 건조에서 구슬을 방지하여 반응의 효율을 극대화하는 것이 중요합니다. 이렇게하려면, 그것은 바로 원심 분리하기 전에 솔루션은 튜브의 벽에 비즈를 엿먹일 수 있도록, 그들의 측면에 튜브를 회전하는 것이 좋습니다. <ol><li> 각각의 풀다운, 2 ML의 microcentrifuge 관에 정지 Calmodulin - 세파 로스 비즈의 피펫 400 μL 상대적으로 FLA로 들어T - 맨 아래에 귀하의 incubations 동안 비즈와 함께 솔루션의 표면 영역과 상호 작용을 극대화합니다. </li><li> 30 초 동안 21000 rcf에 구슬을 원심 분리기 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거합니다. 구슬을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 구슬을 씻어, 풀다운 칼슘이 구슬을위한 + - CAM 바인딩 단백질과 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 (칼슘 2 알려진 + chelator) 잡아당기는하는 데 사용되는 사람들에게 CaCl 2 2 MM 중 하나를 포함하고있는 각각의 균질 버퍼 100 μL를 추가 ApoCaM 바인딩 단백질. 부드럽게 1 분 1,500 rcf에서 다시 정지 구슬과 원심 분리기에 튜브를 누릅니다. 조심스럽게 구슬을 방해하지 않도록하고, 흡인하여 뜨는을 제거합니다. </li></ol> 참고 : 모든 열망 단계에 대한, 그것이 구슬을 제거하지 않고 솔루션의 제거를 허용하는 훌륭한 오프닝 (예 겔로드 도움말 참조)이있는 피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 3. 단백질의 CAM - 세파 로스 바인딩 <ol><li> 동일한 볼륨을 포함하는 두 가지 조건에 뜨는 분할. 당신의 상태에 따라 각각 2 MM 농도까지 여러분 뜨는에 CaCl 2 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 해당 금액을 추가합니다. </li><li> 해당 균질화 버퍼에 쓸려 구슬 단계 1.7에서 뜨는을 추가합니다. 부드럽게 섞어 튜브를 누릅니다. </li><li> 뿌리에서 3 시간 4 ° C에서 샘플을 품어. 바인딩의 효율성을 높이기 위해 구슬마다 30 분 정도를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 원심 분리기 튜브는 3 분 1500 rcf에서 샘플 및 구슬이 들어있는. </li><li> 언바운드 단백질 (샘플 2) 샘플로 뜨는의 50μL를 가지고 신중하게 열망하고 삭제하여 나머지 뜨는을 제거합니다. </li><li> 각각의 균질화 버퍼 100μL를 사용하여 단계 2.3에서 설명한대로 구슬 세 번 씻으십시오. </li></ol> 4. 용리 <ol><li> 반대 조건 (10mM C를 포함하는 용출 버퍼 (50mM 트리스 - HCL 산도 7.5, 150mM NaCl과)의 50μL 추가비즈로 ACL 2 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 예를 들어, CA 2가 들어있는 버퍼에 균질하고 묶여 있던 샘플 + EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 반대를 포함 용출 버퍼에 eluted 있습니다. </li></ol> 옵션 : 구슬에 추가하면 수율을 향상시킬 수 있습니다 37 용출 버퍼를 온난화 ° C 전에. <ol start="2"><li> 흔드는 30 분 상온에서 구슬과 솔루션을 품어. 부드럽게마다 5 분에 대한 튜브를 눌러서하여 구슬을 섞는다. </li><li> 3 분 1,500 rcf에 구슬을 원심 분리기 조심스럽게 흡인에 의해 구속 단백질 (예제 3) 뜨는의 50μL를 제거합니다. 구슬을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 모든 샘플 (예 : homogenate, 언바운드 및 바운드 단백질뿐만 아니라 그 계속 비즈에 바인딩)에 단백질 로딩 버퍼를 추가합니다. </li></ol> 참고 : 용출을 (특히 비효율적인 용출의 경우) 극대화하려면 해당 용출 버퍼 50μL를 (예 : EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)가 포함된 buf를 추가하는 추가남은 행 단백질과 나머지 바운드 단백질을 제거하는 4.3에서 설명한 단계를 반복을 elute 수 있도록 샘플을 가열하기 전에 비즈까지) CaCl 2 행 구슬로 그다지. 5. SDS - PAGE과 서양 얼룩 SDS - PAGE를 실시하고 긍정적인 제어로 반대 상태로 카메라를 바인딩하는 것으로 알려진 단백질에 대한 관심과 프로브의 단백질에 대해 탐색하여 서양 얼룩을 사용하여 분석할 수 있습니다. 6. 대표 결과 그림 2B는 내생 잉에 비해 GFP - 태그 잉의 캠 바인딩을 테스트 CAM - 풀다운 분석의 예를 보여줍니다. 이렇게하려면, GFP - 잉은 하룻밤 사이에 우리 organotypic hippocampal 조각에 overexpressed되었으며 조직은 균질습니다. homogenate는 칼슘 2 + 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 중 하나의 존재의 CAM - 세파 로스 비즈와 incubated했다. Homogenate 입력 GFP - 잉이 내생 잉 및 CA 2 + / CAM - 의존 키나제 II 이외의 표현이라고 보여줍니다(CaMKII). 마찬가지로 내생 첸 (그림. 2A의 그림)의 알려진 바인딩을 바탕으로 예상, 잉이 칼슘 2 + (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 바인딩 단백질)의 부재 및 CA 2 +의 존재에 언바운드 (그림 2B)에 eluted되었습니다 GFP - 태그 . 반대로, 제어, CaMKII는 오직 칼슘 2 + (행 단백질)의 존재에 eluted되었으며 그 부재 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 언바운드되었습니다. 이것은 CAM 비즈가 제대로 작동다고 표시되고 elutions는 효율적인되었습니다. 가장 중요한 것은, GFP - 잉은 내생 양식과 유사한 방식으로 ApoCaM에 바인딩이 보여주는 GFP 태그 우리 재조합 단백질의 기능을 변경하지 않았 것을 제안. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> CAM 풀다운 분석의 그림 1. 개요 (A) 조직 homogenate는 세포 파편을 제거 아래로 잡아 늘인 것입니다. 뜨는의 10 % 정도는 입력 (1)의 샘플로 가져옵니다. 나머지 뜨는는 다른 동일하게 구성되어 있습니다조건 및 적절한 시약 (CaCl 2 혹은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))는 이러한 조건에서 바인딩을 테스트에 추가됩니다. (CaCl 2 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 중 하나를 포함) 각 뜨는가 각각 준비 CAM ​​- 세파 로스 구슬에로드되고 (B) 바인딩을 허용하는 incubated입니다. 언바운드 단백질이 제거됩니다 (2)와 (C) 행 단백질 (3)은 구속력 반대 조건을 포함한 용출 버퍼 (EB)를 사용하여 구슬에서 eluted 있습니다. 이 세 단백질 샘플의 단백질 합성이 SDS - PAGE와 서양 얼룩 분석을 사용하여 분석하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 풀다운 분석 예에 칼슘 2 그림 2. A.) 도식은 + - 의존 CAM 바인딩과 용출은 단백질의 두 종류있는 칼슘 2에 구속 CAM + 종속 방식의 부여됩니다. Neurogranin (잉)은 구속 APO - CAM과 CaMKII가 + 풍부한 칼슘이에 바인딩 단백질을 나타내는 단백질을 나타냅니다캠. CAM은 homogenate 단백질과 사전 배양하기 위해 dissociated 상태로 표시됩니다. 일단 + chelator, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (2 ㎜), 단백질이 적절하게 CAM에 바인딩할 것입니다 높은 칼슘 2 + 농도 (2 ㎜)의 조건이나 칼슘이의 존재에 incubated. NG없이 칼슘 2 + 현재 거의가로 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 상태에서 카메라를 바인딩하고, 칼슘 2 +의 존재에있는 CAM - 세파 로스 구슬을 eluted 것입니다. CaMKII 그러나, CA이 높은 양의 앞에서 캠에 바인딩 것이 +와 칼슘 2 +가 chelated했습니다 한번 떼어 놓다 것입니다. 예를 들어 캠 풀다운 분석에서 B.) 결과. 이 수치는 CAM - 세파 로스의 예상 최종 결과는 샘플 잉과 CaMKII에 대한 탐지와 풀다운 보여줍니다. 내생 잉과 GFP - 잉 모두 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 존재에 캠에 바인딩 단백질의 차선에 존재한다. 샘플 칼슘 2 +의 존재에 CAM과 incubated 때 아무 잉가 보여주는, 구속하지 않는다는 Ng는 APO 카메라를 바인딩합니다. 우리의 긍정적인 제어, CaMKII는 반면에, 오직 칼슘 2의 존재에 캠에 바인딩 +.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

제공된 프로토콜은 칼슘이 캠 결합 단백질의 + - 의존도를 조사하기 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 활용합니다. 많은 단백질은 칼슘 2 +에 의존 방식으로 카메라를 바인딩합니다. 이러한 상호 작용 카메론 바인딩 단백질과 많은 신호 경로에서 중요한 역할의 수를 주어진 매우 중요 있습니다. 이 프로토콜에서는 CAM - 세파 로스 비즈는 칼슘 2 +의 존재 또는 부재의 조직 homogenate에서 CAM 결합 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 이 간단한 접근 방법의 결과는 단백질이 칼슘 2 +에 의존 방식으로 CAM과 상호 작용하는 수 있는지에 대한 이해를 더욱 것입니다. 이 방법은 구속력을 연구, 칼럼 크로마 토그래피는 그의 CAM - 세파 로스 구슬이 솔루션보다는 매트릭스에서 수정된 단백질에서 일반적으로 사용되는 기법과 다릅니다. 열의없이 프로토콜 적은 시간이 소요되기 때문에 N...

<table border="1"><tr><td> 제품 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 노트 </td></tr><tr><td> Calmodulin - 세파 로스 비즈 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CamKII 알파 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> 겔로드 Pipet 도움말 </td><td> 어부 </td><td> 02-707-138 </td><td> supernatants의 흡인에 사용 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge 튜브 (2.0 ML) </td><td> 어부 </td><td> 05-408-146 </td><td> calmodulin - 세파 로스 비즈를 포함한 모든 단계에 사용 </td></tr></table>

풀다운 calmodulin 결합 단백질의

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

칼슘 (칼슘 2 +)은 다양한 메커니즘을 통해 세포 기능을 조절에 중요한 이온입니다. 대부분 칼슘 2는 + 신호는 calmodulin (CAM) 1,2로 알려진 칼슘 결합 단백질을 통해 중재 수 있습니다. 캠은 apoptosis, 신진 대사, 부드러운 근육 수축, 신경 소성, 신경 성장, 염증과 면역 반응을 포함한 거의 모든 세포 공정에서 여러 수준에서 참여합니다. 단백질의 숫자 카메론와의 상호 작용을 통해 이러한 경로를 조절 도움이됩니다. 이러한 상호 작용의 대부분은 칼슘으로서 칼슘 2 + 무료 상태 (ApoCaM) 3 반대 2 + (CA 2 + - CAM)에 바인딩 할 때 분명히 다릅니다 캠의 형태에 따라 달라집니다. 대부분의 대상 단백질이 칼슘 2에 바인딩하는 동안 + - 캠, 특정 단백질에만 ApoCaM에 바인딩. neuromodulin 4 neurogranin (잉) 5, 및 특정 myosins 포함한 IQ 도메인을 통해 어떤 바인딩 캠, <sup&gt; 6. 이러한 단백질은 각각 presynaptic 기능 7, postsynaptic 기능 8, 및 근육 수축 9 중요한 역할을하기 위해 표시되었습니다. 바인딩 및 CA 2의 부재 또는 존재에 카메라를 공개 + 능력들은 함수에서 중요한 것입니다. 반대로, 많은 단백질은 칼슘 2 + 카메라를 바인딩하고 활성화에 대한 구속력이 필요합니다. 예 마이 오신 경쇄 키나제 10, 칼슘 2 + / CAM 의존 kinases (CaMKs) 11 phosphatases (예 : calcineurin) 12, 그리고 직접 및 다운 스트림 효과 14 다양한있다 spectrin 키나제 13가 포함됩니다. 세포 기능에 이러한 단백질의 효과는 종종 칼슘 2 +에 의존 방식으로 CAM에 바인딩 자신의 능력에 따라 달라집니다. 예를 들어, 우리는 다른 변이가이 바인딩을 영향을 미치는지 시냅스 기능에 잉 - CAM 바인딩의 관련성을 테스트합니다. 우리는 GFP - 태그 잉 죄수를 생성칼슘 2 +에 의존 방식으로 카메라를 바인딩하는 잉의 능력을 변경할 것입니다 IQ 도메인에서 특정 돌연변이와 구조체. 이러한 서로 다른 돌연변이 연구는 시냅스 기능 8,15에 관련된 중요한 프로세스에 우리에게 큰 통찰력을 주었다. 그러나, 이러한 연구에서, 그것은 변이된 단백질은 CAM에 대한 기대 변경된 구속력이 있는지 입증하는 것이 필수적입니다. 여기서는 예제로 CaMKII과 잉을 사용하여, CA 2 +의 존재 또는 부재에서 CAM에 바인딩하는 단백질의 기능을 테스트하기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 캠 풀다운 분석이라고 친화도 크로마 토그래피의 한 형태입니다. 그것은 CAM과 +이 바인딩에 대한 칼슘 2의 영향에 바인딩 단백질을 테스트하기 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 사용합니다. 그것은 효율적인 상당히 더 많은 시간을하고 칼럼 크로마 토그래피 및 기타 assays에 상대적으로 적은 단백질을 필요로합니다. 모두, 이것은 + / CAM 신호 및 단백질 거기에 칼슘 2 탐험하는 중요한 도구를 제공합니다CAM과 teract.

Calmodulin (CAM) 풀다운 분석은 다양한 단백질과 CAM의 상호 작용을 조사하기 위해 효과적인 방법입니다. 이 방법은 캠 결합 단백질의 효과적이고 구체적인 분석을 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 사용합니다. 이것은 세포 기능의 CAM 신호를 탐험하기위한 중요한 도구를 제공합니다.

풀다운 Calmodulin 결합 단백질의

칼슘(Ca2+)은 다양한 메커니즘을 통해 세포 기능을 조절하는 데 필수적인 이온입니다. Ca2+ 신호 전달의 상당 부분은 ...을 통해 매개됩니다.

이 절차의 전반적인 목적은 칼슘 의존적 방식으로 Cal Modlin에 결합하는 단백질을 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 관심 단백질을 수집함으로써 수행됩니다. 그다음 단백질 결합을 위해 calmodulin sero beads를 준비합니다.그 다음, 단백질들을 calmodulin sero speeds와 함께 배양합니다. 마지막으로, 칼슘 의존적 방식으로 결합하는 단백질들을 용출시킵니다. 최종적으로, western blood 분석을 통해 칼슘의 존재 여부에 따라 calmodulin에 결합하는 단백질을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술이 칼럼 크로마토그래피나 면역 침전법과 같은 기존의 다른 방법들에 비해 가지는 주요 장점은 더 적은 양의 단백질과 더 짧은 시간이 소요된다는 점입니다. 이 방법은 칼슘 의존적 방식으로 어떤 단백질이 cow modlin에 결합하는지, 그리고 번역 후 변형이 cow modlin과의 결합에 어떤 영향을 미치는지와 같이 cow modlin 신호 전달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 비드 처리 단계가 필수적이며, 비드의 재현탁 및 회수 과정은 직접 보지 않고는 설명을 이해하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.관심 재조합 단백질을 발현하는 플라스미드가 포함된 바이러스를 통해 균질한 주입 오가노타입 해마 슬라이스를 위한 조직을 준비합니다. 본 예제에서 재조합 단백질은 GFP 태그가 붙은 Neuro Grandin입니다. 바이러스 주입 후 약 12~18시간 동안 조직이 단백질을 발현하도록 하 overnight, 페트리 접시에 1 mL의 해부 버퍼를 추가합니다.인서트가 포함된 배양 조직을 페트리 접시에 옮기고, 메스를 사용하여 조직이 잠길 수 있도록 인서트에 해부 완충액 2 mL를 추가합니다. 역전된 파스퇴르 피펫으로 인서트 막에서 조직을 조심스럽게 긁어내어 5~10개의 기관 유사 해마 조직 절편을 수집합니다. 부유된 조직을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.다음으로, 샘플을 1500 RCF에서 1분 동안 원심분리합니다. 조직을 해부 완충액과 분리하기 위해 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 이때 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.사용하는 각 슬라이스에 대해, 팁을 자른 1 mL 피펫을 사용하여 조직을 30 내지 60 µL의 균질화 완충액에 넣은 다음, 페스틀을 사용하여 완전히 균질화한 후 균질물을 원래 튜브로 옮깁니다. 세포 파편을 제거하기 위해 남은 균질물을 1100 RCF에서 10분 동안 원심 분리하고, 펠렛에 의한 오염이 되지 않도록 주의하며 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 상층액의 10%를 분주하여 입력 시료로 사용합니다.cal sero 비즈를 사용할 준비를 하는 동안 남은 상층액을 얼음 위에 보관하십시오. 이후, 각 풀다운(pull down) 단계에서 표면적을 최대화하고 배양 중 용액과 비즈의 상호작용을 높이기 위해 바닥이 비교적 평평한 2 mL 미세원심분리 튜브에 현탁된 cal Modlin Sero 비즈 400 µL를 피펫으로 옮깁니다. 미세원심분리 튜브를 옆으로 눕혀 굴려 비즈를 적신 다음, 21,000 ×g의 RCF에서 30초 동안 원심분리하십시오.그리고 흡입을 통해 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 비드를 건드리지 않도록 주의하며, 칼슘 칼모듈린 결합 단백질을 침강시키는 데 사용되는 비드에는 2 mM calcium chloride가 포함된 해당 균질화 버퍼 100 µL로, 또는 apo 칼모듈린 결합 단백질을 침강시키는 데 사용되는 비드에는 알려진 칼슘 킬레이터인 2 mM EDTA가 포함된 해당 균질화 버퍼 100 µL로 비드를 세척합니다.튜브를 가볍게 쳐서 재현탁합니다. 비드를 부유시킨 후 1500 RCF에서 1분간 원심분리합니다. 풀다운을 위해 단백질을 calmodulin spheros에 결합시키기 위해, 비드가 흐트러지지 않도록 주의하며 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.먼저 SNAT를 두 개의 동일한 부피로 나눕니다. 각 분주액의 조건에 따라, 상층액에 염화 칼슘 또는 EDTA를 최종 농도가 2 mM이 되도록 적절한 양을 첨가합니다. 상층액을 적절한 균질화 완충액이 들어 있는 세척된 비드에 첨가합니다.튜브를 가볍게 쳐서 혼합합니다. 샘플을 셰이커 위에서 4 °C로 3시간 동안 배양합니다. 결합 효율을 높이기 위해 약 30분마다 비드를 부유시킵니다.다음으로 샘플을 1500 RC F에서 3분 동안 원심분리합니다. 비결합 단백질 샘플로서 상층액 50 µL를 취하고, 남은 상층액은 흡입하여 조심스럽게 제거한 후 폐기합니다. 이전과 동일하게 적절한 균질화 완충액 100 µL를 사용하여 비드를 3회 세척합니다.이 절차에서 가장 어려운 단계는 표적 단백질을 효율적으로 용출시키는 것입니다. 성공을 보장하는 최선의 방법은 비드 손실을 최소화할 수 있는 적절한 종류의 튜브를 사용하고, 미리 데워둔 용출 버퍼에 비드를 적절히 재현탁하는 것입니다. 용출 버퍼를 미리 가온하는 것 또한 단백질 용출에 큰 도움이 될 수 있습니다. 비드에 50 µL의 용출 버퍼를 가하여 단백질을 용출합니다.칼슘이 포함된 완충액에서 균질화 및 결합된 시료는 EDTA가 포함된 완충액에 넣고, EDTA가 포함된 완충액을 사용한 시료는 칼슘이 포함된 완충액에 넣습니다. 비드를 셰이커 위에서 실온으로 30분 동안 배양합니다. 약 5분마다 튜브를 가볍게 두드려 비드를 섞어줍니다.비드를 1500 RCF에서 3분 동안 원심 분리하고, 흡입을 통해 결합된 단백질 샘플을 위한 50 µL의 SNAT를 조심스럽게 제거하십시오. 이때 비드가 흐트러지지 않도록 주의하십시오. SDS page 및 western blotting을 수행하여 대조군 조건에서 목적 단백질이 양성 대조군으로 식별되는지 확인하십시오.Prop Pro 단백질은 Cal Modlin과 결합하는 것으로 알려져 있습니다. 이 그림은 내인성 neuro Grandin과 비교하여 GFP TAG Neuro Grandin의 Cal MODLIN 결합력을 테스트한 Cal Modlin 풀다운 분석의 예시를 보여줍니다. 균질한 입력 시료는 내인성 neuro Grandin의 알려진 결합 특성에 따라 예상된 대로, 내인성 neuro grandin 및 칼슘 칼모듈린 의존성 인산화효소 2 외에 GFP neuro Grandin이 발현되었음을 보여줍니다.GFP 표지된 Neuro Grandin은 칼슘이 없는 상태에서 용출되었으며, 칼슘이 존재하는 상태에서는 결합하지 않았습니다. 반대로, 대조군인 칼슘-칼모듈린 의존성 인산화효소 2(calmodulin dependent kinase two)는 칼슘이 존재하는 상태에서만 용출되었으며, 칼슘이 없을 때는 결합하지 않았습니다. 이는 칼모듈린 비드가 적절하게 작동했으며 EEU가 효율적이었음을 보여줍니다.가장 중요한 점은, GFP neurogrinin이 내인성 형태와 유사한 방식으로 Apoch Calmodulin에 결합한다는 것이며, 이는 GFP 태그가 재조합 단백질의 기능을 변화시키지 않았음을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 SDS page 및 Western blot 분석을 제외한 모든 과정을 적절히 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 칼슘 농도의 작은 변화만으로도 실험 전체가 실패할 수 있으므로 모든 시료와 튜브에 해당 조건에 맞는 라벨을 부착하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 특정 단백질이 칼슘 의존적 방식으로 CAL 모듈에 결합하는 능력을 효율적으로 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.관심 단백질을 수집하고, 적절하게 준비된 co modulant SRO speeds와 함께 배양한 후, 결합된 단백질을 용리하여 Western blot 분석으로 테스트합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

endoplasmic reticulum은 단백질 biogenesis과 칼슘 항상성에 중요한 역할을합니다. 우리는 우리 Ca2 + 누출 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘을 특징 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA 중재 유전자 입을 라이브 세포 Ca2 + 이미징을 포함한다.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR), 상피 염화물 채널, 각종 단백질과 상호 작용하고 중요한 세포 과정을 조절하는 것으로보고되었습니다; 그들 가운데 CFTR PDZ 모티프-매개 상호 작용이 잘 문서화되었습니다. 이 프로토콜은 우리가 복잡한 신호 PDZ-의존 CFTR의 macromolecular를 조립하기 위해 개발된 방법을...

PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER +의 적용 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

리간드 분석(DRaCALA)의 차동 적개 모세관 작용은 ORFeome 라이브러리를 사용하여 유기체의 작은 리간 결합 단백질을 식별하는 데 사용될 수 있다.

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

본 프로토콜은 개선된 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하여 단백질 인산화를 정량화하기 위한 샘플 준비 및 데이터 분석을 기술한다.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

여기에서는 일련의 호환 가능한 벡터를 사용하여 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명한 다음 시험관 내에서 조립할 수 없는 단백질 복합체를 연구하기 위한 기존의 풀다운 기술을 설명합니다.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

프로테아제 활성화 수용체(PAR)의 리간드를 식별하는 데 사용되는 내피 세포를 사용한 칼슘 동원 분석을 위한 개선된 프로토콜이 개발되었습니다. 새로운 프로토콜은 총 분석 시간을 90-120분 단축하고 재현 가능한 농도-반응 곡선을 생성합니다.

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader(플레이트 리더를 사용한 칼슘 동원 분석으로 프로테아제 활성화 수용체의 조절인자 특성 분석)

이 비디오에서는, 우리는 폴리 - acrylimide 겔 전기 영동 (PAGE)를 사용하여 단백질의 전기 영동 분리하는 방법을 보여줍니다.

단백질의 전기 영동 분리

전기 방법으로 분리에 따라, 젤의 단백질은 몇 얼룩 방법에 의해 감지하실 수 있습니다. 쿠매시 블루, 실버 스테 이닝, SYPRO 오렌지, SYPRO 루비와 단백질 얼룩이 비디오 시연하고 있습니다.

젤의 단백질 염색법

학습하세요 칼모듈린 풀다운 분석법을 통해 칼슘 의존적 단백질 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 CaM 결합 단백질을 효율적으로 식별하여 세포 신호 전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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