캡슐화된 세포 집계 내에서 추적 Hypoxic 신호

이 절차의 전반적인 목표는 PEG 캡슐화된 세포 응집체에서 저산소증에 대한 세포 반응을 모니터링하는 것입니다. 첫 번째 단계에서는 분산된 세포를 마커 바이러스에 감염시킨 다음 셰이커에서 배양하여 응집체를 형성할 수 있습니다. 다음으로 선형 페그가 기능화되고 PEG DM rimer가 정제됩니다.

그런 다음 세포 응집체를 PEG DM 하이드로겔에 캡슐화합니다. 마지막으로, 하이드로겔은 다양한 산소 조건에서 배양되는 동시에 저산소증 마커 신호에 대해 형광 모니터링됩니다. 궁극적으로, 생존 가능한 캡슐화된 세포 응집체 내에서 저산소증 유도 인자 활성의 위치와 정도는 간단한 형광 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다.

이 방법은 세포 캡슐화 및 세포 기반 치료 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 3D 배양 내에서 저산소증은 어디에서 발생하며 세포 생존 및 기능에 어떤 영향을 미치는가? 이 기술의 의미는 재생 의학 접근 방식 및 당뇨병과 같은 호르몬 결핍 치료로 확장되는데, 이는 응집되고 캡슐화된 조직에서 저산소증의 주요 영향 때문입니다. 저산소증 유도 요인 1 활성은 베타 세포에서 인슐린 분비가 크게 감소하는 것과 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 1차 구멍을 해리하고 가짜 구멍으로 재형성하려는 시도에 동기를 부여합니다.

직경을 줄이는 골재. 우리의 마커는 느슨한 캡슐화 물질 내의 세포 수준에서 응집체를 사용하여 저산소증 유도 인자 활성을 나타낼 수 있습니다. PEG는 유리한 전달 특성, 세포 적합성 및 기능적으로 변형할 수 있는 용이성 때문에 캡슐 재료로 선택되었습니다.

40ml 유리 바이알에 PEG 2g을 넣고 약 308마이크로리터의 필로폰, 아크릴, 무수물을 넣은 후 단단한 플라스틱 캡으로 바이알을 느슨하게 닫습니다. 전자레인지에 넣으면 표준 가정용 전자레인지에서 바이알을 센 불로 2분 동안 돌립니다. 그런 다음 내열 장갑을 착용하고 바이알을 완전히 와류에 넣고 용액을 전자레인지에 넣어 5분 더 높은 온도에서 가열합니다.

바이알을 다룰 수 있을 만큼 충분히 식힐 때까지 잠시 기다린 다음 바이알을 휘젓면서 뚜껑을 엽니다. 염화메틸렌을 천천히 혼합하고 용액이 투명하고 균질하게 나타날 때까지 필요에 따라 샘플을 와류로 가열합니다. 다음으로, 200ml의 교반된 차가운 다틸 에테르에 용액을 적가하여 PEG dm을 침전시킵니다.

그런 다음 진공 여과로 PEG DM을 수집하고 건조시킵니다. PEG DM이 건조되면 약 100-150ml의 탈이온수에 녹입니다. 그런 다음 투석 후 분자량 컷오프가 1000 Daltons인 투석 튜브에서 5일 동안 탈이온수에 대한 용액을 투석합니다.

용액을 적절한 용기에 웅변하고 밤새 섭씨 영하 80도에서 얼립니다. 그런 다음 용액을 4일 동안 동결건조하여 정제된 백색 PEG DM 분말을 생성하여 처리된 배양 플라스크 표면에서 세포를 방출합니다. 먼저 배지를 흡인하고 세포를 37도 CEL 칼슘, 마그네슘이 없는 HBSS로 헹구고 HBSS를 흡인합니다.

이제 2 밀리리터의 섭씨 37도 트립과 EDTA 용액을 추가하고 세포가 섭씨 37도에서 3 분 동안 배양하도록합니다. 그런 다음 플라스크 측면을 단단히 항아리하여 섭씨 37도의 8밀리리터에서 플라스크 중간의 세포를 두드리고 세포 현탁액을 위아래로 격렬하게 피펫팅합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하세요.

세포 용액을 멸균 15ml 원심분리기 튜브로 옮긴 후 혈구 분석기로 세포를 계수하여 감염될 총 세포 수를 확인합니다. 400, 6개의 우물 현탁액 배양판의 우물로 잘 당 000개의 세포를 달성하기 위하여 필요한 양의 세포 현탁액을 추가하고, 1.8 밀리리터 마이크로 분리기 관으로 감염될 세포의 우물 당 HBSS의 50 마이크로리터를 분취하십시오. 다음으로, 준비된 HBSS에 적절한 양의 바이러스 현탁액을 조심스럽게 피펫으로 주입합니다.

이제 원하는 MOI를 얻기 위해 각 웰에 적절한 부피의 희석된 바이러스를 추가한 다음 각 웰에 매체를 추가하여 총 부피를 최대 1.7밀리리터까지 가져옵니다. 마지막으로, 플레이트를 궤도 셰이커에 놓습니다.인큐베이터 내부에서 셰이커를 약 100RPM으로 낮게 설정하여 배지가 웰 주위를 부드럽게 씻고 세포가 24-36시간 동안 응집되도록 합니다. 먼저 1밀리리터 플라스틱 주사기에서 테이퍼 팁을 잘라 열린 상태로 랙에 넣어 하이드로겔이 형성될 용기를 만듭니다.

다음으로, 20마이크로리터의 광 활성 PEG DM 용액을 주사기의 열린 끝 부분을 플런저에 피펫팅하여 볼륨이 전체 플런저 표면을 덮도록 합니다. 평평한 유체 표면을 얻기 위해 플런저를 조금씩 조정합니다. 이제 피펫을 랙에 다시 놓고 하이드로겔 가교를 허용하기 위해 약 8분 동안 UV 램프 아래에 랙을 배치합니다.

이 시간 동안 원하는 수의 세포와 응집체를 포함하는 피펫 부피를 1.8ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 튜브를 덮고 세포와 응집체를 130gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 마이크로 피펫터를 사용하여 튜브 끝의 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

배지 헤드가 펠릿에 접근하면 더 미세한 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 세포 응집체를 겔 전구체 용액 전체에 고르게 분산시키면서 완전히 캡슐화되도록 합니다. 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 이 단계를 수행할 때 펠릿을 부드럽게 재샌딩하고 옮기도록 주의하십시오.

이제 세포 펠릿을 광 활성 PEG DM 용액 20마이크로리터에 부드럽게 재현탁합니다. 입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 가교 하이드로겔 부분 위에 있는 주사기에 세포 현탁액을 추가하고 주사기를 추가로 8분 동안 자외선에 노출시켜 하이드로겔 구조를 완료합니다. 완료되면 세포가 원통형 하이드로겔 내에 완전히 캡슐화되어야 합니다.

마지막으로, 24웰 플레이트의 한 웰에 HBSS 1밀리리터를 추가하고 다른 웰에 1밀리리터의 매체를 추가합니다. 그런 다음 주사기에서 하이드로겔을 HBSS로 배출하여 겔을 잠시 세척합니다. 겔을 배지로 옮기고 원하는 조건에서 플레이트를 배양합니다.

배양 중 어느 시점에서든 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하여 저산소 신호 전달 장소인 24웰 플레이트가 현미경 스테이지에 도달하고 대물렌즈 아래의 하이드로겔로 웰의 중심을 잡는 것을 추적할 수 있습니다. 신호는 개별 신호 세포를 식별할 수 있을 만큼 충분히 특이적이지만, 분해능은 세포 내 신호 국소화를 결정하기에 부적절할 수 있습니다. 신호 세포에서 신호는 일반적으로 세포질 전체에서 균일하게 관찰됩니다.

이 그림은 겔 셀 내의 PEG 하이드로겔에 캡슐화된 밍크스 응집체의 대표적인 예를 보여줍니다. 응집체는 매트릭스에 완전히 둘러싸여 있어야 하며 여기에서 볼 수 있듯이 더 나은 영양분 수송을 허용하기 위해 균질하게 분포되어야 합니다. 교차 결합 젤이 반응이 수행된 용기의 모양을 취하는 동안 어떻게 고체인지 주목하십시오.

이 그림에서는 PEG DM 하이드로겔에 있는 최소 6개의 세포가 응집된 대표적인 형광 저산소증 신호전달을 보여주며, 세포를 캡슐화한 다음 44시간 동안 20% 산소에서 배양합니다. 왼쪽 그림과 같이 세포는 캡슐화된 후 2% 산소에서 44시간 동안 배양되는 동안 저산소증 신호를 표시하지 않습니다. 오른쪽 디스플레이에서 볼 수 있듯이 명확한 유비쿼터스 신호 저산소증은 다른 세포 유형에서도 추적할 수 있습니다.

이 그림은 캡슐화된 중간엽 줄기세포 응집체에서 대표적인 저산소 신호를 보여줍니다. 가장 왼쪽 그림에서 볼 수 있듯이 형광 신호는 2%산소에서 12시간이 지나면 감지되지 않으며 중앙 그림에서 볼 수 있듯이 24시간 후에 2%산소가 더 뚜렷합니다. 그리고 마지막으로, 오른쪽에서 볼 수 있듯이 96시간 경과 후 2%산소가 많이 발현됩니다.

Eliza, 분비 단백질 분석 및 세포 생존율 분석과 같은 다른 방법은 저산소 신호전달과 세포 표현형을 연관시키기 위해 수행할 수 있습니다. 이러한 개발을 통해 이 기술은 조직 공학 및 세포 기반 치료 전달 분야의 연구자들이 골격 및 캡슐화 재료 내에서 세포의 생존 기능과 분화를 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다.