캡슐화된 세포 집계 내에서 추적 Hypoxic 신호

본 절차의 전반적인 목표는 PEG로 캡슐화된 세포 응집체에서 저산소증에 대한 세포 반응을 모니터링하는 것입니다. 첫 번째 단계에서는 분산된 세포를 마커 바이러스로 감염시킨 후, 쉐이커 상에서 배양하여 응집체가 형성되도록 합니다. 다음으로 선형 PEG를 기능화하고 PEG DM 프라이머를 정제합니다.

그 다음으로 세포 응집체를 PEG DM 하이드로젤로 캡슐화합니다. 마지막으로, 하이드로젤을 다양한 산소 조건에서 배양하면서 저산소증 마커 신호를 형광으로 모니터링합니다. 결과적으로, 캡슐화된 생존 세포 응집체 내에서 저산소 유도 인자 활성의 위치와 정도를 단순 형광 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다.

이 방법은 3D 배양 내에서 저산소증이 어디에서 발생하는지, 그리고 그것이 세포 생존과 기능에 어떤 영향을 미치는지와 같이 세포 캡슐화 및 세포 기반 치료제 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 응집 및 캡슐화된 조직에서 저산소증이 미치는 영향이 매우 크기 때문에, 이 기술의 함의는 재생 의학 접근법과 제1형 당뇨병과 같은 호르몬 결핍 치료로 확장됩니다. 저산소 유도 인자 1(Hypoxia inducible factor one)의 활성은 베타 세포의 인슐린 분비 감소와 밀접한 상관관계가 있음이 밝혀졌으며, 이는 일차 췌도(islets)를 분리하여 유사 췌도(pseudo islets)로 재구성하려는 시도의 동기가 되었습니다.

응집체의 직경을 줄였습니다. 당사의 마커는 느슨해진 캡슐화 물질 내의 세포 수준 응집체에서 저산소 유도 인자 활성을 나타낼 수 있습니다. PEG는 유리한 전달 특성, 세포 호환성 및 기능적 수정의 용이성으로 인해 캡슐 재료로 선택되었습니다.

40 mL 유리 바이알에 PEG 2g을 정량하고 메타크릴산 무수물(methacrylic anhydride) 약 308 µL를 넣은 후, 단단한 플라스틱 캡으로 바이알을 느슨하게 닫습니다. 일반 가정용 전자레인지에서 '강' 설정으로 2분 동안 가열합니다. 그 다음, 내열 장갑을 착용한 상태에서 바이알을 충분히 볼텍싱하고, 용액을 '강' 설정으로 5분 더 전자레인지로 가열합니다.

바이알을 손으로 잡을 수 있을 정도로 잠시 식힌 다음, 바이알을 회전시키면서 캡을 엽니다. 메틸렌 클로라이드를 천천히 혼합하고, 용액이 투명하고 균질해 보일 때까지 필요에 따라 샘플을 볼텍싱합니다. 다음으로, PEG dm을 침전시키기 위해 교반 중인 200 milliliters의 차가운 다틸 에테르에 용액을 한 방울씩 첨가합니다.

그런 다음 진공 여과를 통해 PEG DM을 수집하고 건조시킵니다. PEG DM이 건조되면 약 100에서 150 milliliters의 탈이온수에 용해합니다. 그 후 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)가 1000 Daltons인 투석 튜브를 사용하여 이 용액을 탈이온수로 5일 동안 투석합니다.

용액을 적절한 용기에 나누어 담고 -80°C에서 하룻밤 동안 동결시킵니다. 그 후 용액을 4일 동안 동결건조하여 정제된 흰색 PEG DM 분말을 생성해 처리된 배양 플라스크 표면에서 세포를 분리합니다. 먼저, 배지를 흡입하여 제거하고, 37°C의 칼슘 및 마그네슘이 제거된 HBSS로 세포를 헹군 다음 HBSS를 흡입하여 제거합니다.

이제 37 °C의 trypsin-EDTA 용액 2 mL를 넣고, 세포를 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 그 후 플라스크 측면을 세게 쳐서 세포가 떨어지게 한 다음, 37 °C의 배지 8 mL를 플라스크에 넣고 세포 현탁액을 파이펫으로 격렬하게 상하로 혼합합니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

세포 용액을 멸균된 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하여 감염시킬 총 세포 수를 결정합니다. 6-웰 현탁 배양 플레이트의 각 웰에 웰당 400,000개의 세포가 되도록 필요한 부피의 세포 현탁액을 넣습니다. 감염시킬 세포가 담긴 각 웰에서 50 µL의 HBSS를 1.8 mL 마이크로 원심분리 튜브로 분취합니다. 그다음, 준비된 HBSS에 적절한 양의 바이러스 현탁액을 조심스럽게 피펫팅하여 넣습니다.

이제 원하는 MOI를 달성하기 위해 희석된 바이러스를 각 웰에 적절한 부피만큼 첨가하고, 이어서 배지를 추가하여 총 부피를 1.7 milliliters로 맞춥니다. 마지막으로, 플레이트를 인큐베이터 내부의 오비탈 쉐이커에 넣고, 배지가 웰 주위로 부드럽게 씻겨 내려갈 수 있도록 쉐이커를 약 100 RPM의 낮은 설정으로 맞춘 뒤 24에서 36시간 동안 세포가 응집되도록 둡니다. 먼저 1 milliliter 플라스틱 주사기의 끝부분(tapered tip)을 잘라내고, 열린 끝이 위를 향하도록 랙에 세워 하이드로겔이 형성될 용기를 만듭니다.

다음으로, 광활성 PEG DM 용액 20 µL를 시린지의 개방단 플런저 위에 분주하고, 용액이 플런저 표면 전체를 덮도록 합니다. 플런저를 조금씩 조정하여 액체 표면이 평평해지도록 맞춥니다. 이제 피펫을 다시 랙에 꽂고, 하이드로젤 가교 결합이 일어날 수 있도록 랙을 UV 램프 아래에 약 8분 동안 둡니다.

이 시간 동안 원하는 수의 세포와 응집체를 1.8 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 분주합니다. 튜브의 캡을 닫고 세포와 응집체를 130 gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 튜브 끝에 있는 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다.

배지 헤드가 펠렛에 가까워지면, 더 정밀한 10 µL 피펫 팁을 사용하여 세포 응집체가 완전히 캡슐화되도록 겔 전구체 용액 전체에 고르게 분산시킵니다. 이 과정은 본 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 이 단계를 수행할 때 펠렛을 부드럽게 재현탁하여 옮기도록 주의하십시오.

이제, 세포 펠렛을 20 µL의 광활성 PEG DM 용액에 넣어 부드럽게 재현탁합니다. 와이드 마우스 피펫 팁을 사용하여 세포 현탁액을 가교된 하이드로젤 부분 위의 주사기에 넣고, 주사기에 8분 동안 UV 광선을 추가로 조사하여 하이드로젤 구축을 완료합니다. 완료되면 세포가 원통형 하이드로젤 내에 완전히 캡슐화되어야 합니다.

마지막으로, 24-웰 플레이트의 한 웰에는 1 mL의 HBSS를, 다른 웰에는 1 mL의 배지를 넣습니다. 그 다음 주사기에서 하이드로겔을 HBSS 내부로 밀어내어 겔을 짧게 세척합니다. 겔을 배지로 옮기고 원하는 조건에서 플레이트를 배양합니다.

배양 과정 중 어느 시점에서든 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미징함으로써 저산소 신호 전달의 시작을 추적할 수 있습니다. 24웰 플레이트를 현미경 스테이지 위에 놓고, 하이드로젤이 포함된 웰을 대물렌즈 중앙에 맞춥니다. 신호는 개별 신호 전달 세포를 식별할 수 있을 만큼 충분히 특이적이지만, 세포 내 신호 국소화를 결정하기에는 해상도가 부족할 수 있습니다. 신호 전달 세포에서 신호는 일반적으로 세포질 전체에서 균일하게 관찰됩니다.

이 그림은 젤 셀 내의 PEG 하이드로젤에 캡슐화된 minx 응집체의 대표적인 예시를 보여줍니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 영양분 수송이 원활하게 이루어지도록 응집체는 매트릭스 내에 완전히 둘러싸여 있으며 균일하게 분포되어 있어야 합니다. 가교 젤이 반응이 수행된 용기의 모양을 따라 전체적으로 고체 상태임을 확인하십시오.

이 그림은 PEG DM 하이드로젤 내에 응집된 min six 세포의 대표적인 형광 저산소 신호 전달을 보여주며, 세포를 캡슐화한 후 20% oxygen 조건에서 44시간 동안 배양하였습니다. 왼쪽에 표시된 세포들은 저산소 신호를 나타내지 않는 반면, 캡슐화 후 2% oxygen 조건에서 44시간 동안 배양한 오른쪽의 세포들은 명확하고 보편적인 신호를 나타냅니다. 저산소 상태는 다른 세포 유형에서도 추적할 수 있습니다.

이 그림은 캡슐화된 중간엽 줄기세포 응집체에서의 대표적인 저산소 신호 전달을 보여줍니다. 가장 왼쪽 그림에서 볼 수 있듯이, 2% 산소 농도에서 12시간 후에는 형광 신호가 검출되지 않으며, 중앙 그림에서 보는 바와 같이 2% 산소 농도에서 24시간 후에 더 뚜렷하게 나타납니다. 마지막으로, 오른쪽 그림에서 보는 바와 같이 이 절차를 수행한 후 2% 산소 농도에서 96시간 후에 매우 높게 발현됩니다.

저산소 신호 전달과 세포 표현형 간의 상관관계를 분석하기 위해 ELISA, 분비 단백질 분석 및 세포 생존력 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 발전을 통해, 이 기술은 조직 공학 및 세포 기반 치료제 전달 분야의 연구자들이 스캐폴드와 캡슐화 재료 내에서 세포의 생존 기능과 분화를 탐구할 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다.