모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

본 실험 시스템은 특정 단백질이 침습 과정에 기여하는 정도를 규명하는 것을 목표로 합니다. 먼저 관심 있는 형광 단백질을 세포에 레트로바이러스로 형질도입하십시오. 또한 트랜스웰 인서트에 매트리젤 단백질 3D 매트릭스를 형성하고, 적절한 희석 배율로 세포 현탁액을 준비하십시오.

Matrigel transwell 시스템을 사용하여 테스트 약물 또는 처리제에 따른 화학 유인 물질에 대한 세포 이동 반응을 측정하고, 공초점 현미경을 통해 세포 침습을 시각화하고 분석하십시오. 최종적으로, 결과물을 통해 3차원 단백질 매트릭스로의 세포 침습 규모와 방식을 결정할 수 있습니다. 기존의 전통적인 Transwell 침습 분석법과 같은 방법들에 비해 이 기술이 가진 강점은 3차원 단백질 매트릭스로의 세포 침습에 관한 정량적 및 정성적 데이터를 모두 도출할 수 있는 능력에 있습니다.

제 공동 연구자인 Diane Creighton이 10% FBS가 포함된 DMEM에서 레트로바이러스 패키징 세포를 48시간 동안 배양하는 방법을 시연하겠습니다. 제조사의 지침에 따라 레트로바이러스 DNA를 세포에 트랜스펙션하십시오. 24시간 동안 배양한 후, 웰을 배지로 두 번 헹구고 웰당 1.5 milliliters의 10% FBS-DMEM을 첨가한 뒤, 패키징된 Retrovirus를 수집하기 위해 48시간 동안 배양하십시오.

조직 배양 배지를 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 원심분리하여 세포를 가라앉히고 상층액을 깨끗한 튜브에 수집하십시오. 이 레트로바이러스 스톡을 -80 °C에서 보관하십시오. 이제 세포에 레트로바이러스를 형질전환하기 위해, 하룻밤 동안 배양한 배지를 제거하고 Polybrene이 첨가된 레트로바이러스 스톡 1 mL를 추가하십시오.

6시간 동안 배양한 후, 웰에 10%F-B-S-D-M-E-M 2 mL를 첨가하고 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣습니다. 밤새 배지를 보충하고, 24시간 후 적절한 선택 배지를 첨가합니다. 세포가 단층(confluent)을 형성하면 세포를 수확하고, 비형질전환 세포를 대조군으로 하여 형광 분리를 수행합니다. 비형질전환 세포보다 형광 강도가 높은 세포를 수집하여 소분한 뒤, 향후 사용을 위해 -80 °C에서 냉동 보관합니다.

이 방법은 시각화를 위해 형광 단백질의 발현에 의존하며, 개별 세포의 기여도에 대한 통찰력을 얻을 수 있게 합니다. 얼음 위에서 Matrigel을 녹인 후, ice cold PBS로 1:1 희석합니다. 이제 코팅되지 않은 transwell을 24웰 조직 배양 플레이트에 삽입합니다.

그런 다음 희석된 Matrigel 100 µL를 웰에 조심스럽게 피펫팅하고 37 °C에서 응고시킵니다. 그동안 일반 성장 배지에서 형광 표지된 세포 현탁액을 준비합니다. Matrigel이 응고되면 트랜스웰을 뒤집고 필터의 배출면 하단에 세포 현탁액 100 µL를 피펫팅합니다.

24웰 조직 배양 플레이트의 바닥면을 트랜스웰(transwell)에 조심스럽게 덮어 세포 현탁액의 각 방울과 접촉하게 합니다. 세포 부착을 위해 플레이트를 뒤집힌 상태로 4시간 동안 배양합니다. 이제 플레이트를 다시 똑바로 세우고, 각 트랜스웰을 1 mL의 무혈청 배지에 두 번 담가 세척합니다.

그 다음, 약물 또는 처리 시약이 포함된 세 번째 웰에 트랜스웰을 배치합니다. 응고된 matrigel PBS 혼합물 위의 트랜스웰에 화학 유인 물질이 포함된 배지 100 µL를 조심스럽게 피펫으로 분주합니다. Matrigel을 침투하는 비형광 세포를 이미지화하기 위해 37 °C, 5% CO2 조건에서 3~5일 동안 배양합니다.

새로운 24웰 플레이트에 트랜스웰을 배치하고 피펫을 사용하여 각 Matrigel 플러그 상단에 4 µM calcium AM 용액 1 mL를 분주하여, 용액이 측면으로 흘러넘쳐 상단과 하단 모두에서 염색되도록 합니다. 5% CO2 가습 분위기의 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 공초점 현미경으로 이미지를 획득합니다.

이 첫 번째 생활양식 염색 방법은 침습 모드의 시각화를 가능하게 합니다. 각 트랜스웰을 새로운 24웰 플레이트로 옮기고, 4%paraform aldehyde와 0.2%triton X 100 1 mL를 덮은 후 실온에서 30분 동안 배양합니다. 1 mL의 PBS로 3회 세척한 후, 0.01 mg/mL 농도의 RNAse A를 첨가하여 30분간 처리하고, 다시 PBS로 2회 세척하여 시각화합니다.

PBS로 희석한 Propidium iodide를 처리하고 암실 내 실온에서 30분 동안 방치합니다. PBS로 3회 세척합니다. 이 단계에서 Propidium iodide로 염색된 transwell은 암실 내 실온에서 최소 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

두 번째 세포 염색 방법은 고정이 필요하지만, 침습 정도를 더 빠르게 정량화할 수 있습니다. 소량의 잔류 PBS가 포함된 transwell을 대형 커버슬립 위에 올리고, 도립 공초점 현미경의 비침습 20배 대물렌즈를 사용하여 matrigel 플러그 바닥부터 10~15 µm 간격으로 광학 단면을 캡처합니다. 개별 광학 슬라이스를 사용하여 침습 범위를 정량화합니다. 또한, velocity와 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 이러한 광학 슬라이스 시리즈로부터 3차원 객체를 구축합니다. 본 실험에서 세포는 calcium am으로 염색되었습니다.

예상대로, 필터 위로 침습하는 세포의 수는 거리와 함께 감소합니다. 이러한 침습은 정량화할 수 있습니다. 세포 침습의 3차원 재구성을 통해 침습 모드의 시각적 묘사를 제공할 수 있습니다.

형광 단백질의 발현을 통해 세포를 표지했다면, 이 측면도에서 보는 것과 같이 각 색상별 세포의 위치를 3차원 재구성 영상으로 시각화할 수 있습니다. 또한, 재구성된 영상의 단면을 통해 분자적 기전에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는, 표준 방법보다 세포 침습 과정에 대해 더 많은 정보를 얻기 위해 이 세포 침습 분석법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.