Proteomics에서 골격근 성별 동종 이형

이 실험 절차의 전반적인 목표는 골격근의 프로테옴 프로파일 차이에 나타나는 성별 특이성을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수컷 및 암컷 마우스의 상완이두근 조직을 잘게 자르고 완전히 균질화하여 대부분의 단백질을 추출합니다. 그다음, 샘플을 IEF 겔 스트립에 도포하여 등전점에 따라 단백질을 분리하고, 이어 SDS page를 통해 크기에 따라 2차원 분리를 수행합니다. 겔의 염색 및 이미징 후, 수컷과 암컷 근육 샘플의 프로테옴 프로파일을 비교하여 두 성별 간에 발현량 차이가 유의미한 스팟을 절취합니다.

마지막으로, 겔 플러그 내의 단백질을 trypsin으로 소화시킵니다. 생성된 펩타이드를 겔에서 추출하여 나노 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 통해 분석하여 동정합니다. 최종적으로, 2차원 겔 전기영동과 질량 분석 기반의 프로테오믹스를 통해 두 가지 이상의 실험 조건에서 단백질의 차등 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 근육의 성별 특이성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 생리학적 상태에 있는 다른 세포, 조직, 장기 또는 체액에도 적용할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 Smith College 단백질체학 센터의 기술 이사인 Dr. Kalina Diva가 진행합니다. 마우스 골격근을 분리하여 세척하고 잘게 자른 후, 조직 g당 45 µL의 추출 버퍼(이 버퍼 및 기타 모든 버퍼 레시피는 서면 프로토콜을 참조하십시오)를 넣고, 전동 페스틀을 사용하여 4 °C에서 각 15초씩 7회 균질화하며, 각 균질화 단계 사이에 2분 동안 얼음 위에서 냉각합니다.

샘플을 4°C에서 15,800 Gs로 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 회수하고 그 부피를 측정합니다. 단백질을 침전시키기 위해 3배 부피의 얼음을 사용하여 펠릿을 제거합니다.

상층액 부피당 냉장 시약급 아세톤을 첨가합니다. 튜브를 15초 동안 볼텍싱한 후, 15,800 Gs에서 10초 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 상층액을 버리고 전동 페스틀과 폴리프로필렌 교반봉을 사용하여 펠렛과 추출 버퍼를 재현탁하며, 아세톤 3부피를 추가로 첨가하여 단백질을 두 번째로 침전시킵니다.

펠렛과 추출 버퍼를 재현탁한 후, 단백질 농도를 측정하거나 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. 단백질의 등전점 전기영동(isoelectric focusing)을 수행하려면, 준비된 IPG 스트립을 -20 °C 냉동고에서 꺼내 실온에서 10~15분 동안 평형화하십시오. 샘플을 볼텍싱하고, 샘플 재수화 트레이 채널의 뒷쪽 가장자리를 따라 600~800 µg의 단백질을 직선으로 피펫팅하되, 양 끝에 약 1 cm 정도의 간격을 남겨두십시오.

핀셋을 사용하여 IPG 스트립의 플라스틱 커버를 벗겨내되, 스트립의 양 끝부분만 잡고 겔과 접촉하지 않도록 주의하십시오. 스트립에 표시된 양극(+) 끝단을 확인하고 이를 트레이의 왼쪽에 배치하십시오. IPG 스트립의 겔 면이 아래로 향하게 하여 시료 위에 놓으십시오.

기포가 아래에 갇히지 않도록 주의하십시오. 1시간 동안 재수화시킵니다. 스트립 위에 미네랄 오일 2.5 milliliters를 덮어줍니다.

트레이를 뚜껑으로 덮고 하룻밤 동안 재수화시킵니다. 다음 날 실온에서 포커싱 트레이 채널의 양 끝에 종이 심지를 배치하고 각각에 millipore water 10 µL를 적십니다. IPG strip을 제거하고 약 10초 동안 수직으로 세워 유지합니다.

오일을 제거하려면 Kim wipe로 플라스틱 뒷면을 닦아냅니다. IPG 스트립의 겔 면이 아래로 향하게 하고 염기성 끝부분이 왼쪽으로 오도록 배치합니다. 포커싱 트레이에서 스트립을 2.5 milliliters의 미네랄 오일로 덮습니다.

트레이를 protean IEF 셀에 배치하고, 기본 셀 온도 20 °C, 스트립당 최대 전류 50 µA, 재수화 시간 없음으로 설정하여 3단계 프로토콜을 프로그래밍합니다. 프로그램이 완료되면, 스트립의 젤 면이 위로 향하게 하여 11 cm 평형화 트레이로 옮깁니다. 채널에 환원 버퍼 4 mL를 추가하고 가볍게 흔들어주며 스트립을 10분 동안 평형화합니다.

환원 버퍼를 제거하고 채널에 알킬화 버퍼 4 mL를 추가한 후, 10분 동안 흔들어 스트립을 평형화합니다. IPG 스트립을 1X SDS 러닝 버퍼에 짧게 담가 헹굽니다. 다음으로, 11 cm criterion의 백 플레이트 위에 스트립의 겔 면이 위로 향하게 놓습니다.

10.5~14% tris H-C-L-S-D-S polyacrylamide 프리캐스트 겔을 준비하여 SDS 겔과 완전히 밀착되도록 부드럽게 밀어 넣습니다. 두 겔 표면 사이에 기포가 갇히지 않았는지 확인하십시오. IPG strip 위에 1 mL의 용융된 agarose 용액을 덮고 5분 동안 굳힙니다.

그런 다음 단일 웰에 5 µL의 단백질 마커를 로딩합니다. 겔을 SDS 버퍼에서 실온 또는 4 °C로 200 V에서 전기영동합니다. 염색약 전선이 겔 하단에 도달하면, 플라스틱 캐스트에서 겔을 분리하고 Coomassie Brilliant Blue 용액에 넣어 가볍게 흔들어주며 밤새 염색합니다.

탈색 용액 1에서 겔을 3시간씩 2회 흔들어주고, 탈색 용액 2에서 하룻밤 동안 흔들어줍니다. 분석을 위해 겔을 7% acetic acid에 보관하십시오. 겔 이미징 후 겔 간의 스팟 패턴 비교 분석을 수행하고 관심 스팟을 절취한 뒤, 겔 플러그에 탈색 용액 200 microliters를 가해 볼텍싱하고 샘플을 상온에서 30분 동안 흔들어주며 배양합니다.

그런 다음 용액을 조심스럽게 제거하여 버리고 이 과정을 반복합니다. 겔 플러그가 들어 있는 튜브에 갓 제조한 환원 버퍼 30 µL를 첨가하고 60 °C에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 냉각시킵니다.

그 후 버퍼를 제거하여 버립니다. Alkylation 버퍼 30 µL를 첨가하고 샘플을 상온의 암소에서 1시간 동안 인큐베이션한 뒤, alkylation 버퍼를 제거하여 버립니다. 각 튜브에 탈색 용액 200 µL를 첨가하여 겔 플러그를 세척하고, 샘플을 37 °C에서 15분 동안 인큐베이션합니다.

탈염 용액을 제거하여 버리고 세척 과정을 반복합니다. 다음으로, 겔 플러그에 50 µL의 acetonitrile을 첨가하고 상온에서 10분 동안 배양하여 수축 건조시킵니다. 그 후 acetonitrile을 조심스럽게 제거하고 겔 조각들을 회수합니다.

흰색의 작은 크기여야 합니다. 농축기(concentrator)에서 10분 동안 겔 조각들을 건조시킵니다. 활성화된 trypsin 용액 10 µL를 첨가하여 겔 조각들을 팽창시킵니다.

실온에서 15분 동안 배양합니다. 튜브에 소화 버퍼(digestion buffer) 25 µL를 첨가합니다. 샘플을 실온에서 하룻밤 동안 흔들어주며 배양한 후, 10분 동안 초음파 처리(sonication)를 하고 원심 분리하여 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.

펩타이드를 추가로 추출하려면, 플러그에 0.1% formic acid 10 µL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 흔들어주며 배양한 후, 샘플을 10분 동안 초음파 처리합니다. 상층액을 수집하여 이전에 저장해 둔 상층액과 합칩니다. 그 후 단백질을 탈염하여 HPLC 결합 질량 분석법을 위한 준비를 할 수 있습니다. 운동하지 않은 암수 거울상 골격근을 추출하여 2차원 지도로 분리하였습니다.

고해상도 디지털 이미징을 통해 근육 비교 프로테옴의 첫 번째 레벨을 시각화한 결과, 여기에서 보는 바와 같이 각각 약 800개의 단백질 스팟이 검출되었습니다. 수컷 프로테옴 맵을 기준선으로 사용했을 때, 암컷 프로테옴에서 발현량이 변화하는 수많은 스팟이 있음을 알 수 있습니다. 암컷에서 2배 이상 증가한 스팟은 빨간색 원으로, 2배 이상 감소한 스팟은 파란색 원으로 표시하였습니다. 5마리의 마우스를 대상으로 하여 2배 이상 증감하며 통계적으로 유의미한 단백질 스팟의 정체는 액체 크로마토그래피 질량 분석법을 이용한 아미노산 서열 분석을 통해 결정합니다.

이 그래프에서 x축은 운동 전 암컷 생쥐를 나타내며, y축은 단일 운동 0시간 시점 그룹을 나타냅니다. 결과에 따르면 암컷은 당 에너지 대사와 효소가 크게 감소하며, 근육 내의 다른 에너지 공급 체계인 크레아틴 키나아제(creatine kinase) 효소 동형 단백질이 감소하는 것으로 나타납니다. 인간과 동물 모두 휴식 시와 운동 후에 수컷의 혈청 CK 수치가 더 높게 나타나지만, 혈청 CK 수치가 반드시 근원섬유의 양과 상관관계를 가지는 것은 아닙니다.

miren biceps brachii 근육의 CK 세포 풍부도에서 나타나는 이러한 성별 이형성은 새로운 발견이며, 생리학적으로 상이한 혈청 CK 수치에 대한 답이 될 수 있습니다. 본 절차 이후에는 결과 검증을 위해 정량적 면역 블로팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 차등 프로테옴 프로파일링을 위한 시료 준비 및 분리 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.