Name: Proteomics에서 골격근 성별 동종 이형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 배우세요 2차원 겔 전기영동과 질량분석을 이용해 골격근의 성별 특이적 단백질 발현 차이를 분석하는 방법을. 약 800개의 단백질 스팟을 식별하여 생물학적 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 그림 3의 사용 Yutian Gan 주셔서 감사합니다. 스미스 대학 Blakeslee, Wilens 및 홈즈 자금,,이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 0,420,971에 의해 지원되었으며 하워드 휴즈 의학 연구소.

1. 샘플 준비 <ol><li> 자료를 시작으로 생쥐에서 신선한, 플래시 냉동 또는 RNAlater - 처리 조직을 사용합니다. 계속하기 전에 Kimwipe있는 모든 여분의 방부제 멀리 얼룩. </li><li> 근육 주위 힘줄과 근막을 제거하고 조직이 잘 다진 혹은 가루 때까지 감기에 방 (4 ° C)에서 냉장 유리 접시에 2 분 하나의 에지 면도날로 조직을 말하다. 미리 무게 microfuge 튜브의 샘플을 수집하고 조직의 무게를 결정합니다. 를 시작 물질로 조직의 10 개 이상 MG를 사용합니다. </li><li> 상온에서 1 MG 다진 조직 당 45 μL 추출 버퍼를 (8 M 요소, 50 MM DTT, 4 % 챕스, 0.2 % 캐리어 ampholytes 8분의 5, 0.0002 % bromophenol 블루) 추가합니다. 볼륨이 350 μL보다 큰 경우, 처음에 350 μL를 추가하고 (단계 1.4) homogenize 다음 splashing을 최소화하기 위해 버퍼의 나머지 부분을 추가합니다. </li><li> 15초에 대한 조직에게 전동 유봉 (Kontes 사)로 일곱 번 Homogenize4 ° C, 2 분 각 균질 사이에 얼음 냉각과 함께. </li><li> 4 30 분 15,600 XG에서 샘플을 원심 ° C. 뜨는을 저장하고 해당 볼륨을 측정합니다. 세포 파편 펠렛은 삭제됩니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 시약 - 등급 아세톤 (V 비율 3 회 V)와 함께 뜨는의 단백질을 침전. 15 초간 소용돌이 튜브. 알약을 형성하고, Kontes 모터와 폴리 프로필렌 교반 막대 (BioSpec는 생산성)을 추출 버퍼에 resuspend 10 초 동안 15600 XG를위한 원심 분리기 </li><li> 단계 1.6 반복합니다. </li><li> 어느 시료의 단백질 농도 추정을 진행하거나 -20 ° C.에 그들을 저장 </li></ol> 2. 단백질 농도 추정 4.5 MG ML -1을 목표로, 로리 분석 7 BCA 분석 8 (피어스)를 사용합니다. 3. 초점 Isoelectric <ol><li> ReadyStrip IPG 스트립 (11cm, 산도 5-8, 바이오 RAD)를 제거-20 ° C에서하고 10-15 분 RT에서 평형 수 있습니다. </li><li> 소용돌이 샘플 rehydration 트레이에 채널의 뒤쪽 가장자리에서 직선으로 단백질 샘플의 샘플 및 피펫 600-800 μg (총 볼륨 200 μL), 각 끝 부분에 대한 1cm를 떠나. </li><li> 집게를 사용하여 IPG 스트립의 플라스틱 커버 벗기다 - 스트립만을 종료를 처리하고 젤과의 접촉을 피하기 위해 있는지 확인하십시오. 스트립의 기본 끝을 참고 트레이의 왼쪽에서 위치를. 아래 샘플 위에 IPG 스트립 젤 - 측면을 놓고 트래핑 거품을 아래 마십시오. 그 한 시간 rehydrate 수 있습니다. </li><li> 2.5 ML의 미네랄 오일 (BioRad)와 중첩. 뚜껑있는 트레이를 커버하고, 실온에서 하룻밤 rehydrate에 둡니다. </li><li> 초점 트레이 채널의 양쪽 끝에 종이 심지를 장소와 10 μL Millipore의 물을 각각 젖었어. </li><li> 스트립을 IPG 꺼내와 약 10 초 유출 기름 수직 만요. 플라스틱 B를 얼룩Kimwipe로 acking. </li><li> 초점 트레이에 아래와 왼쪽에있는 기본 엔드와 IPG 스트립 겔 쪽 놓습니다. 2.5 ML의 광유와 스트립을 커버. </li><li> 프로 테우스 IEF 셀 (바이오 - RAD) 및 프로그램 20 기본 셀 온도에서 3 단계 프로토콜 (표 1)에 트레이를 놓고 ° C, 50 μA / 스트립없이 rehydration 시간의 최대 전류. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 전압 </td><td> 시간 </td><td> 볼트 - 시간 </td><td> 램프 </td></tr><tr><td> 1 단계 </td><td> 250 </td><td> 20 분 </td><td></td><td> 선형 </td></tr><tr><td> 2 단계 </td><td> 8000 </td><td> 2.5 시간 </td><td></td><td> 선형 </td></tr><tr><td> 3 단계 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 40,000 </td><td> 빠른 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td></td><td> 6.5 시간 </td><td> 40,000 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 스트립을 IPG 11cm를위한 프로 테우스 IEF 세포의 3 단계는 프로토콜입니다. </li><li> 집게를 사용하여 IEF 세포 밖으로 IPG 스트립을 가져가라. Kimwipe로 플라스틱 지원을 얼룩하고 깨끗한 rehydration 트레이에있는 IPG 스트립 겔 측면을 넣으십시오. 당신은 rehydration 트레이를 커버하고에서 플라스틱 포장 및 저장 그것을 포장을 할 수 - 80 ° C 또는 진행합니다. </li></ol> 4. SDS의 polyacrylamide 겔 전기 영동 <ol><li> 11cm의 평균 트레이에 스트립 (겔 사이드까지)를 전송합니다. </li><li> 채널 축소 버퍼 (6 M 요소, 2% SDS, 0.05 M 트리스 / HCL 산도 8.8, 20 % 글리세롤, 2퍼센트 DTT) 4 ML을 추가하고 가벼운 흔들림과 함께 10 분에 대한 스트립을 평형. </li><li> 감소 버퍼를 제거 알킬화 버퍼 (6 M 요소, 2% SDS, 0.05 M 트리스 / HCL 산도 8.8, 20 % 글리세롤, 2.5 % iodoacetamide) 4 ML을 추가하고 가벼운 흔들림과 함께 10 분 동안 스트립을 평형. </li><li> 취소선을 찍기하여 IPG 스트립을 씻어1 X SDS 실행 버퍼에 P를 잠시 (25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.2). </li><li> 11cm의 뒤에 접시에 스트립 겔 측면을 배치 기준을 사전에 캐스트 10.5 % -14 트리스 - HCL SDS의 polyacrylamide 젤 % (생물 RAD)와 그것이 SDS 겔과 완전한 접촉을 만드는 정도 부드럽게 밀어; 방울이 두 겔 표면 사이에서 고민하지 있는지 확인하십시오. </li><li> 용융 아가로 오스 솔루션 1 ML (0.5 % 아가로 오스, 25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, bromophenol 파란색)와 IPG 스트립을 중첩하고 아가로 오스 5 분 동안 응고하자. </li><li> 분자량 표준으로 하나의 우물에 : 단백질 마커의 5 μL 10-225 kDa를 (76,740 USB, P / N)로드합니다. </li><li> 상온에서 200 V 또는 전기를 모니터링하는 bromophenol 청색 색소 전면 마이 그 레이션을 사용하여 차가운 방 (4 ° C)에서 SDS 버퍼 (25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.2)에서 젤을 실행합니다. </li><li> 플라스틱 캐스트에서 젤을 제거하고 Coomassie 브릴리언트 블루에 부드럽게 흔들어에서 하룻밤 얼룩R - 250 (45.5 % 메탄올, 45.5 % dH2O, 9.0 % 초산, 0.25 % Coomassie 브릴리언트 블루 R - 250) 얼룩. </li><li> 삼시간 하룻밤 각각 Destain 2 (5 % 메탄올 90 % DH 2 O 5 % 초산)에 두 번 Destain 한 솔루션 (45.5 %의 메탄올, 45.5 % DH 2 O, 9.0 % 초산)에서 젤 흔들어. 분석을 위해 7% 초산에서 젤 저장합니다. </li></ol> 5. 젤 이미징 및 분석 <ol><li> VersaDoc 이미징 시스템 (BioRad)을 운영하고 수량 하나의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 젤의 이미지를 캡처합니다. 실험의 모든 젤에 대해 균일하게 이미지 영역을 자르기. </li><li> 실험 세트를 만들 수있는 PDQuest 8.0 소프트웨어 프로그램에 자른 이미지를로드합니다. 현장 감지 및 젤류 전체와 일치하는 지점에 대한 매개 변수를 정의하는 실험 설정 마법사를 따르십시오. 필요한 경우 수동으로 결과를 일치하는 지점을 검사하고 수정하십시오. </li><li> TW와 일치하는 단백질의 명소를 검색하는 데 젤류의​​ 양적 및 통계 분석을 수행두 겔 그룹 간의 표현 O 배 이상 통계적으로 의미있는 차이. 관심이 명소 설정된 분석을 만들고 트립신의 소화와 LC - MS - 기반 단백질 식별을위한 EXQuest 명소 커터 (BioRad)를 사용하여 잘라. </li></ol> 6. 인 겔 tryptic 소화 이 단계 수정된 피어스 인 겔 Tryptic 다이제스트 키트 (# 89871X, 피어스)에 대한 프로토콜이 사용됩니다. <ol><li> 겔 플러그에 destaining 용액 200 μL (25 MM의 탄산수 소 암모늄, 50 % acetonitrile)을 추가합니다. 와동 37에서 샘플을 품어 ° 잡고 30 분 C. 조심스럽게 솔루션을 제거하고 폐기. </li><li> 6.1 단계를 반복합니다. </li><li> 신선한 감소 버퍼 (50 MM 트리스 [2 - carboxyethyl] phosphine, 22.5 MM의 탄산수 소 암모늄) 10 분 60 ° C에서 겔 플러그와 부화를 포함하는 튜브합니다. 30 μL를 추가 </li><li> 샘플 냉각 허용, 다음 제거하고 줄이고 버퍼를 폐기하십시오.</li><li> 알킬화 버퍼 (호일 싼 튜브에 사용하기 전에 바로 준비 100 MM의 iodoacetamide, 20 MM의 탄산수 소 암모늄, 30 μL를 추가합니다. 1 시간 동안 실온에서 어둠의 샘플을 품어. </li><li> 제거하고 알킬화 버퍼를 폐기하십시오. 각 튜브 솔루션을 destaining 200 μL를 추가하여 겔 플러그를 씻으십시오. 37 샘플을 품어 ° C를 15 분 동안. </li><li> 제거하고 폐기 destaining 솔루션을하고 세차를 반복합니다. </li><li> 겔 플러그에 acetonitrile 50 μL을 추가하고 그들이 건조 수축 수 있도록 실온에서 10 분 동안 그들을 품어 후 신중하게 acetonitrile를 제거합니다. </li><li> 한번 더 단계 6.8를 반복합니다. 젤 조각은 흰색과 작은 보일 것입니다. </li><li> 겔 조각이 10 분 Centrivap ​​농축기 (Labconco, 모델 EX1245)에 건조하도록 허용합니다. </li><li> 활성화된 트립신 용액 (10 NG / μL 트립신, 25 MM의 탄산수 소 암모늄) 10 μL를 추가하여 겔 조각 그랬군요. 15m에 대한 상온에서 부화inutes. </li><li> 튜브 25 μL 소화 버퍼 (25 MM의 탄산수 소 암모늄)을 추가합니다. 잡고 하룻밤 실온에서 샘플을 품어. </li><li> 10 분 동안 샘플을 Sonicate (브랜슨, 목욕 sonicator 모델 2510)과 새로운 튜브에 뜨는를 제거하기 전에 그들을 아래로 스핀. 뜨는을 저장합니다. </li><li> 추가 펩티드를 추출하려면, 잡고 상온에서 5 분 0.1 % 개미의 산 및 부화 10 μL를 추가합니다. 10 분 동안 샘플을 Sonicate 뜨는를 수집 단계에서 저장한 6.13 뜨는와 결합. </li></ol> 7. 펩타이드 추출물 Microscale 탈염 <ol><li> 제조 업체 지침에 따라 PepClean C - 18 스핀 열 (ThermoFisher)의 도움으로 펩타이드 추출물에 탄산수 소 암모늄 및 기타 소금을 제거합니다. </li><li> Elute 펩티드 두 번 20 μL 70 % acetonitrile과 함께 1 시간 resuspend에 대한 Centrivap ​​농축기에서 원심 분리하여 건조 샘플을 증발MS 분석 10 μL 0.1 %의 개미 산에있는 펩티드. </li></ol> 8. HPLC - 결합 질량 분석법에 의한 단백질 식별 <ol><li> Pepswift 단일 PS - DVB 칼럼 (Dionex)에 0.2 % 개미의 산성과 함께 선형 20-50%의 acetonitrile 기울기를 사용하여 사십분 이상의 고성능 액체 크로마토 그래프 (HPLC)의 펩타이드 혼합물의 분리 5 μL는 Nanospray에 결합 I 끝에 400 NL / 분의 유량에서 이온 트랩 질량 분석기 (LCQ Deca XP 맥스, 써모 피셔 과학)에 소스. </li><li> 1천4백미터 / Z과 역동적인 배제와 CID에 의해 MS2 시퀀싱을 위해 격리하는 3 가장 강렬한 이온 봉우리에 대한 허용 - 400 사이의 펩티드 MS1 신호를 감지합니다. </li><li> 단백질 식별을 위해, 정적 alkylated 시스테인 변경 및 인산화에 대한 동적 수정 (세린, 트레오닌, 티로신), methyla와 Sequest 마우스 참조 데이터베이스 검색 (BioWorks 소프트웨어, 열 피셔 과학)를 통해 펩타이드 결과를 분석기 (히스티딘), 산화 (메티오닌), ADP - ribosylation (아르기닌) 및 N - 터미널 아세틸화. 보수와 일치하는 기준 (예 : 단백질이 Xcorr 대 충전 상태 필터를 통과 최소한 2 펩티드를 포함하는 2 AMU와 1.00 조각을 허용, 설정 펩타이드 공차를 적용합니다 [Z = 1 / X = 1.5, Z = 2 / X = 2.00, Z = 3 / X = 2.50, Z = 4 / X = 3.00]와 P의 확률 &lt;0.05) 5 수동으로 자신감이 단백질 식별을위한 MS 스펙트럼을 검사합니다. </li></ol> 9. 대표 결과 : 남성과 여성 unexercised, murine 골격근은 (팔뚝의 brachii) 추출 및 2 차원지도 5, 근육 비교 프로테옴 (그림 2)의 첫 번째 수준으로 분리되었다. 일단 고해상도 디지털 이미징을 사용하여 시각, 약 800 단백질의 명소가 각 감지되었습니다. 남성 프로테옴지도를 사용하면 기준으로, 그것은 여성의 프로테옴에 풍부하게 변경하는 것이 많은 장소가있다는 것을 분명하다. 현지 농도입니다 단백질 금액의 변경 조치 (그림 3). 이상 (위 또는 아래) 두 배 이상의 변화와있는 단백질 명소의 신원은 통계적으로 의미 (P &lt;0.05) N = 5 마우스와 액체 크로마 토그래피 - 결합 질량 분광법을 사용하여 아미노산 서열 분석에 의해 결정됩니다. 이러한 결과는 여성이 설탕의 에너지 대사 효소와 크레아틴 키나제 효소 (CK) isoforms, 근육에서 다른 에너지 공급 시스템에 풍부한 감소를 보여주는 것을 보여줍니다. 인간과 동물 모두 휴식과 다음 운동 9,10 높은 남성 혈청 CK 수준을 표시하지만, 혈청 CK 수치는 반드시 myofibrillar 장애 11,12의 크기는 서로 관련이 없어요. murine 팔뚝의 brachii 근육에서 CK의 세포 풍부하게이 성별 동종 이형는 소설 finding5이며 생리학 다른 혈청 CK 수준을 응답 수 있습니다. 인물 : g1.jpg "/&gt; 그림 1. 비교 proteomics에 대한 프로토콜의 전체 개략도. , 샘플 분석 및, 단백질 식별 샘플 준비 : 프로토콜은 세 그룹으로 세분화됩니다. 전체 프로토콜 중단하지 않고 수행하는 경우 가장 좋은 결과를 얻고 있지만 프로토콜이 세 그룹의 각 엔드도 합리적인 정지 장소입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 여성 murine 팔뚝의 brachii 단백질의 비교는 남성 팔뚝의 brachii에서 동일한 반점 (녹색 원 O)에 상대적인 명소. 보다 크거나 여성의 두 배 증가와 같은 명소은 빨간색 (O)를 돌고 있으며보다 두 배 같다 감소 이들은 파란색 (O)를 돌고있다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3 젤 명소 강도 분석 :. X - 축, 암사전 운동 (제어, n은 = 5), Y 축, 0 인사 시점 그룹 한판 승부 여성 하나 (n은 = 5). 회귀 라인 : 상관 계수 = 0.919; 기울기 = 0.976; 가로채 = -0.0293. 두 배 - 붉은 선 위에있는 파란색 라인 아래의 명소는 + / 이상을 변경합니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 LC / MS proteomics 방법은 골격 근육 프로테옴의 첫 번째 수준의 빠른 분석을 위해 가장 신뢰할 수 있고 재현성 프로토콜입니다. 그것은 성별 특이성의 합리적인 편법 비교 있습니다. 낮은 풍부 단백질은 근육 샘플 분획화가이를 낮은 풍부한 단백질을 증가, 가능한 한 수축성 단백질의 많은를 제거해야합니다. 원하는 경우 프로테옴 프로파일을 조정하는 것은 다양한 산도 범위 IPG의 스트립 및 대체 비율 기울기 젤과 함께 수행할 수 있습니다. 더 민감한 형광 얼룩이 존재하지만, 우리는 각 연구소가 시스템에서 이러한 얼룩의 선형을 결정하는 것이 좋습니다. 단백질 표현의보다 엄격한 분석을위한 DIGE 시스템 (2 차원 전기 시스템 - 젤에서 GE 헬스케어 생명 과학)를 사용할 수 있습니다 그러나 이것은 방법론에 복잡한 수준을 추가 않는다. 또한, 여기에서 설명하는 프로토콜은 대부분의 애니와 함께 사용할 수 있습니다중복 효소 조각이 이외에 고순도 효소를 사용하여 생성할 수 있습니다 년부터 게놈이뿐만 아니라 어떤 소스에서 단백질의 드 노보 시퀀싱으로 합성되어있는 말 조직은만큼 그것은 2 차원 겔에 해결할 수 있습니다 트립신 수 있습니다. 막과 소수성 단백질을 찾고, 그러나, 우리는 심장, 간, 신장 및 뇌 조직이 프로토콜을 사용하여 좋은 결과가 있었 특히 다른 조직 소스에서 샘플은 추출 방법의 일부 변경을 요구할 수 있습니다. 다른 포스트 translational 수정은 질량 스펙트럼 데이터베이스 검색 기준을 수정하여 감지 수 있습니다. 요컨대, 우리는 프로테옴 프로 파일링 분석을위한 합리적인 세부 초기 프로토콜을 제시했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 유형 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> PepClean C - 18 스핀 열 </td><td> 소모품 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td> PI - 89870 </td><td></td></tr><tr><td> 모놀리식 Pepswift 열 (100um X 5cm) </td><td> 소모품 </td><td> Dionex </td><td> 162,348 </td><td></td></tr><tr><td> 기준 사전 캐스팅 10.5 % -14 % 트리스 - HCL SDS polyacrylamide의 젤 </td><td> 소모품 </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> IPG 스트립을 Readystrip </td><td> 소모품 </td><td> BioRad </td><td> 산도 변화 범위 </td><td></td></tr><tr><td> 초산 </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A465 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> 시약 </td><td> Pharmco </td><td> 329,000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td>garose </td><td> 시약 </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> 오버레이 용액 </td></tr><tr><td> 탄산수 소 암모늄 </td><td> 시약 </td><td> Fluka </td><td> 40,867 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> 바이오 Lyte의 Ampholytes </td><td> 시약 </td><td> BioRad </td><td></td><td> 산도 변화 범위 </td></tr><tr><td> 챕스 </td><td> 시약 </td><td> USB </td><td> 13,361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie 블루 R - 250 </td><td> 시약 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td> 20,278 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 시약 </td><td> USB </td><td> 15,395 </td><td></td></tr><tr><td> 개미의 산 </td><td> 시약 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td> 28,905 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 시약 </td><td> USB </td><td> 16,407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 시약 </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 93,349 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 [2 - carboexyethyl] phosphine </td><td> 시약 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td> 77,720 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 Endoproteinase, TPCK이 대접, MS 등급 </td><td> 시약 </td><td> 찌르다 </td><td> 90,055 </td><td> 수정 </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> 시약 </td><td> USB </td><td> 75,826 </td><td></td></tr><tr><td> 물 </td><td> 시약 </td><td> 장님 &amp; 잭슨 </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Centrivap ​​농축기 </td><td> 티ool </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest 장소 커터 </td><td> 도구 </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP 최대 이온 트랩 질량 분석기 </td><td> 도구 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 전동 유봉 </td><td> 도구 </td><td> Kontes 법인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 감동 폴리 프로필렌 </td><td> 도구 </td><td> BioSpec은 생산성 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 막대 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 프로 테우스 IEF 셀 </td><td> 도구 </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> 도구 </td><td> 브랜 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 서베이 플러스 HPLC 체계 </td><td> 도구 </td><td> ThermoFisher 과학적인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc 이미징 체계 </td><td> 도구 </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proteomics에서 골격근 성별 동종 이형

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

골격 근육의 수축은 주로 총 수축성 단백질의 상대적으로 적은 수의에 의해 결정됩니다, 그러나이 조직은 또한 쓰지 않음으로 저항 운동과 위축에 의한 비대와 같은 환경 요인 1 현저하게 적응이다. 그것은 따라서 스트레스 (열, 국소 빈혈, 중금속 등.) 2,3로 리모델링하고 adaptations을 전시하고있다. , 소위 편심 수축 4 길어 동안 손상이 근육 exerting 강제로 근육에 발생할 수 있습니다. 수축성 단백질은 같은 exertions에 손상 타락한 및 / 또는 resynthesized, 수리해야 할 수 있으며 이러한 기능은 수축성 단백질의 일부​​가 아니지만, 세포의 다른 훨씬 더 풍부한 단백질. 차등을 결정하는 단백질의 하위 집합이 손상이 유형의 개량에 관련된 어떤 확인하려면, 글로벌 프로테옴은 5 운동하기 전에 설정해야 다음 운동 이후 다음단백질 표현함으로써 피해 및 복구 adaptations에 후보 단백질을 선택합니다. 또한, 골격근 대부분의 연구는 종족의 남성에서 실시되고 있으며 따라서 여성 근육의 대표되지 않을 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 남성과 여성의 근육에서 단백질을 추출 reproducibly하고, 고해상도 디지털 이미징 6 다음 2 차원 겔 전기 영동하여 분리하는 방법을 제시. 이것은 표시 명소 (그리고 이후에 확인된 단백질)에 대한 프로토콜을 통계적으로 의미 (P &lt;0.05) 두 배 증가 또는 감소가 나타나거나 제어 상태에서 사라집니다.을 제공합니다 이들은 다음 excised 트립신과 함께 소화와 단백질 식별 (LC / MS / MS) 5 질량 분석기 (LC / MS)로 결합 고압 액체 크로마 토그래피로 구분됩니다. 이 방법론 (그림 1) (간, 뇌, 소리없이 변경 거의 많은 조직에서 사용할 수 있습니다t 등.).

분리 및 골격 근육 표현이 가장 풍부한 단백질의 신원을 확인하는 방법을 똑바로 앞으로 설정할 수 있습니다. 약 800 곳 10 MG 근육에서 2 차원 겔에 분별되며 이것은 성별 특정 단백질 표현의 결정을 허용합니다. 이러한 방법은 대부분의 조직에 상응하는 결과를 제공합니다.

Proteomics에서 골격근 성별 동종 이형

골격근의 전체적인 수축은 비교적 적은 수의 수축 단백질에 의해 주로 결정되지만, 이 조직은 또한 매우...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 골격근의 프로테옴 프로파일 차이에 나타나는 성별 특이성을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수컷 및 암컷 마우스의 상완이두근 조직을 잘게 자르고 완전히 균질화하여 대부분의 단백질을 추출합니다. 그다음, 샘플을 IEF 겔 스트립에 도포하여 등전점에 따라 단백질을 분리하고, 이어 SDS page를 통해 크기에 따라 2차원 분리를 수행합니다. 겔의 염색 및 이미징 후, 수컷과 암컷 근육 샘플의 프로테옴 프로파일을 비교하여 두 성별 간에 발현량 차이가 유의미한 스팟을 절취합니다.마지막으로, 겔 플러그 내의 단백질을 trypsin으로 소화시킵니다. 생성된 펩타이드를 겔에서 추출하여 나노 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 통해 분석하여 동정합니다. 최종적으로, 2차원 겔 전기영동과 질량 분석 기반의 프로테오믹스를 통해 두 가지 이상의 실험 조건에서 단백질의 차등 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 근육의 성별 특이성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 생리학적 상태에 있는 다른 세포, 조직, 장기 또는 체액에도 적용할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 Smith College 단백질체학 센터의 기술 이사인 Dr. Kalina Diva가 진행합니다. 마우스 골격근을 분리하여 세척하고 잘게 자른 후, 조직 g당 45 µL의 추출 버퍼(이 버퍼 및 기타 모든 버퍼 레시피는 서면 프로토콜을 참조하십시오)를 넣고, 전동 페스틀을 사용하여 4 °C에서 각 15초씩 7회 균질화하며, 각 균질화 단계 사이에 2분 동안 얼음 위에서 냉각합니다.샘플을 4°C에서 15,800 Gs로 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 회수하고 그 부피를 측정합니다. 단백질을 침전시키기 위해 3배 부피의 얼음을 사용하여 펠릿을 제거합니다.상층액 부피당 냉장 시약급 아세톤을 첨가합니다. 튜브를 15초 동안 볼텍싱한 후, 15,800 Gs에서 10초 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 상층액을 버리고 전동 페스틀과 폴리프로필렌 교반봉을 사용하여 펠렛과 추출 버퍼를 재현탁하며, 아세톤 3부피를 추가로 첨가하여 단백질을 두 번째로 침전시킵니다.펠렛과 추출 버퍼를 재현탁한 후, 단백질 농도를 측정하거나 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. 단백질의 등전점 전기영동(isoelectric focusing)을 수행하려면, 준비된 IPG 스트립을 -20 °C 냉동고에서 꺼내 실온에서 10~15분 동안 평형화하십시오. 샘플을 볼텍싱하고, 샘플 재수화 트레이 채널의 뒷쪽 가장자리를 따라 600~800 µg의 단백질을 직선으로 피펫팅하되, 양 끝에 약 1 cm 정도의 간격을 남겨두십시오.핀셋을 사용하여 IPG 스트립의 플라스틱 커버를 벗겨내되, 스트립의 양 끝부분만 잡고 겔과 접촉하지 않도록 주의하십시오. 스트립에 표시된 양극(+) 끝단을 확인하고 이를 트레이의 왼쪽에 배치하십시오. IPG 스트립의 겔 면이 아래로 향하게 하여 시료 위에 놓으십시오.기포가 아래에 갇히지 않도록 주의하십시오. 1시간 동안 재수화시킵니다. 스트립 위에 미네랄 오일 2.5 milliliters를 덮어줍니다.트레이를 뚜껑으로 덮고 하룻밤 동안 재수화시킵니다. 다음 날 실온에서 포커싱 트레이 채널의 양 끝에 종이 심지를 배치하고 각각에 millipore water 10 µL를 적십니다. IPG strip을 제거하고 약 10초 동안 수직으로 세워 유지합니다.오일을 제거하려면 Kim wipe로 플라스틱 뒷면을 닦아냅니다. IPG 스트립의 겔 면이 아래로 향하게 하고 염기성 끝부분이 왼쪽으로 오도록 배치합니다. 포커싱 트레이에서 스트립을 2.5 milliliters의 미네랄 오일로 덮습니다.트레이를 protean IEF 셀에 배치하고, 기본 셀 온도 20 °C, 스트립당 최대 전류 50 µA, 재수화 시간 없음으로 설정하여 3단계 프로토콜을 프로그래밍합니다. 프로그램이 완료되면, 스트립의 젤 면이 위로 향하게 하여 11 cm 평형화 트레이로 옮깁니다. 채널에 환원 버퍼 4 mL를 추가하고 가볍게 흔들어주며 스트립을 10분 동안 평형화합니다.환원 버퍼를 제거하고 채널에 알킬화 버퍼 4 mL를 추가한 후, 10분 동안 흔들어 스트립을 평형화합니다. IPG 스트립을 1X SDS 러닝 버퍼에 짧게 담가 헹굽니다. 다음으로, 11 cm criterion의 백 플레이트 위에 스트립의 겔 면이 위로 향하게 놓습니다.10.5~14% tris H-C-L-S-D-S polyacrylamide 프리캐스트 겔을 준비하여 SDS 겔과 완전히 밀착되도록 부드럽게 밀어 넣습니다. 두 겔 표면 사이에 기포가 갇히지 않았는지 확인하십시오. IPG strip 위에 1 mL의 용융된 agarose 용액을 덮고 5분 동안 굳힙니다.그런 다음 단일 웰에 5 µL의 단백질 마커를 로딩합니다. 겔을 SDS 버퍼에서 실온 또는 4 °C로 200 V에서 전기영동합니다. 염색약 전선이 겔 하단에 도달하면, 플라스틱 캐스트에서 겔을 분리하고 Coomassie Brilliant Blue 용액에 넣어 가볍게 흔들어주며 밤새 염색합니다.탈색 용액 1에서 겔을 3시간씩 2회 흔들어주고, 탈색 용액 2에서 하룻밤 동안 흔들어줍니다. 분석을 위해 겔을 7% acetic acid에 보관하십시오. 겔 이미징 후 겔 간의 스팟 패턴 비교 분석을 수행하고 관심 스팟을 절취한 뒤, 겔 플러그에 탈색 용액 200 microliters를 가해 볼텍싱하고 샘플을 상온에서 30분 동안 흔들어주며 배양합니다.그런 다음 용액을 조심스럽게 제거하여 버리고 이 과정을 반복합니다. 겔 플러그가 들어 있는 튜브에 갓 제조한 환원 버퍼 30 µL를 첨가하고 60 °C에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 냉각시킵니다.그 후 버퍼를 제거하여 버립니다. Alkylation 버퍼 30 µL를 첨가하고 샘플을 상온의 암소에서 1시간 동안 인큐베이션한 뒤, alkylation 버퍼를 제거하여 버립니다. 각 튜브에 탈색 용액 200 µL를 첨가하여 겔 플러그를 세척하고, 샘플을 37 °C에서 15분 동안 인큐베이션합니다.탈염 용액을 제거하여 버리고 세척 과정을 반복합니다. 다음으로, 겔 플러그에 50 µL의 acetonitrile을 첨가하고 상온에서 10분 동안 배양하여 수축 건조시킵니다. 그 후 acetonitrile을 조심스럽게 제거하고 겔 조각들을 회수합니다.흰색의 작은 크기여야 합니다. 농축기(concentrator)에서 10분 동안 겔 조각들을 건조시킵니다. 활성화된 trypsin 용액 10 µL를 첨가하여 겔 조각들을 팽창시킵니다.실온에서 15분 동안 배양합니다. 튜브에 소화 버퍼(digestion buffer) 25 µL를 첨가합니다. 샘플을 실온에서 하룻밤 동안 흔들어주며 배양한 후, 10분 동안 초음파 처리(sonication)를 하고 원심 분리하여 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.펩타이드를 추가로 추출하려면, 플러그에 0.1% formic acid 10 µL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 흔들어주며 배양한 후, 샘플을 10분 동안 초음파 처리합니다. 상층액을 수집하여 이전에 저장해 둔 상층액과 합칩니다. 그 후 단백질을 탈염하여 HPLC 결합 질량 분석법을 위한 준비를 할 수 있습니다. 운동하지 않은 암수 거울상 골격근을 추출하여 2차원 지도로 분리하였습니다.고해상도 디지털 이미징을 통해 근육 비교 프로테옴의 첫 번째 레벨을 시각화한 결과, 여기에서 보는 바와 같이 각각 약 800개의 단백질 스팟이 검출되었습니다. 수컷 프로테옴 맵을 기준선으로 사용했을 때, 암컷 프로테옴에서 발현량이 변화하는 수많은 스팟이 있음을 알 수 있습니다. 암컷에서 2배 이상 증가한 스팟은 빨간색 원으로, 2배 이상 감소한 스팟은 파란색 원으로 표시하였습니다. 5마리의 마우스를 대상으로 하여 2배 이상 증감하며 통계적으로 유의미한 단백질 스팟의 정체는 액체 크로마토그래피 질량 분석법을 이용한 아미노산 서열 분석을 통해 결정합니다.이 그래프에서 x축은 운동 전 암컷 생쥐를 나타내며, y축은 단일 운동 0시간 시점 그룹을 나타냅니다. 결과에 따르면 암컷은 당 에너지 대사와 효소가 크게 감소하며, 근육 내의 다른 에너지 공급 체계인 크레아틴 키나아제(creatine kinase) 효소 동형 단백질이 감소하는 것으로 나타납니다. 인간과 동물 모두 휴식 시와 운동 후에 수컷의 혈청 CK 수치가 더 높게 나타나지만, 혈청 CK 수치가 반드시 근원섬유의 양과 상관관계를 가지는 것은 아닙니다.miren biceps brachii 근육의 CK 세포 풍부도에서 나타나는 이러한 성별 이형성은 새로운 발견이며, 생리학적으로 상이한 혈청 CK 수치에 대한 답이 될 수 있습니다. 본 절차 이후에는 결과 검증을 위해 정량적 면역 블로팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 차등 프로테옴 프로파일링을 위한 시료 준비 및 분리 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

이 비디오는 Weil-Blakesley conchotome을 사용하여 인간 광대 측측근의 경피적 근육 생검 기술을 보여줍니다.

사람의<em&gt; 광근의 Lateralis</em&gt; 웨일 - Blakesley Conchotome를 사용하여 골격 근육 생검

MyoD는 완전히 분화된 많은 비근육 세포주의 근육 전달화를 유도하는 강력한 능력을 가진 근육 전사 인자입니다. 이 전이분화(transdifferentiation)에 관여하는 후성유전학적 메커니즘은 대체로 알려져 있지 않다. 여기에서는 이중 친화성 정제 방법과 질량 분석법을 설명하여 MyoD 파트너를 철저하게 특성화합니다.

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

여기에서는 개선 된 염색 품질함으로써 자동 취득하고 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용 ImageJ에 섬유 집단의 정량화를 허용 빠른 근섬유 분석을위한 프로토콜을 제시한다.

마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

초파리 비행 근육은 전사 조절, 대체 접합, 신진 대사 및 메카노생물학을 연구하는 강력한 모델입니다. 우리는 프로테오믹스및 깊은 시퀀싱에 이상적인 고농축 샘플을 생성하기 위해 살아있는 번데기에서 형광 표지된 비행 근육의 해부를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 견본은 근육 발달의 다양한 양상에 중요한 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

초파리 는 근육 형성을 조절하는 주요 분자를 연구하기 위한 잘 정립된 모델입니다. 그러나 현재의 방법은 mRNA 전사 역학 및 세포융합 내 공간 분포를 결정하기에 충분하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 RNA 형광 in situ hybridization 방법을 최적화하여 단일 분자 규모에서 mRNA를 검출하고 정량화할 수 있습니다.

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.

인체 골격근의 섬유 유형 식별

우리는 성인 마우스의 6개 근육에서 다양한 길이와 유형의 효소로 해리된 섬유를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다: 그 중 3개는 이미 설명되었고(flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) 그 중 3개는 처음으로 성공적으로 해리되었습니다(extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

이 프로토콜은 마이크로 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 작은 동물의 골격근 및 내장 조직, 지방 조직 및 골격 조직을 포함한 제지방량을 비용 효율적으로 정량화할 수 있습니다. 이는 제지방 조직과 지방 조직을 구분하며, 이는 생물 의학 연구, 특히 작은 동물을 대상으로 한 중개 연구에 상당한 이점을 제공합니다.

Micro-Computed Tomography를 사용한 소형 동물의 비침습적 골격근 정량화

배우세요 2차원 겔 전기영동과 질량분석을 이용해 골격근의 성별 특이적 단백질 발현 차이를 분석하는 방법을. 약 800개의 단백질 스팟을 식별하여 생물학적 연구에 활용할 수 있습니다.

Proteomics에서 골격근 성별 동종 이형

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