설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

안녕하세요, Shane 씨, Bija Lab의 Monty입니다. 오늘은 깨어 있는 상태에서 행동하는 쥐의 단위 활동(unit activity)과 국소 전위(local field potential)에 대한 고밀도 전기생리학적 기록을 수행하기 위해 실리콘 프로브를 사용하는 방법을 보여드리겠습니다. 소형 마이크로 드라이브를 제작하고, 여기에 실리콘 프로브를 고정한 뒤, 만성 기록을 위해 프로브를 뇌에 이식하는 과정을 설명해 드리겠습니다.

이 과정은 매우 간단하지만 여러 단계가 포함되어 있습니다. 그럼 이제 시작해 보겠습니다. 여기 저희가 수년에 걸쳐 설계하고 제작한, 여러 개의 단일 와이어, 테트로드 및 실리콘 프로브를 이동시키기 위한 쥐와 생쥐용 마이크로 드라이브 소형 컬렉션이 있습니다.

실리콘 프로브는 단단한 인쇄 회로 기판이나 유연한 폴리아미드 케이블에 부착할 수 있습니다. 여기서는 4개의 샹크가 있는 프로브를 마이크로 드라이브에 고정하는 방법을 보여드리겠습니다. 드라이브를 준비하려면 황동판, 55 및 65 사이즈의 드릴 비트, 탭, 단열 핀 헤더, 0 0 90 나사 및 해당 너트, 드릴 비트 홀더와 드라이버가 필요합니다.

첫 번째 단계는 헤더에서 3핀 조각을 분리하는 것입니다. 가운데 핀을 조심스럽게 뽑아낸 후, 65 사이즈 드릴 비트로 구멍을 뚫어 확장하십시오. 그런 다음 탭을 사용하여 나사산을 깎으십시오.

황동판에서 두 개의 조각을 잘라냅니다. 드레멜 드릴을 사용하여 판의 가장자리를 다듬고, 55번 크기의 드릴 비트를 사용하여 두 조각의 중앙에 구멍을 뚫습니다. 황동판이 핀에 닿도록 드라이브를 임시로 조립한 다음, 조립체가 안정될 때까지 나사를 살짝 조입니다.

핀 끝부분을 밖으로 뺀 다음 황동판에 납땜합니다. 마이크로 드라이브가 거의 완성되었습니다. 나사의 돌출된 끝부분을 줄로 갈아낸 후, 나사에 납땜하여 고정합니다. 이제 매우 가벼운 마이크로 드라이브 2개가 준비되었습니다.

시계 방향으로 돌리면 플라스틱 브리지가 올라갑니다. 실리콘 프로브는 두 가지 구성 요소를 통해 드라이브에 부착할 수 있습니다. 실크 가드 엘라스토머 무게 측정.

성분들을 10:1 비율로 혼합합니다. 끝을 뾰족하게 만든 면봉을 사용하여 프로브의 상단 끝부분에 보호제를 도포합니다. 60 °C로 예열된 오븐에서 최소 2시간 동안 건조시킵니다.

기록 부위에 이물질이 없는지 확인하기 위해 팁을 세척해야 합니다. Contra 세제를 4배 희석하여 준비하십시오. 프로브를 63 °C의 세제 용액에 최소 2시간 동안 담가 두십시오.

프로브를 드라이브에 고정하기 전에 증류수에 반복적으로 담가 세제를 씻어내야 합니다. 각 기록 부위의 임피던스는 면도날을 사용하여 확인해야 합니다. 두 개의 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 브리지에 여러 개의 홈을 파서 거친 표면을 만듭니다.

프로브를 드라이브의 브리지 반대편에 놓습니다. 수술 전, 그립 시멘트를 사용하여 프로브를 브리지에 고정합니다. 접지 참조 전극을 준비합니다.

절연 구리 전선의 한쪽 끝을 약 1mm 정도 납땜합니다. 바늘을 사용하여 0 0 90 스테인리스 스크류의 머리 부분을 긁어낸 후, 구리 전선을 여기에 납땜합니다. 납이 스크류의 홈으로 흘러 들어가지 않도록 주의하십시오.

구리 메쉬를 사다리꼴 모양으로 자릅니다. 이 조각들은 헤드 스테이지를 보호하기 위해 조립될 것입니다. 수술 기구 및 준비 과정은 많은 소동물 수술에서 사용되는 것과 동일합니다.

이 비디오에 표시된 수술은 적절한 가시성과 촬영 목적을 위한 시연용임을 유의하십시오. 몇 가지 준비 단계, 수술 시 주의 사항 및 수술 후 절차는 여기에 표시되지 않았습니다. 설치류 수술에 관한 적절한 가이드라인을 참조하시기 바랍니다.

모든 수술은 무균 상태에서 가스 마취 하에 진행됩니다. 정중선 피부 절개 후, 피부와 골막을 제거하고 두개골을 세척 및 건조시킵니다. bregma와 lambda 사이의 위치와 거리를 측정하여, 두개골을 열기 전 제안된 위치의 X 및 Y 좌표를 결정하고 표시할 수 있습니다.

프로브를 이식하기 위해, 전극을 삽입할 구멍의 위쪽과 옆쪽 뼈에 여러 개의 나사를 절반 정도 박아 넣습니다. 장기 만성 실험에서는 헤드 스테이지를 두개골에 고정하기 위해 여러 개의 나사를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 작은 브러시를 사용하여 두개골 표면 전체에 meta upon dentin activator를 도포합니다.

그런 다음 생리식염수로 헹굽니다. 다음으로, dental cement 층을 주의 깊게 도포하여 chain course crew를 덮습니다. 그 후 4개의 구리 플랩을 이 두개골 grip cement에 고정합니다.

이제 수술의 가장 중요한 단계에 도달했습니다. 라운드 헤드 드릴 비트를 사용하여 프로브 삽입 부위를 준비합니다. 드릴링은 여러 단계에 걸쳐 수행되며, 뼈에는 수시로 식염수를 관류합니다.

골편을 조심스럽게 제거하고 표면을 세척하여 잔해물을 제거합니다. 두 가지 도구가 필요합니다. 곤충 핀으로 제작한 후크와 날카로운 메스 날을 사용하여 골편을 들어 올리고 절개합니다. 미세한 출혈은 식염수 세척으로 해결할 수 있습니다.

주요 출혈이 발생하거나 신피질이 어떤 방식으로든 손상된 경우에는 수술을 중단하고 다른 동물을 준비하는 것을 고려해야 합니다. 이제 실리콘 프로브를 이식합니다. 프로브는 혈관이 없는 부위에 삽입해야 하며, 경미한 출혈이 발생할 경우 지혈선을 사용하여 해결합니다.

프로브를 의도한 표적의 약 1mm 위에 배치합니다. 파라핀과 미네랄 오일의 따뜻하게 녹인 혼합물을 도포하여 구멍을 밀봉합니다. 드라이브 하단은 그립 시멘트를 사용하여 피질골에 고정합니다.

프로브의 연결부는 마찬가지로 두개골에 고정합니다. 수술의 마지막이자 중요한 단계는 프로브와 드라이브 주변에 구리 망 플랩을 조립하여 보호 실린더를 만드는 것입니다. 이 실린더는 환경 소음과 전하를 띤 수염에 의해 생성되는 서파 아티팩트로부터 전기적 차폐막 역할도 수행합니다.

행동 동물에서 높이는 과도한 재료를 잘라내어 조절할 수 있습니다. 기준 접지에서 나오는 와이어는 커넥터의 해당 핀에 납땜합니다. 접지는 구리 메쉬(Mesh)에도 납땜합니다.

구리 메쉬 플랩은 솔더링으로 연결하고 시멘트로 보강합니다. 수술 종료 시점에 드라이브 스크루의 움직임을 다시 테스트하며, 적절한 수술 후 관리 후 고무 장갑 조각을 잘라 헤드 스테이지 상단에 덮습니다. 다음 날 동물은 건강하고 협조적인 상태임을 확인합니다.

동물의 자유로운 움직임을 위해, 초경량 초유연 멀티 트렌드 와이어(multi trend wire) 사용을 권장합니다. 이 얇은 케이블은 최소한의 균형 맞추기(Counterbalancing)가 필요하며 제약 없는 움직임을 가능하게 합니다. 기록 품질은 매일 홈 케이지에서 테스트합니다.

기록 부위의 위치는 뉴런의 발화 패턴과 국소 전위(local field potentials)의 형태를 통해 추정합니다. 본 영상에서는 단일 실리콘 프로브의 삽입 과정을 보여주지만, 어느 정도 숙련되면 여러 개의 프로브와 드라이브를 사용하여 다중 부위 기록을 용이하게 수행할 수 있습니다. 또한, 저희는 마우스 뇌에 실리콘 프로브를 삽입하기 위해 이와 유사하지만 더 작은 크기의 드라이브를 사용하고 있습니다.

마지막으로, 실리콘 프로브 기록은 광유전학 실험에서 신경 조직의 국소 광자극과 효과적으로 결합하여 사용할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.