Name: 설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 37 s
Description: 학습하세요 실리콘 프로브를 이용한 설치류 뇌 신경 활동 대규모 기록 방법입니다. 마이크로 드라이브 제작, 프로브 부착, 뇌 이식 기술을 통해 깨어있는 동물의 장기 신경 생리학 연구가 가능합니다.

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마리 퀴리 국제 발신 원정대 (유럽 연합의 FP/2007-2013 부여 동의 # 221834 및 254780), JD 맥도넬 재단, NSF 그랜트 SBE 0542013, 건강 그랜트 NS034994 국립 연구소, 정신 건강 그랜트 MH5467의 국립 연구소와 하워드 휴즈 의학 연구소 (Janelia 팜 연구 캠퍼스 부여).

1. microdrive 건설 전극과 두개골에 고정되는 고정 부분, 운반 움직이는 부분 : 모든 드라이브는 동일한 기본 요소로 만들어진다. 이상적인 microdrive는 여러 작은 단계에서 전극의 원활한지만 충분히 여행을 할 수 있도록 동물의 크기가 작은 행동, 그리고 무게가 가벼운 방해하지 않고 실험자에 의해 조작하기 쉬운 전극의 우발적인 움직임을 방지할 수있을만큼 견고합니다. 이러한 경쟁 조건의 결과로, 다른 드라이브 제품군 다른 어플 리케이션. 황동 민머리 나사, 일치 너트, 단일 행 핀 헤더와 두 맞춤 컷 황동 접시에서 준비한 플라스틱 다리 : 만 4 개로은 우리의 기본적인 드라이브를 구축할 필요합니다. <ol><li> 헤더에서 3 핀 조각을 부셔 </li><li> 부드럽게 중간 핀을 빼낸다. </li><li> 드릴 비트 크기 # 55 뚫을 드릴로 구멍을 확대. </li><li> 일 잘라00-90 수돗물을 사용하세요. </li><li> 황동 판을 들락 거 렸고 두 조각을 잘라. </li><li> Dremmel으로 접시의 가장자리를 꾸민다. </li><li> 드릴 비트 크기에게 # 65로 두 조각의 중간에 구멍을 드릴 다운합니다. </li><li> 놋쇠 접시가 핀을 만지시 있도록 드라이브 조각을 조립. 이것을 달성하기 위해, 연속 통해 황동 판, 스레드 핀 헤더 구멍, 두 번째 황동 접시와 너트 황동 나사를 삽입합니다. 부드럽게 때문에 어셈블리가 안정되어있는 나사를 조이십시오. </li><li> 솔더 핀 황동 판에 끝납니다. </li><li> 나사의 튀어나온 끝을 파일. </li><li> 나사에 땜납 너트. 조심하지 솔더 황동 판에 너트를합니다. </li><li> 드라이브의 움직임을 테스트 : 플라스틱 다리를 상승 시계 나사를 켜십시오. </li></ol> 2. 실리콘 프로브를 준비 드라이브에 프로브를 고정하기 전에 cerebr을 방지하기 위해 프로브의 결합 영역으로 별도 절연을 추가ospinal 유체 (CSF) 또는 짧은 회로를 생산에서 습도 : <ol><li> 무게와 10시 1분 비율에 Sylgard 엘라스토머 구성 요소를 섞는다. </li><li> 날카롭게 면화 작은 주걱 사용하여 프로브의 맨 끝에 Sylgard를 적용합니다. </li><li> 12 시간 동안 60 ° C에서 preheated 오븐에 말리도록. </li></ol> 녹화 사이트가 어떤 파편 찾아볼 수없는 것을 위해, 프로브 팁 세척해야합니다 : <ol start="4"><li> Contrad 세제의 4 % 희석을 준비합니다. </li><li> 탐사선이 최소한 2 시간 동안 63 ° C에서 세제에 흠뻑 젖어 보자. </li><li> 증류수로 반복 프로브를 찍기로 세제를 씻어. </li></ol> 드라이브에 프로브를 고정하기 전에 각 녹화 사이트의 임피던스가 확인하여야한다 : <ol start="7"><li> 0.9 %의 식염수에 프로브를 찍어 및 임피던스 미터에 연결합니다. 너무 많은 음반 사이트는 잘못된 임피던스 단계를 반복 2.4-2.6이 있거나 다른 프로브를 사용하여 고려하십시오.여기 수제 채널 선택과 결합 프레더릭 Haer, 주식 회사 (FHC)에서 임피던스 컨디셔닝 모듈을 사용합니다. 또는, Neuralynx 주식 회사에 의해 NeuroNexus 주식 또는 NanoZ 의해 niPOD 동시에 모든 프로브 채널의 임피던스의 모니터링을 허용합니다. </li></ol> 3. microdrive에 프로브를 Affixing <ol><li> 면도날 사용하여 견고한 표면을 만들기 위해 다리에 여러 개의 홈을 했네요. </li><li> 드라이브의 다리에 프로브를 Appose. 이 절차는 최고의 클램프로 드라이브를 개최하고 정강이가 드라이브 나사와 완벽하게 평행되도록 micromanipulator하여 프로브를 조정하여, 운영 현미경으로 이루어집니다. 이것이 발전하는 동안,없이 뇌 조직으로 프로브 정강이 움직이는가를 통해 &#39;절단&#39;것을 보장합니다. 드라이브의 기본에 대한 상대 프로브 팁 정확한 깊이는 표면에서 고려 대상 구조의 깊이를 복용,이 단계에서 결정되어야두개골. </li><li> 프로브는 다음 그립 시멘트와 다리로 고정됩니다. </li><li> 옵션 : 머리에 프로브 트랙을 시각화 위해 DiI 용액 (에탄올에 희석 1~2%)은이 단계에서 프로브의 뒷면에 적용할 수 있습니다. </li></ol> 4. 두개골을 준비 이전 수술로, 참조 및 접지 전극, 그리고 온 머리 패러데이 케이지의 부분이 준비가되어 있습니다 : <ol><li> 구리 와이어의 두 2 &quot;길이 조각, 약 1mm 각 절연 구리선의 땜납 한쪽 끝을 잘라. </li><li> 바늘을 사용하여, 거기에 구리 와이어의 00-90, 1 / 8 &quot;스테인레스 스틸 스크류 및 솔더 한 조각의 머리를 다쳤어요. 납땜과 같은 스테인레스 스틸 접지 나사 전극은 적절한 유량 (예, N-3 모든 유형을 필요로 라 - 공동의 플럭스) 및 높은 납땜 팁 온도는. 조심스럽게 나사의 홈에 흐르는로부터 솔더되지 않습니다. 이것은 접지 전극으로 사용됩니다. 준비하는 또 다른 나사와 동선으로 반복기준 전극. </li><li> 구리 메쉬에서 trapeziodal 조각을 잘라. 이러한 조각들은 headstage를 보호하기 위해 조립됩니다. </li></ol> 수술 도구와 준비는 많은 작은 동물의 수술에서 사용되는 것과 같은 있습니다. 전체 수술은 NIH 승인된 가이드라인에 의하면, 무균 조건을 사용하여, 깊은 isoflurane 마취하에 이루어집니다. 이 동영상에 표시된 (모의) 수술은 데모용으로만 사용된다는 점에 유의하시기 바랍니다. 적절한 가시성 및 촬영 목적, 여러 준비 단계, 수술주의 사항 및 수술 절차에 대해서만 표시 / 표시 또는 설명되지 않습니다. 수술에 앞서, 모든 부품 및 소모품은 적절한 절차 (; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf 서바이벌 설치류 외과 요강 참조)에 따라, 소독하여야한다. 수술 중에 두개골에 무균 필드 멸균 커튼으로 준비하고 격리합니다. 끝에 수술은 광범위한 스펙트럼 항생제입니다로컬 pplied과 오랜 연기 진통제 (예, buprenorphine, [Buprenex] 0.05 밀리그램 / ㎏) intramuscularly 제공됩니다. 또한, 진통제는 (예, 이부 프로펜) 5 일간 약 60 mg/kg/24시에서 식수로 제공됩니다. 적절한 수술과 마취 절차를 보려면 해당 소스에게 12 참조하십시오. <ol start="4"><li> stereotaxic 장치로 동물을 설치 면도하고 두피 13 닦아주십시오. </li><li> 중간선을 따라 피부를 잘라 머리를 옆으로 밀어. , 골막을 제거 청소하고 두개골을 건조. </li><li> bregma와 람다 간의 위치와 거리를 측정하고, 그에 따라 stereotaxic 아틀라스 14를 사용하여 프로브 주입 사이트의 x와 y 좌표를 결정합니다. 메스로 두개골에 십자가를 위해서 힘든하여 사이트를 표시합니다. </li><li> 상단에 다른 뼈 접시에 중간 뼈로 둥근 헤드 드릴 비트 (크기 ¼)와 드라이브 지원 나사 (스테인리스, 000-120, 1 / 16 &quot;)를 사용하여 두개골을 뚫을두개골의 측면에있는 차. 나사가 단단히 결합 헤드기어로 두개골에 앵커를 제공합니다. </li><li> 소뇌 위의 구멍을 파악 및 구장과 단계 4.2에서 준비 레퍼런스 전극을 삽입합니다. 현지 필드 잠재력 (LFP)를 기록 내용 참조 사이트의 선택은 중요합니다. 소뇌 LFP이 중간선에 위치에 최소한의 모든 피질 영역과 근육 유물의 작은 있기 때문에이 사이트는 선택됩니다. </li><li> 두개골의 전체 표면 위에 작은 브러시를 사용하여 상아질 활성제 (Metabond 키트)를 적용합니다. 0.9 %의 식염수로 씻어. </li><li> 치과 시멘트 적용 (Metabond 키트를, 믹싱에 대한 제조 업체의 지시 사항을 따르십시오) 신중 앵커 볼트와 접지 및 참조 전극을 다루는 있지만 프로브 주입 사이트 맑은 떠나, 두개골에. </li><li> 네 개의 구리 메쉬 펄럭 (4.3 단계에서 준비) 두개골로 고정합니다. 이 내용은 두개골의 앞부분은, 왼쪽, 오른쪽, 그리고 후부 측면에 각각의 좁은 기초를 돈독히. 일전자의 구리는 뼈와 직접 접촉이 없어도 항상 시멘트의 계층으로 구분해서는 안됩니다. </li></ol> 5. 뇌 표면을 준비 <ol><li> 자주 식염수 뼈 물을 대는 동안 둥근 머리에 드릴 비트를 사용하여, 여러 단계의 주입 사이트 주위에 드릴 다운합니다. </li><li> 조심스럽게 뼈 플랩을 제거하고 뇌 표면을 관개하다. </li><li> 다중 생크 프로브를 삽입하는 경우, 경질의 대형 스트립이 제거됩니다. 메스와 곤충 바늘 (또는 표준 텅스텐 microelectrode)에서 준비 후크 : 두 도구는 경질을 제거할 필요합니다. 하드 표면 (예 : 유리 현미경 슬라이드)에 대해 밀어 바늘의 팁을 구부려, 그리고 (여기서, 나무 Q-팁 한 조각, 또는 microdissecting 바늘 홀더) 손잡이에 첨부해 주시기 바랍니다. </li><li> 후크와 경질을 고양하고, 메스로 상처를 냈어. 특별한주의가 PIA, 혈관 네크로 텍스의 표면 손상을 방지하기 위해 가져옵니다. 작은 출혈을 해결할 수 있습니다식염수 관개에 의한. 주요 출혈이 발생하거나 네크로 텍스가 어떤 식으로든 손상되면, 하나는 수술을 종료하고 다른 동물을 준비하는 것이 좋습니다. </li></ol> 6. 프로브를 이온 주입 이 단계에서, 대뇌 피질의 표면 혈관의 밀도와 방향을 신중하게 평가합니다. 탐사선이 큰 혈관에서 무료로 지역에서 두뇌에 침투 있기 때문에 Stereotaxic 좌표가 조정되어야합니다. 이식의 경우 드라이브 어셈블리 stereotaxic 홀더에 부착된 악어 클립으로 개최 할 수 있습니다. 중단 뇌 표면의 가시성 및 프로브의 팁 성공적인 침투를 위해 중요합니다. <ol><li> 지속 식염수 craniotomy 물을 대는 동안 천천히, 의도된 목표 상기 약 1mm로 프로브를 내려. neocortical 녹음 내용 프로브 팁은 ​​피질 약 0.5 mm로 인하되며 표면 근처에 다시 드러내기 시작 했어. </li&gt; <li> 바늘 (10 ML의 파라핀 오일에 왁스의 10~20g, 65 ° C로 가열)를 통해 왁스와 파라핀 오일 따뜻하게 녹인 혼합물을 적용하여 craniotomy을 봉쇄해. 이전 응용 프로그램에, 30 ° C로 믹스를 냉각 및 밀도를 테스트합니다. 그것은) 쉬운 프로브의 움직임을 허용 정도로 부드럽게해야합니다. 완벽한 커버 리지를 촉진하기 위해서 혼합물은 마이크로 cauterizer의 일각으로 굳어진 왁스를 접근하여 현장에 녹아 수 있습니다. </li><li> 회전하는 너트가 무료 말던 신중하다고, 그립 시멘트로 두개골에 드라이브의 하단을 첨부합니다. 그것은이 단계에서 드라이브의 모든 사고 &#39;충돌&#39;을 피하기 위해 가장 중요이고, 그렇지 않으면 프로브는 피질에 손상을 것입니다. 드라이브가 두개골에 고정되면 프로브의 원활한 움직임을 확인해야합니다. </li><li> 두개골에 프로브의 커넥터 부분을 돈독히. </li></ol> 7. 온 - 머리 패러데이 케이지 구축 <ol><li> 프로브 및 dri 주변 보호 실린더로 구리 메쉬 펄럭 띄워 및 조립같군. 실린더는 또한 환경 소음과 행동 동물의 부과 수염 제작한 느린 파도 유물에 대한 전기 보호막 역할을한다. </li><li> 구리 메쉬는 프로브 커넥터의 상단과 수준 수 있도록 여분의 물질을 멀리 절단하여 원통 높이를 조정합니다. </li><li> 솔더 참조 및 접지 나사에서 커넥터의 해당 핀에 전선. 또한 솔더 인접한 구리 메쉬 펄럭 함께 구리 메쉬에 접지 와이어를 자신의 전기적 연속성을 보장하고, 납땜합니다. </li><li> 그것을 강화하고 금속과 동물의 피부 사이에 직접적인 접촉을 방지하기 위해 구리 메쉬에 그립 시멘트의 레이어를 적용합니다. 선택적으로 추가 헤드기어를 강화하기 위해 에폭시 수지의 레이어를 적용합니다. </li><li> 드라이브 나사의 움직임을 테스트합니다. </li><li> 고무 장갑의 조각 인하와 헤드기어의 상단을 커버. </li></ol> 8. 자유롭게 움직이는 동물의 녹화 <ol><li> appropri 후수술 치료를 먹은, 높은 임피던스 headstage 및 경량 ultraflexible 멀티 스트랜드 케이블을 사용하여 레코딩 시스템에 동물을 연결합니다. 반대 급부 헤드기어의 무게. </li><li> homecage에 매일 기록의 품질을 테스트합니다. 촬영 장소의 위치는 단위 연소 패턴 및 지방 현장 잠재력의 형태 모두에 의해 판단된다. 대상 구조에 도달할 때까지 작은 단위 (일반적으로 팔분의 일 하루 4분의 1 회전에, 즉 35-70 micrometers)의 나사를 설정하여 점차적으로 프로브를 낮춥니다. </li></ol> 9. 대표 결과 Electrophysiological 신호 (현지 필드 잠재력과 단위 활동) 기록된 구조와 동물의 현재 행동에 따라 다릅니다. 쥐가 오픈 필드를 탐험하는 동안 그림 1은 32 채널 CA1 hippocampal 레코딩의 예를 보여줍니다. 저녁을 먹다가있는 탐사시 현지 필드 잠재력 유수 8 Hz에서 (세타 밴드) 진동 참고여러 개의 정강이와 사이트 (화살촉으로 표시 스파이크의 예입니다)에 급상승 erimposed. 의 연결을 단위 활동을 분석하기 위해 스파이크들은 파형 15-16의 클러스터 분석을 사용하여 하나의 단위로 감지하고 정렬됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3568/3568fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 4 정강이 X 8 사이트 실리콘 프로브를 사용하여 행동 쥐의 CA1 Hippocampal 녹음. 녹음 광대역 및 지역 분야 잠재 oscillations (예 : &quot;세타&quot;밴드 8 Hz에서 리듬)와의 연결을 급상승 활동을 모두 공부할 수 있도록 20 000 Hz에서,에서 샘플입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3568/3568table1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3568/3568table1.jpg" alt="표 1" /></a> 표 1. 사용 시약 및 장비에 대한 대안.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 영화는 행동 쥐에서 만성 대규모 레코딩을위한 실리콘 프로브의 주입 절차를 보여줍니다. 의 연결 활동의 품질의 녹음을 보장하기위한 중요한 단계는 모두 생물 학적 (뇌 세포)와 기술 (실리콘 탐침) 재료의 취약성에서 발생합니다. 모든 원격으로 &quot;하드&quot;표면 (한 경질을 제거하지 않고 두뇌에서 그들을 이식하려한다면 예를 들어, 정강이가 부러지는 줄)와 정강이의 접촉을 피하기 위해 프로브를 처리하는 동안 특별한주의가되어야합니다. 마찬가지로, 뇌 세포 (주입에 대한 뇌의 표면을 준비하는 동안, 또는 그것이 이식되면 프로브 또는 드라이브 부딪히는에서)에 어떤 상처가 세포를 손상과 단위 활동의​​ 녹음을 위태롭게 나타날 수 있습니다. 또한, 접지의 전기적 경로가 connecto의 뇌척수, 지상 나사, 구리 와이어, 구리 메쉬 펄럭 및 접지 핀 사이에 회로 중단으로 확인하여야한다R은, 큰 움직임 유물 및 / 또는 회선 잡음 (50 Hz에서 60 Hz에서)을 초래할 것입니다. 패러데이 케이지가 충분히 높지 않을 경우 튀어나...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 실리콘 프로브 Buzsaki32, 4 정강이 X 8 사이트. 포장 : 유연한 폴리 아마 이드 케이블 </td><td> 자료 </td><td> NeuroNexus </td><td> 프로브 : buzsaki32 포장 : HC32 </td><td> 녹음 프로브 </td></tr><tr><td> 라운드 브래스 스크류, 00-90는 x 2분의 1 라운드 브래스 나사 </td><td> 자료 </td><td> JIMorris </td><td> R0090B500 </td><td> 드라이브 부품 </td></tr><tr><td> 경감 님 16 진 너트, 00-90 </td><td> 자료 </td><td> JIMorris </td><td> N0090B </td><td> 드라이브 부품 </td></tr><tr><td> 브래스 C260 스트립, ASTM-B36 두께 : 0.025 &quot;, 길이 : 12&quot;, 폭 : 1 / 2 &quot; </td><td> 자료 </td><td> 소형 부품 </td><td> B000FMYU72 </td><td> 드라이브 부품 </td></tr><tr><td> 커넥터 헤더, 2mm 피치, M에일, 단일 행, straigt, 36 순위 </td><td> 자료 </td><td> Digikey </td><td> 2163S-36-ND </td><td> 드라이브 부품 </td></tr><tr><td> 2 - 부분 Sylgard 실리콘 엘라스토머 </td><td> 자료 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> SYLG184 </td><td> 프로브를 추가 - 보온하려면 </td></tr><tr><td> 방사능 오염을 제거하는 70 액체 세제를 Contrad </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 04-355 방사능 오염을 제거 연구소 번호 : 1002 </td><td> 녹음 장소를 청소하려면 </td></tr><tr><td> 임피던스 컨디셔닝 모듈 </td><td> 장비 </td><td> FHC 주식 회사 </td><td> 55-70-0 </td><td> 임피던스 측정기 </td></tr><tr><td> niPOD - 32 개 채널 </td><td> 장비 </td><td> Neuronexus </td><td> niPOD -32 </td><td> 임피던스 측정기 </td></tr><tr><td> 그립의 시멘트 산업 학년 </td><td> 자료 </td><td> 편자에 박는 뾰족한 징 Dentsply </td><td> 675571 (분말) 675572 (용매) </td><td> 그립 CE, 표준 </td></tr><tr><td> 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 퍼클로레이트을 (; DiIC18 (3) &#39;DiI&#39;) 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> 두뇌에 프로브 트랙을 얼룩 </td></tr><tr><td> 스테인리스 기계 나사, 바인딩 헤드, 홈 붙이 드라이브, # 00-90, 1 / 8 &quot; </td><td> 자료 </td><td> 소형 부품 </td><td> MX-0090-02B </td><td> 접지 및 참조 나사 </td></tr><tr><td> 마그넷 와이어, 20G, 나일론 - 폴리 우레탄 코팅, MW80 </td><td> 자료 </td><td> 소형 부품 </td><td> B000IJYRP2 </td><td> 접지 및 참조 선 </td></tr><tr><td> 스테인리스 기계 나사, 드라이브 홈 붙이 바인딩 책임자, # 000-120, 1 / 16 &quot; </td><td> 자료 </td><td> 소형 부품 </td><td> MX-000120-01B </td><td> 앵커 나사 </td></tr><tr><td> N-3 모든 유형의 플럭스 액체에게 </td><td> 시약 </td><td> 라 - 공동 (Markal) </td><td> 23,512 </td><td> 솔더 스테인리스로 허용 </td></tr><tr><td> MicroGrid 정밀 구리 확대 </td><td> 자료 </td><td> Dexmet </td><td> 3 CU6-050 ​​FA </td><td> 온 - 머리 패러데이 케이지에 대한 구리 메쉬 </td></tr><tr><td> C &amp; B-METABOND 빠른! 시멘트 시스템 - 상아질 활성 </td><td> 자료 </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> C &amp; B-METABOND 빠른! 시멘트 시스템 - 치과 시멘트 </td><td> 자료 </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> 샤프 포인트 텅스텐 바늘과 홀더 </td><td> 도구 </td><td> Roboz 외과 용구 </td><td> RS-6064 및 RS-6061 </td><td> 후크가 경질을들하려면 </td></tr><tr><td> 초경 규석엉 HP 4분의 1 </td><td> 도구 </td><td> 헨리 Schein </td><td> 9,990,013 </td><td></td></tr><tr><td> 파라핀 (과립) </td><td> 자료 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P31-500 </td><td></td></tr><tr><td> 미네랄 오일, 라이트 (NF / FCC) </td><td> 자료 </td><td> 피셔 과학 </td><td> O121-1 </td><td></td></tr><tr><td> GC 전자 10-114 2 - 부품 에폭시 접착제 </td><td> 자료 </td><td> 뉴어크 </td><td> 00Z416 </td><td></td></tr><tr><td> 타입 1 LITZ 21 AWG 36분의 40 레드 0.041 TO (MW80-C) 폴리 우레탄-나일론 싱글 &#39;+ / -0.002 &quot;OD </td><td> 자료 </td><td> 뉴잉글랜드 와이어 기술 주식 회사 </td><td> N28-36E-400-2 </td><td> headstage와 앰프 사이의 케이블을 확인하려면 </td></tr><tr><td> 32 채널 매우 대규모 집적 headstage, 20x 이득 </td><td> 장비 </td><td> Plexon </td><td> HST/32V-G20 </td><td> Headstage </td></tr></tbody></table>

설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

신경 과학의 주요 과제는 신경 어셈블리의 집단 활동에 행동을 연결합니다. 뉴런과 회로의 입출력 관계의 이해는 공간적 선택성 및 행동 동물의 신경 ensembles, 분리된 하나의 뉴런의 representatively 대용량 샘플 즉, 녹음의 기계론의 분석을 위해 적절한 시간적 해상도를 가진 방법이 필요합니다. 의 연결 활동의 앙상블 모니터링은 인간 주제에 1-11를 포함하여 크고 작은 두뇌 모두 동물에서 지난 10 년 동안에 현저하게 진행되고있다. 실리콘 기반의 디바이스와 여러 현장 녹화 때문에 그들의 확장성, 작은 음량과 기하학적인 디자인에 특히 효과적입니다. 여기서는 여러 단일 뉴런과 맞춤 액세서리 구성 요소와 상용 마이크로 가공 실리콘 프로브를 사용하여 설치류 행동은 현지 필드 잠재력을 녹화하는 방법을 설명합니다. 두 가지 기본 옵션 바가 있습니다또는 preamplifiers에 실리콘 프로브 인터페이스 : 인쇄 회로 기판과 플렉시블 케이블. 프로브 공급 업체 ( <a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a> , <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a> , <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/가</a> ) 일반적으로 결합 서비스를 제공하고 인쇄 회로 기판에 보세 프로브를 제공합니다 또는 유연 케이블. 여기서는 유연한 polyimide 케이블에 연결된 4 생크 32 사이트 프로브의 주입을 설​​명하고, 이동의 microdrive에 장착된. 프로브 준비의 각 단계 microdrive 건설과 수술은 최종 사용자가 쉽게 프로세스를 복제할 수 있도록 삽화가있다.

우리는 대규모 다중 단일 단위 기록 및 실리콘 프로브와 설치류 동물 행동은 현지 필드 가능성에 대한 방법을 설명합니다. 드라이브 제조, 드라이브 및 프로브 주입 공정에 프로브 첨부 파일은 쉽게 복제에 대한 충분한 세부 사항에 그림하고 있습니다.

신경과학의 주요 과제 중 하나는 행동을 신경 집합체의 집합적 활동과 연결하는 것입니다. ...의 입력-출력 관계를 이해하는 것은

안녕하세요, Shane 씨, Bija Lab의 Monty입니다. 오늘은 깨어 있는 상태에서 행동하는 쥐의 단위 활동(unit activity)과 국소 전위(local field potential)에 대한 고밀도 전기생리학적 기록을 수행하기 위해 실리콘 프로브를 사용하는 방법을 보여드리겠습니다. 소형 마이크로 드라이브를 제작하고, 여기에 실리콘 프로브를 고정한 뒤, 만성 기록을 위해 프로브를 뇌에 이식하는 과정을 설명해 드리겠습니다.이 과정은 매우 간단하지만 여러 단계가 포함되어 있습니다. 그럼 이제 시작해 보겠습니다. 여기 저희가 수년에 걸쳐 설계하고 제작한, 여러 개의 단일 와이어, 테트로드 및 실리콘 프로브를 이동시키기 위한 쥐와 생쥐용 마이크로 드라이브 소형 컬렉션이 있습니다.실리콘 프로브는 단단한 인쇄 회로 기판이나 유연한 폴리아미드 케이블에 부착할 수 있습니다. 여기서는 4개의 샹크가 있는 프로브를 마이크로 드라이브에 고정하는 방법을 보여드리겠습니다. 드라이브를 준비하려면 황동판, 55 및 65 사이즈의 드릴 비트, 탭, 단열 핀 헤더, 0 0 90 나사 및 해당 너트, 드릴 비트 홀더와 드라이버가 필요합니다.첫 번째 단계는 헤더에서 3핀 조각을 분리하는 것입니다. 가운데 핀을 조심스럽게 뽑아낸 후, 65 사이즈 드릴 비트로 구멍을 뚫어 확장하십시오. 그런 다음 탭을 사용하여 나사산을 깎으십시오.황동판에서 두 개의 조각을 잘라냅니다. 드레멜 드릴을 사용하여 판의 가장자리를 다듬고, 55번 크기의 드릴 비트를 사용하여 두 조각의 중앙에 구멍을 뚫습니다. 황동판이 핀에 닿도록 드라이브를 임시로 조립한 다음, 조립체가 안정될 때까지 나사를 살짝 조입니다.핀 끝부분을 밖으로 뺀 다음 황동판에 납땜합니다. 마이크로 드라이브가 거의 완성되었습니다. 나사의 돌출된 끝부분을 줄로 갈아낸 후, 나사에 납땜하여 고정합니다. 이제 매우 가벼운 마이크로 드라이브 2개가 준비되었습니다.시계 방향으로 돌리면 플라스틱 브리지가 올라갑니다. 실리콘 프로브는 두 가지 구성 요소를 통해 드라이브에 부착할 수 있습니다. 실크 가드 엘라스토머 무게 측정.성분들을 10:1 비율로 혼합합니다. 끝을 뾰족하게 만든 면봉을 사용하여 프로브의 상단 끝부분에 보호제를 도포합니다. 60 °C로 예열된 오븐에서 최소 2시간 동안 건조시킵니다.기록 부위에 이물질이 없는지 확인하기 위해 팁을 세척해야 합니다. Contra 세제를 4배 희석하여 준비하십시오. 프로브를 63 °C의 세제 용액에 최소 2시간 동안 담가 두십시오.프로브를 드라이브에 고정하기 전에 증류수에 반복적으로 담가 세제를 씻어내야 합니다. 각 기록 부위의 임피던스는 면도날을 사용하여 확인해야 합니다. 두 개의 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 브리지에 여러 개의 홈을 파서 거친 표면을 만듭니다.프로브를 드라이브의 브리지 반대편에 놓습니다. 수술 전, 그립 시멘트를 사용하여 프로브를 브리지에 고정합니다. 접지 참조 전극을 준비합니다.절연 구리 전선의 한쪽 끝을 약 1mm 정도 납땜합니다. 바늘을 사용하여 0 0 90 스테인리스 스크류의 머리 부분을 긁어낸 후, 구리 전선을 여기에 납땜합니다. 납이 스크류의 홈으로 흘러 들어가지 않도록 주의하십시오.구리 메쉬를 사다리꼴 모양으로 자릅니다. 이 조각들은 헤드 스테이지를 보호하기 위해 조립될 것입니다. 수술 기구 및 준비 과정은 많은 소동물 수술에서 사용되는 것과 동일합니다.이 비디오에 표시된 수술은 적절한 가시성과 촬영 목적을 위한 시연용임을 유의하십시오. 몇 가지 준비 단계, 수술 시 주의 사항 및 수술 후 절차는 여기에 표시되지 않았습니다. 설치류 수술에 관한 적절한 가이드라인을 참조하시기 바랍니다.모든 수술은 무균 상태에서 가스 마취 하에 진행됩니다. 정중선 피부 절개 후, 피부와 골막을 제거하고 두개골을 세척 및 건조시킵니다. bregma와 lambda 사이의 위치와 거리를 측정하여, 두개골을 열기 전 제안된 위치의 X 및 Y 좌표를 결정하고 표시할 수 있습니다.프로브를 이식하기 위해, 전극을 삽입할 구멍의 위쪽과 옆쪽 뼈에 여러 개의 나사를 절반 정도 박아 넣습니다. 장기 만성 실험에서는 헤드 스테이지를 두개골에 고정하기 위해 여러 개의 나사를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 작은 브러시를 사용하여 두개골 표면 전체에 meta upon dentin activator를 도포합니다.그런 다음 생리식염수로 헹굽니다. 다음으로, dental cement 층을 주의 깊게 도포하여 chain course crew를 덮습니다. 그 후 4개의 구리 플랩을 이 두개골 grip cement에 고정합니다.이제 수술의 가장 중요한 단계에 도달했습니다. 라운드 헤드 드릴 비트를 사용하여 프로브 삽입 부위를 준비합니다. 드릴링은 여러 단계에 걸쳐 수행되며, 뼈에는 수시로 식염수를 관류합니다.골편을 조심스럽게 제거하고 표면을 세척하여 잔해물을 제거합니다. 두 가지 도구가 필요합니다. 곤충 핀으로 제작한 후크와 날카로운 메스 날을 사용하여 골편을 들어 올리고 절개합니다. 미세한 출혈은 식염수 세척으로 해결할 수 있습니다.주요 출혈이 발생하거나 신피질이 어떤 방식으로든 손상된 경우에는 수술을 중단하고 다른 동물을 준비하는 것을 고려해야 합니다. 이제 실리콘 프로브를 이식합니다. 프로브는 혈관이 없는 부위에 삽입해야 하며, 경미한 출혈이 발생할 경우 지혈선을 사용하여 해결합니다.프로브를 의도한 표적의 약 1mm 위에 배치합니다. 파라핀과 미네랄 오일의 따뜻하게 녹인 혼합물을 도포하여 구멍을 밀봉합니다. 드라이브 하단은 그립 시멘트를 사용하여 피질골에 고정합니다.프로브의 연결부는 마찬가지로 두개골에 고정합니다. 수술의 마지막이자 중요한 단계는 프로브와 드라이브 주변에 구리 망 플랩을 조립하여 보호 실린더를 만드는 것입니다. 이 실린더는 환경 소음과 전하를 띤 수염에 의해 생성되는 서파 아티팩트로부터 전기적 차폐막 역할도 수행합니다.행동 동물에서 높이는 과도한 재료를 잘라내어 조절할 수 있습니다. 기준 접지에서 나오는 와이어는 커넥터의 해당 핀에 납땜합니다. 접지는 구리 메쉬(Mesh)에도 납땜합니다.구리 메쉬 플랩은 솔더링으로 연결하고 시멘트로 보강합니다. 수술 종료 시점에 드라이브 스크루의 움직임을 다시 테스트하며, 적절한 수술 후 관리 후 고무 장갑 조각을 잘라 헤드 스테이지 상단에 덮습니다. 다음 날 동물은 건강하고 협조적인 상태임을 확인합니다.동물의 자유로운 움직임을 위해, 초경량 초유연 멀티 트렌드 와이어(multi trend wire) 사용을 권장합니다. 이 얇은 케이블은 최소한의 균형 맞추기(Counterbalancing)가 필요하며 제약 없는 움직임을 가능하게 합니다. 기록 품질은 매일 홈 케이지에서 테스트합니다.기록 부위의 위치는 뉴런의 발화 패턴과 국소 전위(local field potentials)의 형태를 통해 추정합니다. 본 영상에서는 단일 실리콘 프로브의 삽입 과정을 보여주지만, 어느 정도 숙련되면 여러 개의 프로브와 드라이브를 사용하여 다중 부위 기록을 용이하게 수행할 수 있습니다. 또한, 저희는 마우스 뇌에 실리콘 프로브를 삽입하기 위해 이와 유사하지만 더 작은 크기의 드라이브를 사용하고 있습니다.마지막으로, 실리콘 프로브 기록은 광유전학 실험에서 신경 조직의 국소 광자극과 효과적으로 결합하여 사용할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

anesthetized 쥐의 실리콘 프로브를 사용하는의 연결 활동의 세포외 녹음이 설명됩니다. 이 기법은 동시에 100 개 이상의 뉴런에서 여러 뇌 영역에 걸쳐 정보를 얻을 수 있습니다. 그것은 여러 지역의 회로에의 연결을 ensembles 역학에 대한 단세포 해상도 정보를 제공합니다.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

이 비디오는 국소 자기장 전위를 측정하기 위해 다중 생크 선형 실리콘 프로브를 마우스 뇌에 이식하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 절차에는 프로브를 입체 장치에 고정하고, 표적 뇌 영역에 정확하게 배치하고, 뇌에 삽입하고, 치과 시멘트로 고정하는 것이 포함됩니다. 이식 후 어셈블리는 케이스로 보호됩니다. 회복 후 이 설정을 통해 국소 자기장 전위를 기록하여 뉴런 활동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Multi-Shank Linear Silicon Probes를 사용하여 행동하는 마우스의 뇌 전기 활동 기록

이 프로토콜은 경보를 발하는 쥐의 피질하 뇌 구조에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 머리 억제 메커니즘의 설계 및 외과적 이식을 설명합니다.  이 책은 병치세포 구성에서 단일 뉴런을 분리하고 해부학적 위치를 효율적으로 식별하는 절차를 설명합니다.

경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 Juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런

이 방법은 탐색 및 동물의 머리의 확고한 고정을 필요로 미세한 영상 또는 단일 세포 전기 생리학 녹음하는 동안 탐험하는 마우스 유형, 친숙한 환경을 만듭니다.

평면 바닥의 공기 해제 플랫폼 : 새로운 방법이 깨어에 현미경 또는 전기 생리학과 행동을 결합하여 자유롭게 설치류 이동

무선, 멀티 채널 신경 녹음 및 자유롭게 쥐 행동에 자극에 대 한 양방향 시스템 도입. 시스템은 가볍고 콤팩트, 따라서 animal´s 행동 레 퍼 토리에 최소한의 영향을 미치고. 또한,이 양방향 시스템 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다.

무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스

우리는 만성 실리콘 프로브를 이식 하 고 마우스는 디딜 방 아 큐 농축 장치에 실행 머리 고정에 장소 세포를 기록 하는 다양 한 단계를 설명 합니다.

만성 실리콘 프로브 및 녹음 풍부한 디딜 방 아 장치에 Hippocampal 장소 세포의 이식

우리 18 독립적으로 조정 가능한 tetrodes와 3D 인쇄 하이퍼 드라이브의 건설을 제시. 하이퍼 드라이브는 자유롭게 행동 하는 쥐의 몇 주 동안에 두뇌 활동을 기록 하기 위해 설계 되었습니다.

쥐 행동에 대규모 신경 기록에 대 한 향상 된 멀티 Tetrode 하이퍼 드라이브의 건설

이 프로토콜 로컬 필드 전위 선형 실리콘 프로브 멀티 생크와의 녹음을 설명 합니다. 현재 소스 밀도 분석을 사용 하 여 신호 변환 마우스 해 마에 지역 전기 활동의 개조를 허용 한다. 이 기술을 공간적으로 제한 된 뇌 진동 자유롭게 마우스를 이동에 공부 될 수 있다.

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 두 개의 뇌 영역에서 9개의 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 하나의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이의 구성을 설명합니다. 또한 광실리콘 프로브를 여러 목적으로 안전하게 회수하고 재사용하는 방법이 입증되었다.

자유롭게 움직이는 마우스에서 이중 사이트 고밀도 레코딩을 위한 회수 가능한 광실리콘 프로브 및 Tetrode가 있는 하이브리드 마이크로드라이브 시스템

맞춤형으로 제작된 마이크로 드라이브는 선형 실리콘 어레이를 사용하여 피질 기록 부위를 밀리미터 미만으로 타겟팅할 수 있습니다.

Electrophysiology of Laminar Cortical Activity in the Common Marmoset

여기에서는 설치류의 만성 전기 생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 프로브 임플란트 시스템을 소개하며, 사용 편의성, 프로브 회수율, 실험적 다양성 및 행동과의 호환성에 최적화되어 있습니다.

DREAM Implant: 머리가 고정되고 자유롭게 행동하는 마우스의 만성 전기생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 모듈식 임플란트 시스템

학습하세요 실리콘 프로브를 이용한 설치류 뇌 신경 활동 대규모 기록 방법입니다. 마이크로 드라이브 제작, 프로브 부착, 뇌 이식 기술을 통해 깨어있는 동물의 장기 신경 생리학 연구가 가능합니다.

설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

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