3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

본 실습의 목적은 3D 매트릭스 내 생세포에서 형광 표지된 단백질을 이미징하는 것입니다. 먼저, 형광 표지된 단백질을 발현하는 안정적 세포주를 구축합니다. 이 세포들을 3D 콜라겐 매트릭스에 파종한 후, 공초점 현미경을 사용하여 이동하는 세포의 타임랩스 이미지를 획득합니다.

궁극적으로, 이러한 결과는 타임랩스 이미징 및 형광 단백질(FP) 분석을 통해 이동하는 세포 내 단백질의 국소화와 역동성을 밝혀내며, 3D 환경에서 실시간으로 단백질의 역동성과 국소화를 관찰할 수 있게 합니다. 이는 세포 이동의 근본적인 질문을 해결하는 한 가지 방법이 됩니다. 예를 들어, 세포질 단백질에 의해 접착 접점이 어떻게 조절되는가와 같은 질문입니다.

또한 이러한 접촉들이 특정 억제제에 의해 어떻게 교란되는지도 확인합니다. P 35 디쉬에서 세포를 80~90% 합류도(confluency)로 배양하고, 제조사의 지침에 따라 lipo 2000을 사용하여 목적 플라스미드를 세포에 형질전환합니다. 그 다음 세포를 인큐베이터에 넣습니다.

다음 날, 세포를 두 개의 P one 50 페트리 접시에 나누어 담고 하룻밤 동안 배양합니다. G four 18을 50 µg/mL 농도로 추가하여 배지를 보충합니다. 항생제 선택 배양을 2주 동안 지속합니다.

배양물을 검토하여 G four 18 내성 콜로니를 확인합니다. 그 다음 도립 형광 현미경을 사용하여 GFP 양성 콜로니를 식별하고 표시합니다.

PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 표시된 각 콜로니가 마르지 않도록 액체를 얇게 남겨둡니다. 멸균된 면봉으로 콜로니 가장자리 주변을 최대한 가깝게 닦아내고, 트립신 10 µL를 콜로니 위에 피펫팅합니다.

모든 콜로니에 대해 빠르게 반복합니다. 그 후, 세포 분리를 위해 플레이트를 37 °C에서 배양합니다. 현미경으로 둥근 모양인지 확인합니다.

각 콜로니에 trypsin 10 µL를 첨가하고, 피펫팅하여 플레이트에서 세포를 완전히 분리합니다. 그 후, 안정적인 콜로니를 증폭시키기 위해 각 세포 콜로니를 24 웰 배양 접시의 단일 웰로 옮깁니다. 다음으로, 표준 western blot 및 면역형광법을 사용하여 콜로니의 단백질 발현을 평가합니다.

선택한 세포주의 유리 표면 수식 과정을 진행합니다. 바닥 접시는 최적의 콜라겐 결합을 제공합니다. 10 millimeter 개구부가 있는 각 P 35 접시의 유리 부분에 siloization 용액 300 microliters를 피펫으로 분주합니다.

실온에서 1시간 동안 배양합니다. 용액을 흡입하여 제거하고, 여과수로 10분씩 3회 세척합니다. 물을 제거하고 디쉬를 50 °C 핫플레이트 위에 1.5시간 동안 둡니다.

건조가 가능하도록 접시 뚜껑을 약간 열어 둡니다. 건조된 접시가 식으면 각 접시의 유리 부분에 2% glutaraldehyde 용액 300 µL를 피펫으로 분주합니다. 1시간 동안 배양한 후, PBS로 10분씩 3회 세척합니다.

자외선 램프에 1시간 동안 노출시켜 접시를 멸균하십시오. 먼저 원심분리를 통해 100 µL의 형광 추적 입자를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 500 µL의 배지에 입자를 재현탁하십시오.

5회 세척한 후, 입자를 30 µL의 배지에 다시 현탁합니다. 다음으로, trypsin을 사용하여 GFP 발현 세포를 수확하고 eppendorf 튜브에 mL당 200만 개의 세포 현탁액을 준비합니다. 성장 배지 240 µL를 피펫으로 분주합니다. 1 M HEPES 12.6 µL, 여과수 20 µL, 세포 용액 50 µL, 그리고 형광 입자 10 µL를 추가합니다.

마지막으로, bovine dermis collagen 167 µL를 추가하고, 솔루션 믹스를 충분히 혼합합니다. 이제 준비된 siloized dish의 유리 부분에 80 µL를 옮깁니다. 겔이 중합될 수 있도록 37 °C에서 50분 동안 배양합니다.

그런 다음 성장 배지 2 mL를 조심스럽게 첨가합니다. 현미경 챔버를 37 °C의 일정 온도 상태로 평형화하여 세포 배지를 보충합니다. DIC 이미징을 위해 중성 pH를 유지하려면 디쉬의 상단을 얇은 파라필름 스트립이 부착된 유리 덮개로 교체하십시오.

오일 침수 렌즈를 사용할 때 증발을 방지하기 위해 디쉬의 측면을 덮으십시오. 대물렌즈 위치에 침수액 한 방울을 떨어뜨립니다. 디쉬가 침수액과 접촉하도록 대물렌즈가 있는 현미경 스테이지 위에 콜라젠 젤이 담긴 디쉬를 배치하십시오.

스테이지 드리프트를 최소화하기 위해 샘플의 초점을 맞추고 촬영할 관심 세포를 탐색하십시오. 디시가 안정될 때까지 약 45분 동안 기다립니다. 장시간 캡처를 시작하기 전에 억제제 첨가 실험을 위한 이미지 획득 파라미터를 지정하십시오.

원하는 작동 농도의 약물이 포함된 보충 배지를 준비합니다. 중성 pH를 유지하기 위해 세포 배지를 보충하되, perfil로 밀봉하지 마십시오. 샘플을 현미경으로 옮기고 약물 처리 시점에 맞춰 이미징을 진행합니다.

이미지를 일시 정지하고, 디시를 건드리지 않은 상태에서 조심스럽게 디시 덮개를 캡처하여 제거합니다. 배지를 흡입하고 약물이 포함된 배지를 디시에 피펫으로 넣습니다. 그 후 조심스럽게 디시를 다시 덮습니다.

최적의 FRAP 설정은 시스템마다 다릅니다. 따라서 제조사의 지침을 참조하십시오. 먼저 라이브 셀 이미징을 위한 파라미터를 설정하십시오.

광퇴색을 위한 과정입니다. 세포에 손상을 주지 않으면서 형광 신호를 광퇴색시킬 수 있는 충분한 레이저 출력을 얻기 위해, 연습용 세포에서 이 파라미터들을 테스트하십시오. 그 다음, 최소 5프레임 이상의 이미지를 획득하여 샘플의 이미지 캡처를 시작하십시오.

그런 다음 관심 영역을 광탈색합니다. 회복 시간 동안 캡처를 계속하십시오. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 광탈색 전후의 광탈색 영역의 평균 형광 강도를 시간에 따라 측정합니다.

회복 곡선을 지수 방정식에 맞춥니다. 지수 피팅 곡선으로부터 반감기와 최종 강도 매개변수를 구합니다. 그런 다음 초기 형광 강도에 대한 최종 형광 강도의 비율을 통해 이동 분율을 계산합니다.

이 3D 생세포 이미지들은 GFP actin을 발현하는 건강한 상피세포를 보여줍니다. 4일간의 배양 후, 이 세포들은 3D 콜라겐 매트릭스 내에서 낭종(cyst)을 형성했습니다. 일부 세포는 낭종의 표면을 따라 이동한 반면, 다른 세포들은 낭종의 내부로 이동했습니다.

이동하는 세포에 의해 가해지는 견인력으로 인한 매트릭스 변형은 주변 매트릭스에 내장된 추적 입자의 변위를 통해 분석됩니다. 여기에서는 RO kinase 억제가 견인력에 미치는 영향이 나타나 있습니다. 추적 입자의 움직임은 서로 다른 시점의 최대 투영 이미지로 표시되며, 각 시점은 가색(pseudo colored)으로 처리되었습니다.

대안적으로, 개별 추적 입자의 이미지를 몽타주 형태로 표시하여 추적 입자의 움직임을 보여줍니다. 시간이 경과함에 따라, 이 추적 입자는 Y 2 7 6 3 2를 첨가하기 전과 후에 각각 이동하는 세포의 후단부를 향해 이동했다가 다시 멀어졌습니다. FRAP 분석은 3차원 매트릭스에서 이동하는 GFP actin 발현 세포를 추적하여 전형적인 형광 회복을 나타냅니다. 최적화된 레이저 설정으로 광퇴색 실험을 수행하면, 세포의 건강과 무결성을 유지하면서 관심 영역의 형광 강도가 배경 수준에 비해 눈에 띄게 감소합니다.

이 그래프는 지수 함수를 이용한 회복 곡선의 피팅 결과를 보여줍니다. 숙달되면 매트릭스에 세포를 파종하는 데 한 시간이 소요될 수 있습니다. 3-aminopropyl trimethyl 실리콘과의 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

따라서 화학 흄 후드 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취하십시오. 또한, 3D 매트릭스 내에서 세포를 다룰 때는 멸균 상태를 유지해야 함을 기억하십시오.