Name: 3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 배우세요 3D 콜라겐 매트릭스에서 이동하는 살아있는 세포의 형광 표지 단백질 라이브 이미징 기법을 통해 단백질 역학과 세포 이동 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 방법을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 원고의 중요한 읽기위한 박사님 스미다 감사합니다. 이 작품은 베크 만 젊은 탐정 수상 (SY), 헬맨 가족 새로운 교수진 수상 (SY), NIH 유레카, 캘리포니아 암 연구 조정위원회의 대학에 의해 지원되었다.

1. 안정적인 세포주의 생성 (예 : MDCK 세포) <ol><li> p35 접시에 confluency 80~90%에서 플레이트 세포. 세포 transfection 효율을 줄일 수 백퍼센트 합류 monolayer를 형성하게하지 마십시오. </li><li> Lipofectamine 2000을 사용하는 관심의 플라스미드와 세포 Transfect. 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 transfection 조건을 최적화합니다. </li><li> 다음날,이 통로 p150 배양 접시에 세포. 큰 접시는 안정적인 식민지 사이에 충분한 간격을 허용하는 것이 좋습니다. </li><li> 다음날, 미디어를 변경하고 각각의 접시 500 μg / G418의 ML을 추가합니다. G418의 농도는 각각의 세포 라인에 최적화된해야합니다. </li><li> 약 2 주 동안 매일 미디어를 변경합니다. 이주 후, G418 방지 식민지가 형성되기 시작하고, 육안으로 볼 수 있습니다. </li><li> 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 GFP 긍정적인 식민지를 확인합니다. sharpie 펜을 사용하여 접시에 이러한 식민지를 표시합니다. </li><li> s의electively, 조직 문화 판에서 식민지 trypsinize 미디어를 대기음, 그리고 PBS 또는 트립신 솔루션으로 두 번 세포를 씻으십시오. 두 번째 세척에서 모든 솔루션을 기음하지 않습니다. 건조로부터 세포를 방지하기 위해 접시의 바닥에 액체의 얇은 레이어를 둡니다. </li><li> 각 표시 식민지 경우 : 식민지의 가장자리 주위에 최대한 닦아 소독 면봉을 사용합니다. 이것은 세포 식민지를 포함한 서부 유럽 표준시 지역 섬을 생성합니다. 식민지에 트립신의 피펫 10 μl. 모든 식민지에 대한 반복하고 건조하지 않도록 신속하게 진행합니다. 경험이 풍부한 연구자는 대개 p150 플레이트 회 ~ 12 식민지를 선택할 수 있습니다. </li><li> 37 판을 품어 ° C 50~10분에 대한 세포 접시에서 분리하고 둥근 나타날 때까지. </li><li> 각 식민지의 경우 : 피펫 10 식민지에 트립신의 μl, 그리고 접시에서 세포를 분리하기 위해 몇 시간을 위아래로 피펫. 다음 24 잘 접시에 하나의 잘으로 식민지의 모든 세포를 피펫. </li> &lt;리&gt; 안정적인 식민지가 성장 후, 각 식민지의 단백질 표현이 표준 서양 얼룩과 immunofluorescence를 사용하여 분석합니다. 자세한 분석을 위해 이들 세포 라인을 확장합니다. </li></ol> 2. 최적의 콜라겐 바인딩 (선택 사항) 유리 바닥 접시의 표면 수정 <ol><li> 10mm 오프닝 각 p35 요리의 유리 부분에 유리를 silanize하기 위해, 2 %의 피펫 300 μl 3 - Aminopropyltrimethoxysilane 솔루션입니다. silanization 및 상호 연결 배선도 그림 1을 참조하십시오. 3 Aminopropyltrimethoxysilane이 필터링 물에 희석합니다. </li><li> 상온에서 1 시간 품어. </li><li> 3 Aminopropyltrimethoxysilane 솔루션을 기음 10 분 각각에 대한 필터링 물로 세 번 씻는다. </li><li> ° C 1 시간 50로 설정 뜨거운 접시에 물과 장소 요리를 기음. 약간 접시에서 요리 장소 정상 접시에 습기가 탈출 수 있습니다. </li><li> 더위에서 요리를 제거하고 쿠 수나 </li><li> 각 요리의 유리 부분에 2 % 글루 타 알데히드 솔루션의 피펫 300 μl. 글루 타 알데히드는 PBS에 희석됩니다. </li><li> 1 시간 품어. </li><li> 글루 타 알데히드 솔루션을 기음 10 분 각각 PBS로 세 번 설거지. </li><li> 1 시간 동안 자외선에 노출하여 요리를 소독. silanized 요리는 상온에서 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 추적 입자로 3D 콜라겐 젤의 준비 <ol><li> 5 분 15,000 rpm으로 원심 분리기의 주식 추적 입자 (10 10 입자 / ML) 100 μl를 회전하여 형광 추적 입자를 워시, 액체를 대기음, 미디어 500 μl를 추가합니다. 5 번 반복합니다. 마지막으로 세척 후, 미디어 30 μl에 resuspend 입자. </li><li> 평소처럼 표현 GFP 세포를 Trypsinize. </li><li> 약 2 × 10 6 세포 / ML로 Resuspend 세포 펠릿. </li><li> eppendorf 튜브로 성장 미디어 피펫 240 μl. </li><li> 1M Hepes의 12.6 μl, 여과 물 20 μl, 세포 용액 50 μl 후, 형광 입자의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 마지막으로, 소 진피의 콜라겐 전 용액 (1 MG / ML의 작업 농도를 얻기 위해)의 167 μl를 추가합니다. </li><li> 철저 솔루션을 섞어 다음 silanized 유리 바닥 접시의 유리 부분에 솔루션의 80 μl를 피펫. </li><li> 장소 인큐베이터에 요리와 젤, 37에서 중합 수 있도록 ° C 30 분. p35 유리 바닥 접시에있는 전형적인 콜라겐 젤에 대한 그림 1A를 참조하십시오. </li><li> 각각의 접시에 신중하게 성장 미디어 2 ML을 추가합니다. </li></ol> 4. 시간 저속 이미지 수집을위한 절차 <ol><li> 현미경 인클로저의 온도 제어의 전원을 켜고 37 ° C.에 범위 챔버가 안정 상태의 온도로 평형하자 라이브 세포 이미징 시스템의 예를 들어 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 중성 산도를 유지하는 25 밀리미터 Hepes와 보충의 새로운 미디어로 미디어를 변경합니다. 에DIC 이미지, 유리 톱을 가지고 하나와 접시의 교환 상단. parafilm의 얇은 스트립을 사용하여 미디어 증발을 방지하기 위해 접시의 측면을 다룹니다. </li><li> 기름 침지 목적은 목적에 침지 액 한방울을 넣으십시오. </li><li> 현미경 스테이지에 접시를 포함하고있는 콜라겐 젤 장소, 요리 침지 액체와 접촉하게 있는지 확인하십시오. </li><li> 샘플 및 이미지에 관심이 세포에 대한 검색 중점을두고 있습니다. 무대 드리프트를 최소화하기 위해 요리 긴 캡처를 시작하기 전에 약 45 분 동안 정착하실 수 있습니다. </li><li> 이미지 수집의 매개 변수를 지정합니다. modulating 레이저 파워, 노출 시간, 주파수 및 캡처 시간의 기간에 의해 세포가 손상될 수 레이저 노출을 최소화합니다. 실제 매개 변수는 현미경 시스템과 세포 유형과 다릅니다. </li><li> 시간 경과 수집하는 동안 억제제는 추가할 수 있습니다. 억제제 추가 실험, parafilm으로 접시를 봉인하지 않습니다. <ol><li> 준비하다Hepes는 원하는 작업 농도의 약물과 미디어를 보충하고 있습니다. </li><li> 미디어, 일시 정지 이미지 캡처에 약물을 추가하고 조심스럽게 접시를 방해하지 않고 접시 상단을 제거하면 준비 완료. </li><li> 접시에있는 미디어를 대기음, 그리고 그릇에 미디어를 포함하는 마약을 피펫. 그런 다음, 접시 위로 조심스럽게를 교체하십시오. </li><li> 샘플 수 뉴 미디어의 추가로 인해 밖에서 초점, 초점을 다시 조정. </li><li> 캡처를 다시 시작한 후, 다음 30 분 동안 캡처를 모니터링하고, 필요에 따라 초점을 다시 조정. 약물 또한 실험의 예를 들어 그림 4를 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 5. FRAP 절차 및 분석 <ol><li> FRAP 설치 프로그램은 시스템 사이에 제조 업체의 지침을 따라 다릅니다. </li><li> 라이브 세포 이미징을위한 매개 변수를 설정합니다. </li><li> photobleaching에 대한 매개 변수를 설정합니다. 세포를 손상하지 않고 형광 신호를 photobleach 충분한 레이저 파워를 사용합니다. 이 액면을 테스트연습 세포에 ameters. </li><li> 이미지 캡처를 시작하고 관심 영역을 photobleaching하기 전에 이미지 캡처의 적어도 5 프레임을 수 있습니다. </li><li> 캡처 계속 및 복구 시간은 전체 형광 복구를 캡처하기에 충분해야합니다. FRAP 실험의 예를 들어 그림 5를 참조하십시오. </li><li> photobleached 지역의 평균 형광 강도 (이전과 photobleaching 후) 시간이 지남에 따라 측정하여 형광 복구를 분석합니다. 통계 분석 소프트웨어 (예 : 엑셀)를 사용하여 지수 방정식에 복구 곡선에 맞게 : I = I F (1 - E - 캐럿), 내가 F의 최종 강도이며, 강도이고, t는 시간이며, τ ½이 절반 최종 값에 도달하는 농도에 대한 걸리는 시간입니다 τ ½ = 에선 (2) / K. 하프 타임은 단백질의 이동성의 속도를 측정하기위한 한 방법입니다. </li><li> 매개 변수, 하프 타임 및 지수 - 맞게 곡선의 최종 강도를 얻을 수 있습니다. 일을 계산초기 형광 농도에 최종의 비율을 복용하여 전자 모바일 분수. </li></ol> 6. 대표 결과 매트릭스 내에서 건강한 상피 세포의 살아있는 세포 이미징의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 건강하지 못한 세포가 종종 중단 막, 그리고 vacuoles의 과도한 번호 반면 건강한 세포는 부드럽고, 지속적인 멤브레인, 그리고 독특한 핵을 나타냅니다. 3D 매트릭스에서 하나의 상피 세포는 1 마이 그 레이션하고, 며칠에 걸쳐, 상피 세포의 매트릭스 2 시간 입체, 구형, 다중 세포 cysts를 형성하고 있습니다. 세포는 매우 동적이며, 낭종 (그림 3) 이내에 마이 그 레이션. 마이 그 레이션 세포 끼쳤다 견인 세력의 결과로 매트릭스 변형은 주변 행렬 (그림 4)에 포함된 추적 입자의 변위를 분석합니다. 추적 입자의 움직임은 다릅니다 최대 투사 이미지로 표시됩니다엔트 시간 점, 각 시점의 시간 (그림 4B)을 표시하는 의사 색입니다. 또는 개별 추적 입자의 이미지는 시간이 지남에 따라 추적 입자 (그림 4C)의 움직임을 보여주는 몽타주로 표시됩니다. 모든 이미지 분석 ImageJ를 사용하여 이루어졌다. 매트릭스 변형 이러한 질적 평가는, 따라서 마이 그 레이션 세포 끼쳤다 세력은 트랙션 힘의 분포의 유용 첫번째 근사치입니다. 3D로 마이 그 레이션 세포 끼쳤다 견인 세력의 양적 평가는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다 등에서 3,4 설명되어 있습니다. 실험을 photobleaching 후 전형적인 형광 복구는 그림 5에 표시됩니다. 관심 지역은 건강하고 손상되지 않은 세포를 유지하면서 형광 강도가 가시, 배경 수준 (신호 대 잡음 비율을 극대화하기)에 비해 감소되도록 최적의 레이저 설정을 사용 photobleached해야합니다. 최적의 설정은 B한다각 FRAP 설정이 다른이므로 E는 경험적으로 결정 (예, FRAP를 사용하여 레이저를 스캐닝 공촛점 시스템). 포스트 FRAP 이미지 수집의 노출 시간 간격은 신중하게 배경 photobleaching을 피하기 위해 제어해야합니다. 낮은 레이저 파워, 짧은 노출 시간 및 민감한 카메라의 사용과 높은 효율적인 광학의 사용은 높은 품질의 FRAP 이미징을 위해 필수적입니다. 이미지 수집 중 표백 형광이 중요한 경우이 배경 페이딩은 계량 및 관찰 형광 강도 복구에서 정상화해야합니다. 환경의 3D 특성으로 인해, 형광 강도 복구의 Z - 구성 요소가 상당한 될 수 있습니다. 따라서, photobleached 지역의 전후 3D - 스택 이미지를 복용하여 photobleached 볼륨을 정의하는 것이 중요합니다. 또한 분석 및 형광 회복의 모델링은 다른 5,6 설명되어 있습니다. 라이브 세포 이미징 t의 독​​특한 조합echniques : GFP 매트릭스 변형 및 억제제의 추가를 모니터 cytoskeletal 단백질, 빨간색 형광 추적 입자의 역학에 따라이 단백질 역학, 견인 강제 및 분자 경로의 분석을 위해 동시에 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> 그림 1. 콜라겐 젤의 작성. 유리 바닥 접시에) Polymerized의 콜라겐 매트릭스. 젤의 핑크 색상이 포함된 형광 입자에 의한 것입니다. B) 절차 유리 표면에 콜라겐 젤 crosslink하는 유리 바닥 요리를 취급합니다. 첫째, 유리 바닥 요리는 3 Aminopropyltrimethoxysilane 솔루션, 유리 콜라겐 매트릭스를 crosslinks 후 글루 타 알데히드 솔루션으로 처리됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> 그림 2. FRAP / 공촛점 현미경 설정의 설계도. 공촛점현미경은 CoolSnap HQ II CCD 카메라와 자이스 혈구 AxioObserver에 따라 완전히 Slidebook 소프트웨어 (지능형 이미징 혁신)에 의해 자동으로 진행됩니다. 공촛점 단위 맞춤 설계되었습니다 두 레이저 사이를 전환할 밀리초를 허용하도록 Yokogawa 회전 디스크 장치 CSU10 및 음향 광학 조정할 수있는 필터 (AOTF) 두 고체 레이저 (50 MW 40 MW와 561 nm의와 488 nm의)에 따라. 방출 필터 (# 118661과 # 118085, 채도 기술) 50분의 525 NM 및 60분의 620 NM하고 이색성 거울 488-568 BrightLine 듀얼 밴드 (Semrock)입니다. 목표는 NA 1.1 및 0.62 mm의 작동 거리와 긴 작동 거리 40x C - 고차 색지움 목표 및 NA 1.4와 63x 계획 - 고차 색지움 목표 및 0.19 mm의 작동 거리입니다. 현미경은 광학 섬유 염료 레이저, 컴퓨터 제어 빔 위치와 강도, 그리고 회절 제한된 장소의 크기를 펌핑 구성되어 FRAP의 photoablation 시스템을 포함하고 있습니다. 또한 현미경을 갖추고있다각 축에 0.1 미크론 선형 인코더를 포함 XY 전동 무대. 시간 경과 이미징 동안 환경 온도 맞춤 설계된 현미경 챔버 및 피드백 온도 제어 히터에 의해 유지됩니다. 모든 소음 및 진동을 분리하려면 전체 현미경 시스템은 진동이없는 테이블에 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> 그림 3. GFP - 굴지 표현 상피 세포의 세포 이미징을 살고 있습니다. 이러한 세포는 3D 콜라겐 매트릭스에 문화 4 일 후에 낭종을 형성. 다른 낭종의 내부 (빨간색 화살촉) 내에서 마이 그 레이션하는 동안 일부 세포가 낭종 (노란색 화살촉)의 표면을 따라 이동합니다. 스케일 바 10 μm의, 시간 시간. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> 그림 4. 트랙션위원회에서 Rho - 키나제의 효과가 억제. G을 표현하는 마이 그 레이션 MDCK 세포) DIC 이미지FP는 핵 마커 태그. 이미지는 Rho - 키나제 억제제 Y - 27632의 치료 직전 찍은 거예요. 스케일 바 10 μm의. B) 입자 변위는 Y - 27632의 추가로 인한. 다양한 시간 포인트 (0-52 분)에있는 입자의 위치는 강도 규모에 따라 의사 색의했고 다음 하나의 이미지에 투영. 흰색 영역은 마이 그 레이션 세포에있는 GFP 긍정적인 핵이다. 스케일 바 10 μm의. 분 시간. 세포의 후행 가장자리 C) 입자 운동 (B의 화살표 참조). 별표 Y - 27632 또한 이전에 캡처된 마지막 프레임을 나타냅니다. 추적 입자는 각각 방향과 거리에서 마이 그 레이션하기 전에 세포의 후행 가장자리와 Y - 27632의 추가 이후에 옮겼습니다. 스케일 바 1 μm의. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> 그림 5. 3 차원 매트릭스의 세포 마이 그 레이션을 표현 GFP - 굴지의 FRAP 분석. 의) Timelapse 이미지 GFP -굴지의 ph​​otobleaching 전후의 세포를 표현. 휴대폰 뒤쪽에 축적된 GFP - 굴지의 작은 지역은 timepoint 0 (빨간색 화살촉) photobleached되었습니다. 시간 (초), 스케일 바 5 μm의. B) photobleached 지역 (실선)과 형광 복구 (원)의 기하 급수적인 적합의 평균 형광 강도는 시간이 지남에 꾸몄다. 형광 강도는 photobleaching 전에 초기 값을 정상화되었습니다.

<ol><li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li>
<li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li>
<li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li>
<li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
<li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기서 우리는 3 차원 매트릭스의 세포 이주의 메커니즘을 연구 라이브 세포 이미징을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 성공은 안정적으로 GFP - 태그 단백질을 표현하는 &quot;좋은&quot;클론을 얻는 방법에 따라 달라집니다. GFP 단백질의 낮은 수준이 너무 높은 GFP 레벨 셀에 바람직하지 않은 부작용이되지만, 세포의 건강을 위태롭게 할 여분의 자극에 노출이 필요합니다. 따라서 세포에 유전자를 transfect하는 벡터 선택 (예 : 발기인, 형광 태그 등) 중요합니다. 적색 형광 단백질 (RFP) 7,8 포함하여 GFP, 이외의 많은 형광 태그가 있습니다. 이러한 단백질 태그는 특정 여기 빛의 파장과 형광 필터 따라서 다른 집합이 필요합니다. 또한, 다른 항생제 내성 유전자 (예, G418, hygromycin, puromycin 등)도 가능하며 안정적인 클론을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 라이브 세포 이미징을위한, transientl...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 콜라겐은 소, 전을 입력합니다 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,231 </td><td> 주식 3 MG / ML에 관한 </td></tr><tr><td> 3 aminopropyltrimethoxysilane </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 281,778 </td><td> 물에 희석 </td></tr><tr><td> 글루 타 알데히드 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 340,855 </td><td> PBS에 희석 </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres의 폴리스티렌 microspheres 1 μm의 빨강, 형광 (605분의 580) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></TR&gt; <tr><td colspan="4"> 문화 미디어 구성 요소 : </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

전통적으로, 세포 마이 그 레이션은 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에서 연구되었습니다. 그러나, 상처 치료, 조직 재생 및 암 전이 중요한 생물 학적 과정 동안 세포는 복잡한, 3 차원 세포 조직을 통해 이동해야합니다. 더 나은 이러한 생물 학적 과정의 배후 메커니즘을 이해하기 위해서는 세포 마이 그 레이션을 운전을 담당하는 단백질의 역할을 검토하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 상피 세포 라인을 (MDCK)를 사용하여 셀 마이 그 레이션의 메커니즘을 연구하기위한 프로토콜을 개요 및 모델 시스템으로 3 차원, 섬유, 자기 polymerizing 매트릭스. 이 광학 명확 세포외 매트릭스는 라이브 세포 이미징 연구에 쉽게 의무가 있으며, 더 좋은 방법은 생리, 부드러운 조직 환경을 모방한 것이었 지요. 이 보고서는 직접 단백질 현지화 및 역학을 시각에 대한 기술, 그리고 주변의 세 차원 매트릭스의 변형을 보여줍니다. 시험세포 공정 중에 단백질 현지화 및 역학 ination 단백질의 기능에 중요한 통찰력을 제공합니다. 유전자 인코딩 형광 태그는 단백질 현지화 및 역학을 관찰에 대해 고유한 방법을 제공합니다. 이 기법을 사용하여 우리가 키 subcellular 축적을 분석할 수, 강제로 생성 매트릭스를 통해 세포 기동으로 실시간으로 cytoskeletal 구성 요소를. 또한, 서로 다른 파장 여러 형광 태그를 사용하여, 우리는 따라서 우리는 서로 다른 단백질이 비슷하거나 분기하는 역할을 가지고 있는지, 예를 들어, 테스트 수 있도록, 동시에 여러 단백질의 지방화를 검사할 수 있습니다. 또한, 찬란 태그 단백질의 역학은 (FRAP) 분석을 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하여 계량하실 수 있습니다. 이 측정 assays는 단백질 이동성과 방법을 안정적으로 단백질을 구속은 cytoskeletal 네트워크에 있습니다. 단백질 기능 억제제의 치료와 함께 라이브 세포 이미징을 결합함으로써,우리는 단백질과 마이 그 레이션 세포의 형태의 배포판에 실시간으로 변경 확인할 수 있습니다. 또한, 우리는 셀 마이 그 레이션하는 동안 행렬 변형을 시각화하기 위해 매트릭스 내에 포함된 형광 추적 입자의 사용과 라이브 세포 이미징을 결합하여. 따라서, 우리는 마이 그 레이션 세포는 강제로 생성 단백질을 배포하는 방법 시각화 수 있으며, 어디 견인 세력은 주변 매트릭스 끼쳤다 있습니다. 이러한 기술을 통해, 우리는 세포 이주의 메커니즘에 특정 단백질과 공헌의 역할에 가치있는 통찰력을 얻을 수 있습니다.

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

전통적으로 세포 이동은 2차원의 딱딱한 플라스틱 표면에서 연구되어 왔습니다. 하지만 상처 치유와 같은 중요한 생물학적 과정 동안...

본 시연의 목적은 3D 매트릭스 내의 살아있는 세포에서 형광 표지된 단백질을 이미징하는 것입니다. 먼저, 형광 표지된 단백질을 발현하는 안정적 세포주를 생성합니다. 이 세포들을 3D 콜라겐 매트릭스에 파종한 다음, 공초점 현미경을 사용하여 이동하는 세포의 타임랩스 이미지를 획득합니다.궁극적으로, 타임랩스 이미징과 형광 단백질(FP) 분석을 통해 이동하는 세포 내 단백질의 위치와 역동성을 규명함으로써, 3D 및 실시간으로 단백질의 역동성과 국소화를 관찰할 수 있습니다. 이는 세포 이동에 관한 근본적인 질문을 해결하는 하나의 방안을 제공합니다. 예를 들어, 세포질 단백질에 의해 접착 접점이 어떻게 조절되는가와 같은 질문이 이에 해당합니다.또한, 이러한 접촉이 특정 억제제에 의해 어떻게 교란되는지도 확인합니다. P 35 디쉬에서 세포를 80~90% 밀도로 배양하고, 제조사의 지침에 따라 lipo 2000을 사용하여 목적 플라스미드를 세포에 형질전환합니다. 그런 다음 세포를 배양기에 넣습니다.다음 날, 세포를 두 개의 P10 50 Petri dish에 나누어 담고 하룻밤 동안 배양합니다. G418 50 µg/mL을 추가하여 배지를 보충합니다. 2주 동안 항생제 선택 배양을 지속합니다.배양물을 확인하여 G four 18 내성 콜로니를 검사합니다. 그다음, 도립 형광 현미경을 사용하여 GFP 양성 콜로니를 식별하고 표시합니다.PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 표시된 각 콜로니가 건조되는 것을 방지하기 위해 얇은 액체 층을 남겨둡니다. 멸균된 면봉을 사용하여 가장자리 주변을 최대한 밀착하여 닦아내고, 콜로니 위에 trypsin 10 µL를 피펫으로 분주합니다.모든 콜로니에 대해 신속하게 반복하십시오. 그 후, 세포 분리를 위해 플레이트를 37 °C에서 배양합니다. 현미경 하에서 둥근 외형을 확인하십시오.각 콜로니에 10 µL의 trypsin을 가하고, 피펫팅하여 세포를 플레이트에서 완전히 분리하십시오. 그 다음, 안정적인 콜로니를 증식시키기 위해 각 세포 콜로니를 24-well dish 배양 접시의 개별 웰로 옮기십시오. 이어서, 표준 western blot 및 면역형광법을 사용하여 콜로니의 단백질 발현을 평가하십시오.선택한 세포주를 배양하고 유리의 표면 개질을 수행합니다. 바닥 접시는 최적의 콜라겐 결합을 제공합니다. 10 millimeter 개구부가 있는 각 P 35 접시의 유리 부분에 300 µL의 실릴화 용액을 피펫으로 분주합니다.실온에서 1시간 동안 배양합니다. 용액을 흡입하여 제거하고, 여과수로 10분씩 3회 세척합니다. 물을 제거하고 접시를 50 °C 핫플레이트 위에 1.5시간 동안 둡니다.건조를 위해 디쉬 뚜껑을 약간 어긋나게 배치합니다. 건조된 디쉬가 식으면 각 디쉬의 유리 부분에 2% glutaraldehyde 용액 300 µL를 피펫으로 분주합니다. 1시간 동안 배양한 후, PBS로 10분씩 3회 세척합니다.디쉬를 1시간 동안 UV 광선에 노출시켜 멸균합니다. 먼저 원심분리를 통해 100 µL의 형광 추적 입자를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 입자를 500 µL의 배지에 재현탁합니다.5회 세척한 후, 입자를 30 µL의 배지에 다시 현탁합니다. 다음으로, 트립신을 사용하여 GFP 발현 세포를 수확하고, 이노르 튜브(einor tube)에 mL당 200만 개의 세포 현탁액을 준비합니다. 성장 배지 240 µL를 피펫으로 취합니다. 여기에 1 M HEPES 12.6 µL, 여과수 20 µL, 세포 용액 50 µL, 그리고 형광 입자 10 µL를 추가합니다.마지막으로, bovine dermis collagen 167 µL를 추가하고 솔루션 믹스를 충분히 혼합합니다. 이제 준비된 siloized dish의 유리 부분에 80 µL를 옮깁니다. 겔이 중합될 수 있도록 37 °C에서 50분 동안 배양합니다.그런 다음 성장 배지 2 mL를 조심스럽게 추가합니다. 현미경 챔버를 37 °C의 안정된 상태 온도로 평형화하고 세포 배지를 보충합니다. DIC 이미징을 위해 중성 pH를 유지하려면, 파라폼 얇은 스트립이 부착된 유리 덮개로 디쉬의 상단을 교체하십시오.오일 침전 렌즈를 사용할 때 증발을 방지하기 위해 디쉬의 측면을 덮습니다. 대물렌즈 위치에 침전액 한 방울을 떨어뜨립니다. 디쉬가 담긴 콜라겐 겔을 현미경 스테이지 위에 올려 디쉬가 침전액과 접촉하도록 합니다.스테이지 드리프트를 최소화하기 위해 샘플의 초점을 맞추고 이미징할 관심 세포를 찾습니다. 디시가 안정될 때까지 약 45분 동안 둡니다. 장시간 캡처를 시작하기 전에 억제제 첨가 실험을 위한 이미지 획득 파라미터를 지정하십시오.원하는 최종 농도로 약물이 첨가된 보충 배지를 준비합니다. 중성 pH를 유지하기 위해 세포 배지를 보충하되, 퍼필(perfil)로 밀봉하지 마십시오. 샘플을 현미경으로 옮기고 약물 처리 시점에 맞춰 이미징을 진행합니다.이미지를 일시 정지하고, 디시를 건드리지 않은 상태에서 조심스럽게 디시 덮개를 캡처하여 제거합니다. 배지를 흡입하고 약물이 포함된 배지를 디시에 피펫으로 분주합니다. 그런 다음 조심스럽게 디시 덮개를 다시 닫습니다.최적의 FRAP 설정은 시스템마다 다릅니다. 따라서 제조사의 지침서를 참조하십시오. 먼저 살아있는 세포 이미징을 위한 파라미터를 설정합니다.광퇴색(photobleaching)을 위한 단계입니다. 연습 세포에서 이러한 파라미터를 테스트하여 세포를 손상시키지 않으면서 형광 신호를 광퇴색시킬 수 있는 충분한 레이저 강도를 확보하십시오. 그런 다음, 최소 5프레임을 획득하여 샘플의 이미지 캡처를 시작하십시오.그런 다음 관심 영역을 광퇴색시킵니다. 회복 시간 동안 계속해서 캡처합니다. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 광퇴색 전후의 광퇴색 영역의 평균 형광 강도를 시간에 따라 측정합니다.회복 곡선을 지수 방정식에 맞춥니다. 지수 피팅 곡선으로부터 반감기와 최종 강도에 대한 파라미터를 구합니다. 그런 다음 초기 형광 강도 대비 최종 형광 강도의 비율을 통해 이동 분율(mobile fraction)을 계산합니다.이 3D 생세포 이미지들은 GFP actin을 발현하는 건강한 상피 세포들을 보여줍니다. 4일간의 배양 후, 이 세포들은 3D 콜라겐 매트릭스 내에서 낭종을 형성했습니다. 일부 세포는 낭종의 표면을 따라 이동했으며, 다른 일부 세포들은 낭종 내부에서 이동했습니다.이동하는 세포가 가하는 견인력으로 인한 매트릭스 변형은 주변 매트릭스에 내장된 추적 입자의 변위 분석을 통해 측정됩니다. 여기에서는 RO kinase 억제가 견인력에 미치는 영향이 나타나 있습니다. 추적 입자의 움직임은 서로 다른 시점의 최대 투영 이미지로 표시되며, 각 시점은 유사 색상으로 구분되어 있습니다.또는, 개별 추적 입자의 이미지를 몽타주 형태로 표시하여 추적 입자의 움직임을 보여줍니다. 시간이 지남에 따라, 이 추적 입자는 Y 2 7 6 3 2 첨가 전후로 각각 이동하는 세포의 후방 가장자리 쪽으로 가까워졌다가 멀어졌습니다. FRAP 분석은 3차원 매트릭스 내에서 이동하는 GFP actin 발현 세포를 추적하여 전형적인 형광 회복을 나타냅니다. 최적화된 레이저 설정으로 광퇴색 실험을 수행한 후, 세포의 건강과 손상 없는 상태를 유지하면서 관심 영역의 형광 강도가 배경 수준에 비해 눈에 띄게 감소합니다.이 그래프는 지수 함수를 이용한 회복 곡선의 적합도를 보여줍니다. 숙련되면 매트릭스에 세포를 파종하는 데 한 시간이 소요될 수 있습니다. 3-아미노프로필 트리메틸실란(three amino propyl trimethyl)을 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.따라서 화학 흄 후드 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취하십시오. 또한 3D 매트릭스 내에서 세포를 다룰 때는 무균 상태를 유지해야 함을 기억하십시오.

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

입체 세포외 매트릭스에 종양 세포 침공의 모델이 더...

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

이 문서는 찬란 추가 수정 및 3D 세포 배양의 라이브 영상 모두에 사용할 수 있습니다 콜라겐 레이블을하는 방법을 제시한다. 우리는 또한 3D 환경에서 배양 세포의 내생 세포 골격 단백질을 시각화하기 위해 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.

3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

세포 이식, 세포골격 라벨링 및 기능 손실/이득 접근법을 결합한 이 프로토콜은 생체 내 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 분석하기 위해 이동하는 제브라피시 전향 prechordal plate를 사용하는 방법을 설명합니다.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

배우세요 3D 콜라겐 매트릭스에서 이동하는 살아있는 세포의 형광 표지 단백질 라이브 이미징 기법을 통해 단백질 역학과 세포 이동 메커니즘을 실시간으로 관찰하는 방법을 익히세요.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

더 많은 동영상 탐색