3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

이 시연은 3D 매트릭스에서 살아있는 세포의 형광 태그가 지정된 단백질을 이미지화하는 것을 목표로 합니다. 먼저, 형광 표지된 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 생성합니다. 이러한 세포를 3D 콜라겐 매트릭스에 시딩한 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 이동하는 세포의 타임 랩스 이미지를 획득합니다.

궁극적으로, 결과는 타임 랩스 이미징 및 FP 분석을 통해 이동 세포 내의 단백질 국소화 및 역학을 조명하고 단백질 역학 및 국소화를 3D 및 실시간으로 관찰합니다. 세포 이동에 대한 근본적인 질문을 해결할 수 있는 한 가지 방법을 제공합니다. 예를 들어, 접착 접촉은 세포질 단백질에 의해 어떻게 조절됩니까?

또한 이러한 접촉은 특정 억제제에 의해 어떻게 교란됩니까? P 35 접시에서 80 - 90% co의 유창성 배양 세포는 제조업체 지침에 따라 lipo 2000을 사용하여 관심 플라스미드로 세포를 transfection합니다. 그런 다음 세포를 인큐베이터에 넣습니다.

다음 날, 세포를 두 개의 P one 50 페트리 접시로 나누고 밤새 배양합니다. G four 18의 밀리리터당 50마이크로그램을 추가하도록 미디어를 보충합니다. 2주 동안 항생제 선별 하에 배양을 계속합니다.

G 4개의 18 저항성 군체에 대한 배양을 조사합니다. 그런 다음 도립 형광 현미경을 사용합니다. GFP 양성 콜로니를 식별하고 표시합니다.

PBS로 세포를 두 번 씻습니다. 두 번째 세척 후에는 표시된 각 콜로니에 대해 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 얇은 액체 층을 남겨 둡니다. 멸균된 면봉과 피펫으로 가장자리 주위를 최대한 가깝게 닦고 10마이크로리터의 트립신을 식민지에 피펫합니다.

모든 콜로니에 대해 신속하게 반복합니다. 그런 다음 세포 분리를 위해 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 현미경으로 둥근 모양을 확인합니다.

각 콜로니에 10마이크로리터의 트립신을 추가하고 피펫을 추가하여 플레이트에서 세포를 완전히 분리합니다. 그런 다음 각 세포 콜로니를 24웰 접시 배양의 단일 웰로 옮겨 안정적인 콜로니를 증폭합니다. 다음으로, 표준 웨스턴 블롯(western blot)과 면역형광(immunofluorescence)을 사용하여 콜로니(colony)의 단백질 발현을 평가합니다.

선택한 세포주를 확장하여 유리의 표면 변형을 수행합니다. 바닥 접시는 최적의 콜라겐 결합을 제공합니다. 300마이크로리터의 사일로화 용액을 10mm 개구부가 있는 각 P 35 접시의 유리 부분에 피펫팅합니다.

실온에서 1시간 동안 배양합니다. 용액을 흡입하고 여과된 물로 각각 10분씩 3회 세척합니다. 물을 제거하고 섭씨 50도의 핫 플레이트에 접시를 1.5시간 동안 놓습니다.

건조를 위해 접시에서 약간 떨어진 접시 상단을 배치하십시오. 건조 접시를 피펫으로 식힌 후 각 접시의 유리 부분에 300 마이크로 리터의 2 % 글루 타르 알데히드 용액을 식히십시오. 1시간 동안 배양한 다음 PB S3로 10분씩 세척합니다.

1시간 동안 자외선에 노출시켜 식기를 살균합니다. 첫 번째 펠릿 : 원심 분리에 의한 100 마이크로 리터의 형광 추적기 입자. 액체를 버리고 500마이크로리터의 매체에 입자를 재현탁합니다.

5회 세척을 수행한 다음 입자를 30마이크로리터의 매체에 다시 부유시킵니다. 다음으로, 트립신을 사용하여 GFP 발현 세포를 수확하고 밀리리터당 200만 개의 세포를 현탁액으로 240마이크로리터의 성장 배지 피펫에 넣습니다. 12.6마이크로리터의 1몰 힙, 20마이크로리터의 여과수, 50마이크로리터의 세포 용액 및 10마이크로리터의 형광 입자를 추가합니다.

마지막으로, 167 마이크로 리터의 소 진피 콜라겐, 하나의 솔루션 혼합 용액을 철저히 첨가하십시오. 이제 80 마이크로 리터를 준비된 사일로 화 된 접시의 유리 부분에 옮깁니다. 겔이 중합될 때까지 섭씨 37도에서 50분 동안 배양합니다.

그런 다음 조심스럽게 2ml의 성장 배지를 추가합니다. 현미경 챔버를 섭씨 37도의 정상 상태 온도로 평형을 이루고 세포 배지를 보충합니다. DIC 이미징을 위해 중성 pH를 유지하려면 접시 상단을 얇은 파라폼 스트립이 있는 유리 상단으로 교체합니다.

오일 이멀젼 목표를 위해 증발을 방지하기 위해 접시의 측면을 덮습니다. 대물렌즈 위치에 침지 유체 한 방울을 떨어뜨립니다. 접시가 담긴 콜라겐 젤은 현미경 스테이지에 접시가 침지 액체와 접촉하도록 합니다.

샘플에 초점을 맞추고 이미징할 관심 세포를 검색하여 스테이지 드리프트를 최소화합니다. 접시가 약 45분 동안 가라앉을 때까지 기다립니다. 긴 캡처를 시작하기 전에 억제제 추가 실험을 위한 이미지 획득의 매개변수를 지정합니다.

원하는 작업 농도의 약물로 보충된 배지를 준비합니다. 중성 pH를 유지하기 위해 세포 배지를 보충하되 perfil로 밀봉하지 마십시오. 샘플을 현미경으로 옮기고 약물 치료 시 이미징을 진행합니다.

이미지를 일시 중지하고 접시를 방해하지 않고 접시 상단을 캡처하고 조심스럽게 제거합니다. 배지를 흡입하고 배지가 포함된 약물을 접시에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 접시를 조심스럽게 교체하십시오.

상단 프라프 설정은 시스템마다 다릅니다. 따라서 제조업체의 지침을 참조하십시오. 먼저 살아있는 세포 이미징을 위한 매개변수를 설정합니다.

광표백용. 실습 세포에서 이러한 매개변수를 테스트하여 세포를 손상시키지 않고 형광 신호를 광표백할 수 있는 충분한 레이저 출력을 얻습니다. 다음으로, 최소 5개의 프레임을 획득하는 샘플에서 이미지 캡처를 시작합니다.

그런 다음 관심 영역을 광표백합니다. 복구 시간 동안 계속 캡처합니다. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 따라 광표백 전후의 사진 표백 영역의 평균 형광 강도를 측정합니다.

회복 곡선을 지수 방정식에 맞춥니다. 지수 피팅 곡선에서 하프타임과 최종 강도에 대한 파라미터를 구합니다. 그런 다음 최종 형광 강도와 초기 형광 강도의 비율을 취하여 이동 분획을 계산합니다.

이 3D 살아있는 세포 이미지는 GFP 액틴을 발현하는 건강한 상피 세포를 보여줍니다. 4일간의 배양 후, 이 세포들은 3D 콜라겐 매트릭스에 낭종을 형성했습니다. 일부 세포는 낭종의 표면을 따라 이동했고 다른 세포는 낭종 내부로 이동했습니다.

이동하는 세포에 의해 가해지는 견인력의 결과로 발생하는 매트릭스 변형은 주변 매트릭스에 내장된 추적 입자의 변위를 통해 분석됩니다. 견인력에 대한 RO 키나아제 억제의 효과는 다음과 같습니다. 추적 입자 이동은 서로 다른 시점의 최대 투영 이미지로 표시되며 각 시점은 의사 색상으로 표시됩니다.

또는 개별 추적 입자의 이미지를 몽타주로 표시하여 추적 입자의 움직임을 보여줍니다. 시간이 지남에 따라 이 추적 입자는 Y 2 7 6 3 2가 각각 추가되기 전과 후에 이동하는 세포의 후미 가장자리를 향하거나 멀어졌습니다. frap 분석은 GFP 액틴을 발현하는 세포가 3차원 매트릭스에서 이동할 때 일반적인 형광 회복을 나타내는 세포를 따릅니다.최적화된 레이저 설정에서 광 표백 실험 후 관심 영역의 형광 강도는 백그라운드 수준에 비해 눈에 띄게 감소하면서 건강하고 손상되지 않은 세포를 유지합니다.

이 그래프는 지수 함수를 사용한 회복 곡선의 적합도를 보여줍니다. 일단 숙달되면 매트릭스의 세포를 시드하는 데 한 시간이 걸릴 수 있습니다. 3가지 아미노 프로필 트리메틸로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

따라서 화학 물질 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취하십시오. 또한 3D 매트릭스에서 세포로 작업할 때 멸균 상태를 유지하는 것을 잊지 마십시오.