Name: Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 배우세요 MALDI-TOF 질량 분석법을 활용한 Pak2 단백질 키나아제 활성화 시 수소/중수소 교환 분석 방법입니다. 이 기술은 단백질 구조 역학과 활성화 메커니즘 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 건강 부여 GM - 26738 국립 연구소 (잣하는)에서 일부 지원됩니다.

1. Pak2 활성화 <ol><li> 버퍼에 12 밀리그램 / ML Pak2 20 μl에 caspase 3의 적절한 사전 테스트 금액을 추가 (산도 7.5 50 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 2 MM의 DTT) 34시 품어 ° C를 30 분 완전히 다니엘과 활성화 Pak2 수 있습니다. </li><li> SDS - PAGE (10 %)과 Coommassie 푸른 얼룩에 의해 절단 제품을 분석합니다. </li><li> 20 μl 10 밀리그램 / ML Pak2의 최종 농도, pH를 7.5에서 (50 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 15 MM MgCl 2, 10 MM ATP) 활성화 버퍼 B에 죽습 Pak2를 추가, 34에서 부화 ° C 30 분에 대해 전적으로 8 사이트에서 autophosphorylation로 Pak2를 활성화합니다. </li><li> 로 SDS - 10 페이지에 의해 결정 p34과 p27 조각의 마이 그 레이션에 의해 Pak2의 전체 절단을 확인합니다. autophosphorylation 조건 적절한 검증 phosphopeptides를 감지할 수 (32 P) ATP 또는 질량 분석계를 사용하여 별도의 실험에서 autoradiography를 통해 이루어집니다. </li></ol> 2. 신분증의 펩신 - 소화 Pak2 파편 <ol><li> 사용하기 전에 두 번 아가로 오스 비즈를 씻어 산도 2.5에서 0.1 % Trifluroacetic 산성 (TFA) 1 ML을 추가합니다. 그런 다음 비즈를 제거하는 2,000 XG에 15 초를위한 샘플을 원심. </li><li> 0.1 % TFA 100 μl에 Pak2 (150 MM NaCl 2 μl 20 μg, 산도 7.5 50 MM 트리스 - HCL 2 MM의 DTT)을 추가하고 펩신 - 복합 아가로 오스 비즈 30 μl로 5 분 샘플을 품어 . </li><li> 산도 2.5에서 0.1 %의 TFA의 기본 용매 시스템에 반대 위상 HPLC C18 컬럼을 평형. 0.2 ML / 분의 유량에서 0.1 % TFA를 포함하는 80 % acetonitrile - 펩신 소화 (50 μl)이 0 선형 100 분 그라데이션을 사용하여 eluted 있습니다. 분수는 매 2 분을 수집하고 있습니다. </li><li> (3 H) 속도 VAC와 HPLC의 분수를 건조하고 acetonitrile (5 μl)와 산도 2.5에서 0.1 % TFA (5 μl)의 솔루션에 샘플을 resuspend. </li><li> 처음에는 각 분획이 든 - TOF PerSeptive Biosystems 보이저 드 STR (PE 동성를 사용하여 펩티드를위한 검사입니다osystems, 포스터 시티, CA, 미국). </li><li> 펩티드를 포함하는 16 분수는 조각을 식별할 수있는 Q - TOF 질량 분석기와 QSTAR XL oMALDI MS / MS를 사용하여 탠덤 질량 분광법를 받게됩니다. </li><li> 각 펩타이드의 시퀀스 단백질 광부 웹사이트 (사용 Pak2의 기본 순서에 따라 이론적 M / Z 비율로 탠덤 질량 분광법에 의해 생성된 제품의 이온에 의해 확인 <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. 아미드 H / D 교환의 측정 <ol><li> 물 목욕 25에서 H / D 교환에 필요한 모든 솔루션 및 시약 ° C를 잡아. ATP는 물속에 녹아이며, 산도는 사용하기 전에 7.0으로 조정됩니다. D 2 O 버퍼에 추가 4mm짜리 ATP는 희석 후 Pak2에서 dissociated ATP를 방지하는 것입니다. </li><li> (20 μg 2 μl로 버퍼 D 2 O (50 MM의 맙스의 산도 6.98 125 MM NaCl) 18 μl를 추가하여 H / D 교환을 개시) 150 MM를 포함하는 버퍼 Pak2의 NaCl, 0 50 MM 트리스 - HCL (산도 7.5) 및 2 MM의 10 MG / ML의 Pak2 수준 결과 DTT, 및 7.0의 산도 ° C. </li><li> 0, 0.5, 1, 3, 5, 10 분, 또는 24 H.위한 H / D 교환 세중의에서 샘플을 품어 </li><li> 200 μl의 최종 볼륨에서 2.5 산도을 제공 산도 2.2에서 얼음처럼 차가운 0.1 % TFA 180 μl을 추가하여 H / D 교환 과정을 끄다. ATP, 산도 2.2에서 얼음처럼 차가운 0.11 %의 TFA 180 μl를 포함하는 샘플 침묵 상태에서 2.5에서 산도를 유지하는 데 사용됩니다. </li><li> 활성화된 펩신 - 복합 아가로 오스 비즈 30 μl 각 침묵 샘플의 나누어지는 (100 μl)를 추가합니다. 펩신의 소화 다섯 분 얼음 진행하는 허용되고 샘플은 매 30 초 vortexed 있습니다. </li><li> 4 5000 XG에 15 초를위한 시료의 원심 분리하여 소화를 종료할 ° C는 펩신을 제거합니다. </li><li> 신속하게 더 이상 둘 이상을 -80 ° C에서 액체 N 2와 저장소에 샘플을 동결든 - TOF 분석하기 전에 일. </li><li> 든에 대한 매트릭스는 5 밀리그램 / ML α - cyano - 4 - hydroxycinnamic acetonitrile, 에탄올과 pH를 2.5에서 0.1 %의 TFA의 솔루션 (1시 1분 1초)에 용해와 0 ° C.에서 개최되는 산 (CHCA)입니다 </li><li> 부분적으로 신속하게 각각의 샘플을 해동하고 4 ° C 든 대상 접시에 매트릭스와 현장 1 μl 각 샘플 1 μl를 섞는다. </li><li> 이전 든 - TOF 분석 30 초에있는 명소를 건조 판에 중간 진공을 적용합니다. 샘플 및 스펙트럼 검색의 해동 사이의 시간은 3 분 정도입니다. </li><li> PerSeptive Biosystems 보이저 드 STR과 함께 든 - TOF 질량 스펙트럼을 취득. 20000 - V 가속 전압 및 180 NS 펄스 지연과 지연 추출을 사용하여 65 % 그리드 전압, 100,000 데이터 채널에서 2 GHz의 샘플링 속도에서 데이터를 수집. 백 검사는 2 분 안에 평균입니다. 든 - TOF 장비는 모든 브랜드 또는 특정 소프트웨어에 한정되지 않습니다. </li><li> calcul에 데이터 Explorer 4.0을 컴퓨터 프로그램을 사용하여각 조각의 deuteration을 먹었어요. </li><li> N - 터미널 아미드 (그림 1)를 제외하고 백본 아미드있는 모든 가능한 교환 사이트 나눈 H / D 교환의 24 시간에서 실제 통합 deuteron 번호의 비율에 따라 다시 교환을 계산합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : caspase 절단 및 autophosphorylation은 SDS - PAGE Commassie의 얼룩에 의해 확인됩니다. 비활성 Pak2 58 kDa의 단일 밴드입니다. Pak2의 Caspase 절단이 완료되며, 별도로 마이 그 레이션이 조각, p27과 p34을 생산하고 있습니다. p27과 p34 autophosphorylated 보여주는 완전히 phosphorylated p27 조각 (그림 2)의 지진아 마이 그 레이션에 의한 겔에 중복의 마이 그 레이션. H / D 교환 실험은 0과 10 분, (그림 3) 사이를 여러 번 수행하고 있습니다. 예를 들어, M / zp에 중수소 설립의 시간 코스비활성 Pak2의 eak 1697.85는 같은 시간이 지남에 따라 대량 봉투의 변화에​​ 의해 나타난 여러 isotopic 봉우리로 구성되어 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> 그림 1. deuteration의 계산을위한 수식. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> 그림 2. Autophosphorylation과 Pak2의 caspase 절단. Caspase - 죽습 Pak2 (왼쪽 차선), 손상 비활성 Pak2 (중앙 차선)와 caspase - 죽습 autophosphorylated Pak2 (오른쪽 차선)는 SDS - PAGE와 Coommassie 푸른 얼룩에 의해 분석되었다. 수의, YH 외 2 적응. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> 그림 3. 비활성 Pak2에 대한 중수소 설립의 시간 코스의 질량 스펙트럼. 비활성 Pak2는 H / D excha를 받게되었다00-10 분 nge 및 든 - TOF로 분석했다. H / D 교환의 시간 코스 중에 최고 M / Z 1697.85의 든 - TOF의 확장 isotopic 배포판의 예제는 표시됩니다. 빨간색 점선은 대량 봉투의 평균을 나타냅니다하고 대량 봉투의 변화는 펩티드의 deuteration를 보여줍니다.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

펩신 - 소화 파편의 확인은 H / D 교환 실험의 중요한 단계입니다. 펩타이드의 잘못된 인식은 잘못된 결론으로​​ 이어질 수 있습니다. 펩신 - 소화 Pak2은 깨끗한 배경을 얻기 위해 반대 위상 HPLC C18 컬럼을 통해 eluted입니다. 우리의 실험에서 40 분수의 총 회수되었고 든 - TOF를 받게. 여러 개의 펩티드는 분수의 각 식별 수 있습니다. 펩티드들은 시퀀스를 식별하는 탠덤 질량 분광법 (Q - TOF MS / MS 및 oMALDI MS / MS)를 받게되었습니다. 펩타이드의 MS / MS 스펙트럼의 펩타이드의 신분을 확인하기 위해 적어도 세 제품 이온이 있어야합니다. 데이터 Explorer 4.0을 컴퓨터 프로그램 (응용 Biosystems)는 초기 기준 보정과 노이즈 여과를 수행합니다. 각 스펙트럼은 두 개의 봉우리 합성을 기반으로 보정해야합니다. 우리는 923.45과 1697.84있는 undeuterated M / Z의 이론적인 대량하여 스펙트럼을 보정. 티그는 교정 후 대량의 정확성은 10 PPM에 도달하실 수 있습니다. deuteration시 모노 동위 원소는 높은 미사로 이동됩니다. 이러한 M / Z 비율로 하나의 단계 증가 deuteration와 관련된 향상된 대중이 나왔고. 대량 봉투의 정상 농도는 deuteration 수준에 영향을 미치지 않습니다. 그러나, 특정 집단 봉투에 isotopic 봉우리의 정상 농도는 평균 질량 계산 중요하다. 통합 deuteron의 계산의 첫 번째 단계는 진정제를 맞았을 샘플에서 비 진정제를 맞았 샘플의 펩티드 질량을 빼서입니다. 세 가지 다른 요인, D 2 O 희석, 사이드 체인과 다시 교환 잔류 deuterons은 더 (그림 1) 계산에 고려해야합니다. D 2 O의 희석은 샘플을 믹싱 및 D 2 O 버퍼 H / D 교환을 시작 후 D 2 O의 희석 요소입니다. 펩신 - 다이제스트의 측면 체인의 잔류 deuteron (4.5 %)에드 펩티드는 빼서해야합니다. 다시 교환은 질량 측정 과정에있는 모든 진정제를 맞았 및 펩신 - 소화 펩티드의 deuteration의 피할 수없는 손실이다. H / D 교환 24 시간 후 가장 용매 접근 펩타이드 (M / Z = 1105.60)은 전체 deuteration 지역을 나타냅니다. 펩티드의 각 통합 deuteron 번호는 진정제를 맞았와 비 진정제를 맞았 Pak2 소화제의 펩티드의 중심 사이의 차이입니다. 가장 높은 진정제를 맞았 펩타이드 M / Z 1105은 Pak2은 H / D 교환의 24 시간에 있었을 때 전체 deuteration을 대표로 선정되었다. 뒤로 교환 비율은 펩타이드 M / Z 1105에서 가능한 모든 교환 사이트로 나눈 H / D 교환의 24 시간에서 실제 통합 deuteron 번호로 계산되었다.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> 올드 리치 </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α - cyano - 4 - hydroxycinnamic 산 </td><td> 시그마 </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> 든 - TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> 보이저 드 STR </td><td></td></tr><tr><td> Q - TOF 질량 분석계 </td><td> Q - TOF 울티마 - 글로벌 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> 응용 Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 데이터 익스플로러 4.0 컴퓨터 프로그램 </td><td> 응용 Biosystems </td><td></td><td></td></tR&gt; </tbody></table>

pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - tof 질량 분광법 분석

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

질량 분석계와 결합 아미드 수소 / 중수소 교환 (H / D 교환)은 광범위하게 단백질 - 단백질 상호 작용, 단백질 conformational 변화, 단백질 역학 및 단백질 - 리간드 상호 작용의 인터페이스를 분석하는 데 사용되었습니다. 백본 아미드 위치에 H / D 교환 대량 분석법 1,2,3하여 단백질의 마이크로 영역의 deuteration 속도를 측정하는 이용되었습니다. 이 방법의 해상도는 일반적으로 30-20 잔류물에서 다양한 펩티드에 대한 관심의 진정제를 맞았 단백질의 펩신의 소화에 따라 달라집니다. 질량 분석법에 의해 측정 H / D 교환의 해상도 NMR, H / D 교환에서 질량 분석계 측정의 헤테로핵 단일 양자 결맞음 (HSQC) 방법으로 측정 단일 잔여물 해상도보다 낮은이지만,의 크기에 의해 제한되지 않습니다 단백질 4. H / D 교환은 단백질 형태를 유지 수용액에서 수행됩니다. 우리는 방법을 제공 UTIL대신 HPLC / ESI (전기 분무 이온화) - MS 시스템 5,6의 검출 2 든 - TOF를 izes. 든 - TOF이 경우 단백질 키나제 Pak2 (또한 γ - 박라고도 함)에서, 소화 단백질의 펩티드에 대한 정확한 대량 강도 데이터를 제공합니다. 박 2 Proteolysis는 오프라인 펩신의 소화에서 수행됩니다. 사용자가 질량 분광법에 연결된 HPLC 및 펩신 컬럼에 액세스할 때 또는 HPLC에있는 펩신 칼럼은 크게 이황화 - 보세 분비 포스 포 라이 페이스 2, 예를 들어, 최적의 소화지도 발생하지 않는가없는이 대체 방법, (sPLA 2). 이 방법을 활용, 우리는 성공적으로 caspase 3 절단 및 autophosphorylation 7, 8, 9에 의해 Pak2의 활성화 동안 deuteration 수준의 변화를 감시.

든 - TOF 질량 분석법을 성공적으로 단백질 키나제 Pak2 활성화에 아미드 수소 / 중수소 교환을 모니터 활용했다.

Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석

질량 분석법과 결합된 아미드 수소/중수소 교환(H/D exchange)법은 단백질-단백질 인터페이스를 분석하는 데 널리 사용되어 왔습니다...

본 실험은 질량 분석법을 이용하여 단백질의 수소-중수소 교환을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 활성화 상태로 이어지는 구조적 변화를 확인하기 위해, 먼저 caspase 3를 사용하여 protein kinase PAC2를 절단하고, 이어서 ATP를 기질로 사용하여 자가인산화를 통해 PAC2를 활성화합니다. 두 번째 단계로 PAC2를 Pepsin으로 소화시킨 후, 탠덤 질량 분석법을 통해 PAC2 펩타이드 조각들을 분석합니다. 각 PAC2 조각의 중수소 함량을 모니터링하여 PAC2의 수소-중수소 교환 패턴을 분석하며, mzd 분석을 통해 수소-중수소 교환의 정밀한 수준을 측정합니다. 이는 PAC2의 caspase 3 절단 및 자가인산화에 대한 중요한 통찰을 제공합니다.이 방법은 단백질의 구조 변화, 단백질-리간드 상호작용 및 단백질-단백질 상호작용과 같은 단백질 역학에 관한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. HD 교환 LCQ 질량 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 기기적인 측면에 있습니다. 이 절차는 HD 교환 결과를 분석하기 위해 HPLC가 연결된 질량 분석기가 필요하지 않으며, 0.6 µg의 PAC two를 절단하는 과정이 조작하기 쉽습니다.caspase 3를 첨가하고 34 °C에서 30분 동안 반응을 배양합니다. SDS page를 이용한 생성물 분석을 통해 PAC 2 및 PAC 2의 완전한 절단을 확인합니다. 활성화 반응을 위해, 절단된 PAC 2를 20 µL의 활성화 버퍼 B에 첨가하고 34 °C에서 30분 동안 배양합니다.P 34 및 P 27 단편의 이동을 통해 자가인산화를 확인하기 위해 SDS page를 사용하십시오. 먼저, 퓨린이 접합된 aro 비드를 0.1% Trifluoroacetic acid 1 mL로 두 번 세척하십시오. 10 mg/mL의 Pack two 2 µL를 0.1% TFA 100 µL에 희석하십시오. 세척된 퓨린 접합 aro 비드 30 µL를 추가하고 5분 동안 배양하십시오.0.1% TFA(pH 2.5)로 역상 H-P-L-C-C 18 컬럼을 평형화하십시오. 그 다음 Pepin Digest를 로딩하고 100분 선형 기울기(linear gradient)를 사용하여 희석하십시오. speed VAC reus로 HPLC 분획물을 건조시킨 후 2분마다 분획을 수집하십시오.샘플을 5 µL의 acetonitrile과 pH 2.5의 0.1% TFA에 현탁합니다. 초기 스크리닝 단계로서, 각 분획을 MALDI-TOF로 분석하여 펩타이드가 포함된 모든 분획을 확인합니다.탠덤 질량 분석법을 통해 단편들을 식별하십시오. Protein Prospector의 MS product 기능을 사용하여 딸 이온과 PAC two의 1차 서열에 기반한 이론적 MZ 비율을 매칭하십시오. 먼저 수소-중수소 교환을 위해 모든 용액과 시약을 평형 상태로 만드십시오.10 mg/mL의 Pack 2 2 µL에 buffer D₂O 18 µL를 첨가하여 수소-중수소 교환을 시작합니다. 시간 경과에 따라 반응을 3회 반복 수행합니다. pH 2.2의 얼음처럼 차가운 0.1% TFA 180 µL를 첨가하여 수소-중수소 반응을 정지시킵니다.이제 수소 중수소의 100 µL 분주액을 나누어 줍니다. 활성화된 pepin 접합 응집 비즈 30 µL가 들어있는 튜브 각각에 두 개씩 넣습니다. 이 pepin 소화를 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.30초마다 볼텍싱을 수행하고, 원심분리를 통해 Pepin을 빠르게 제거함으로써 소화 반응을 효과적으로 종료시킵니다. 분석을 위해 샘플을 액체 질소에 넣어 급속 냉동합니다. 매트릭스를 준비하여 0 °C에서 보관하고, 각 샘플을 빠르게 부분 해동합니다.샘플 1 µL와 매트릭스 1 µL를 혼합한 후, 분석 30초 전에 4 °C의 MALDI 타겟 플레이트에 점적합니다. 플레이트에 적절한 진공을 가해 건조시킵니다. 점적된 시료에 대해 2분 동안 평균 100회 스캔하여 MALDI 질량 분석 스펙트럼을 획득합니다.Data Explorer 4.0 컴퓨터 프로그램을 사용하여 각 조각의 지속 시간을 계산하십시오. 그런 다음 24시간의 수소-중수소 교환으로 인해 실제로 통합된 수치와 말단 아미드를 제외한 백본 아미드인 모든 가능한 교환 가능 부위의 비율을 기반으로 역교환을 계산하십시오. 이 예시에서는 CASP Bay의 절단 및 자가 인산화가 SDS page Kumasi 염색으로 확인되었습니다.인산화되지 않은 비활성 PAC2는 58 kDa의 단일 밴드로 나타납니다. 자동인산화 후 PAC2의 절단이 완전히 일어나면 조절 도메인인 P27과 촉매 도메인인 P34의 두 가지 단편이 생성됩니다. 자동인산화된 P27과 P34의 이동은 단백질 겔 상에서 서로 겹쳐서 나타나는데, 이는 인산화되지 않은 PAC2와 비교했을 때 완전히 인산화된 P27 단편의 이동 속도가 지연되기 때문입니다.이 질량 분석 스펙트럼은 비활성 PAC two의 중수소 도입 시간 경과를 보여줍니다. MZ 피크 1697.85는 질량 포락선의 이동에서 알 수 있듯이 여러 동위원소 피크로 구성되어 있습니다. 시간이 지남에 따라 빨간색 점선은 질량 포락선의 평균을 나타내며, 질량 포락선의 이동은 펩타이드가 완전히 교환되는 기간을 보여줍니다.이 기술은 적절하게 수행될 경우 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 액체 질소를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 1.5 ml EOL 튜브를 액체 질소에 넣기 전에 캡에 구멍을 뚫는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

단백질의 입체 구조와 역학은 단백질 구조 및 기능 사이의 관계를 이해하기위한 열쇠이다. 고해상도 질량 분광법과 결합 수소 교환은 단백질의 형태 적 역학 연구뿐만 아니라 접촉 인터페이스 및 알로 스테 릭 효과를 포함하여 단백질 - 리간드와 단백질 - 단백질 상호 작용을 특성화하기 위해 다양한 방법이다.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

그대로 세포에서 후보 억제제에 의한 표적 참여를 평가하는 능력은 약물 발견에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 SHP2 또는 종양 발생 변이체를 대상으로 억제제의 셀룰러 표적 참여를 안정적으로 감지하는 384 개의 잘 포맷 셀룰러 열 이동 분석서를 설명합니다.

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

배우세요 MALDI-TOF 질량 분석법을 활용한 Pak2 단백질 키나아제 활성화 시 수소/중수소 교환 분석 방법입니다. 이 기술은 단백질 구조 역학과 활성화 메커니즘 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석

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