Name: 문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 배우세요 척수 explant와 근육 세포 공동 배양을 통한 기능성 모터 유닛 체외 재현 방법. 쥐 배아 척수와 인간 원발성 근육 세포를 사용하여 근육 신경 지배 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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우리의 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNF), 시스템 생물학 (SystemsX.ch), 근육질 영양 장애 협회 미국 (MDA), 협회 테크 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM), 미국 Mitochondrial 질병 재단에서 스위스의 이니셔티브에 의해 지원됩니다 (UMDF), Gebert-RUF 재단 희귀 질병 프로그램 (GRF), 근육 질환 (SSEM / FSRMM), 스위스 생활 &quot;Jubiläumsstiftung FÜR Volksgesundheit 깨물어 medizinische Forschung&quot;, 로슈 학술 진흥 재단과 대학의 연구에 대한 스위스의 학회 바젤의.

1. 기본 인간 근육 세포 배양의 준비 <ol><li> explantation - 다시 explantation 기법 넷에 따르면 인간의 근육 세포 배양을 마련한다. 첫째, biopsies에서가 아닌 근육 조직을 제거합니다. 그런 다음, 섬유아 세포가 explants에서 나타날 수있는 플라즈마의 coagulum에 1mm 3 근육 explants를 포함. </li><li> 임베디드 explants는 플라즈마-젤라틴 코팅 접시에 옮겨주고 (MEM 10 % 태아 소 혈청 [FBS], 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 μg / ML 인슐린, 25 %의 중간 199, 함께 보완 정상적인 성장 매체로 성장하게됩니다 10 NG / ML 인간 표피 성장 인자 [EGF], 12.5 NG / ML 인간 fibroblast의 성장 인자 단일층의 [FGF]). 이러한 조건 하에서 explants 반발 세포는 근육 세포입니다. 이러한 세포는 explants이 제거된 후에도 단일층 성장 나갈 것입니다. </li><li> 문화 aneurally 정상적인 성장 매체의 0.1 % 젤라틴 코팅 접시에있는 세포. 세포가 될 수 있습니다aneurally 배양해하고, 필요에 따라 증폭. 그것은 공동 문화권을 수행하기 위해 3와 8 사이 통로에서 근육 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 젊은 myotubes에 신경을 분포시키다 것이 중요하다,이 시점 이후, 공동 문화는 실패의 위험이 있습니다. 또한, myotubes 너무 크고 너무 두꺼운가 없습니다. </li><li> innervation이 계획되어 이틀 전, 플레이트 정상적인 성장 매체에 요리 당 500,000 세포 밀도에서 35mm 조직 문화 요리 (또는 6 잘 접시)에서 근육 세포. 그 농도에서 세포 그 이후는 다음날 융합을 시작할 적절한 confluency 및 후속 innervation 날에입니다. 이러한 조건을 사용하여 myotubes는 최적의 innervation시키고 그럼으로써 이후 섬유 수축에 맞는 단계에 있습니다. </li><li> 다음 날, 25 %의 중간 199 5 % FBS, 10 μg / ML 인슐린과 페니실린 / 스트렙토 마이신의 1 %로 보충 MEM 구성된 융합 미디어로 정상 성장 매체를 교체하십시오. </li></ol> 2. Isolati<html> 쥐 배아 척수의 Explants의에 척수의 explants를 분리하기위한 모든 절차는 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS, Gibco / Invitrogen 심판 14,170)에, 쌍안 현미경으로 수행됩니다. <ol><li> 이것은 쥐의 배아가 다른 개발 단계로 ED 13 층과 14 층 사이에 있다고하는 것은 전체 과정을 위태롭게 할 것이 매우 중요합니다. CO 2와 임신 여성을 희생하고 HBSS 매체 전체 배아 체인을 수집합니다. 각각의 배아를 분리하고 안락사를 위해 목을 벨. </li><li> 한 조각의 신체의 나머지 부분에서 배아 척수를 해부하며 주위의 근육과 결합 조직을 제거하십시오. 기능성 innervation을 보장하기 위해 척수에 연결된 지느러미 루트 ganglions (DRGs)를 유지하는 데 매우주의하십시오. </li><li> 각 explant는 최소한 2 DRG (1mm 3 explants) 그것에 첨부를 포함하는 방식으로 transversally 각 척수를 썰어. </li></ol><html> 배아 쥐 척수의 Explants과 인간 근육 세포 ove_title &quot;&gt; 3. Innervation <ol><li> 단일층에 매체의 벌금 레이어를두고, 근육 세포 배양에 융합 매체를 제거합니다. </li><li> 근육 세포 층, 35 밀리미터 접시 당 다섯 균등하게 게재 explants에 신중 explants를 놓습니다. </li><li> 매우 느리게 추가, 각 explant에 현명, 퓨전 미디어를 놓습니다. 그것은 explants 먼저 준수하고 세포와 접촉을하도록 너무 많은 살아남기 위해 근육 세포에 대한 매체를 추가할 필요가 있지만, 아니다. 매체가 제대로 (너무 강하게 또는 너무 많은 매체)에 추가되지 않은 경우 explants는 역부족되며 근육 세포를 신경을 분포시키다되지 않습니다. </li><li> explants가 준수하기 시작하면, 35 밀리미터 접시 당 2 ML로 융합 미디어를 위로하고, 인큐베이터에 다시주의 깊게 요리를하다. </li></ol> 4. Heterologous 신경 근육의 공동 문화의 유지 보수 <ol><li> 일주일에 두 번 융합 미디어를 변경합니다. </li></ol>_title &quot;&gt; 5. 대표 결과 즉시 이일로 innervation 후, 그것은 각 explant에서 신흥 및 버튼과 같은 구조 (그림 1)로 표시 근육 세포와 연락처를 확립 neurites을 볼 수 있습니다. 이르면 innervation 후 4-6일로서, 몇 가지 개별 섬유 계약에 시작됩니다. 수축이 단순히 일주일에 두 번 배지를 변경하여 유지, 여러 달 동안 유지됩니다. 약 2 주가 지난 후, 척수의 explant 자체는 썩어빠진지만 innervation이 보존되어있다. 이것은 정상입니다. 신경 구성 요소의 벌금 레이어 근육 세포 레이어의 표면에 유지됩니다. 이 신경 네트워크는 모터 장치의 기능을 유지하는 데 충분합니다. explants이 innervation 후 매체를 하루에 떠있다면, 그들은 준수하지 않습니다. 근육 세포 계층이 때 발생충분히 합류, 또는 경우 매체 아니라도 대략 추가됩니다. 때로 explant을 준수합니다 그런데 neurites가 등장할 것입니다. 이것은 가능성이 그것에 첨부 DRG의 부족 때문입니다. 물론이 경우, innervation을 설정할 수 없습니다. explants 여전히 쉽게 분리 수 있으므로, 첫째 주에 매우 신중하게 요리를 조작. 융합 미디어를 교환하려면, 셀 부대를 피하기 위해 최소한의 속도로 액체 드롭 현명한를 추가합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3616/3616fig1.jpg" /> 그림 1. 척수 explants - 근육 세포 일 ~ 15 일 1에서 공동의 문화.

<ol><li>Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myotube+differentiation+in+vitro+in+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions.</a> Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).</li>
<li>Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+cultured+in+monolayer+and+cocultured+with+fetal+rat+spinal+cord%3A+importance+of+dorsal+root+ganglia+for+achieving+successful+functional+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation.</a> J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).</li>
<li>Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+muscular+abnormalities+in+culture+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy.</a> Lancet. 345, 694-695 (1995).</li>
<li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li>
<li>Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+required+to+efficiently+innervate+human+muscle+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro.</a> Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).</li>
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<li>Schrank, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+survival+motor+neuron+gene%2C+a+candidate+gene+for+human+spinal+muscular+atrophy%2C+leads+to+massive+cell+death+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).</li>
<li>Monani, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+centromeric+survival+motor+neuron+gene+%28SMN2%29+rescues+embryonic+lethality+in+Smn%28-%2F-%29+mice+and+results+in+a+mouse+with+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).</li>
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<li>Durbeej, M., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies+involving+the+dystrophin-glycoprotein+complex%3A+an+overview+of+current+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models.</a> 12, 349-361 (2002).</li>
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<li>Benatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+treatment+trials+in+the+SOD1+mouse+and+in+human+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS.</a> Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).</li>
<li>Dorchies, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+innervation+and+differentiation+of+X-linked+myotubular+myopathy+muscle+cells+in+a+nerve-muscle+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system.</a> Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).</li>
<li>McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+innervation+of+cultured+human+muscle+overexpressing+betaAPP+experimentally+and+genetically%3A+relevance+to+inclusion-body+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies.</a> Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

근육 세포 배양은 보통 여러 셀 및 셀 타입의 연결의 중요성을 요점을 되풀이하지 않기 때문에 정상과 병리 학적 맥락에서 근육 세포 기능을 연구하는 생리학의 체외 도구, myologists에 대한 높은 관심이다. 근육 세포에 모터 뉴런을 정화의 첨가 Schwann 세포의 존재는 5 개의 효율적이 될 innervation 필요하고 관련 프로토콜이 여기에 설명된 (3D + 특수 유통) topologically하지 않았습니다이기 때문에 기능적인 운동 단위를 달성하는 것만으로는 충분하지 않습니다 시험 관내 쉽게 평가 할 수있는 완벽한 NMJ의 성숙의 결과에 innervated 근육 세포를 확립하는 데 성공적으로 사용되었습니다. Murine 모델은 많은 신경근육학 질환 ​​이제 사용할 수 있습니다. 불행히도, 이러한 모델의 대부분은 예를 들면 척수 근육 위축증에 대한 마우스 모델, Duchenne는 인간 환자의 질병에 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 14,170 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31,095 </td></tr><tr><td> 중형 199 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31,153 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 태아 복제 Perbio </td><td> SH30066.03 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 </td><td> I9278 </td></tr><tr><td> 인간 EGF </td><td> 시그마 </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> 인간 FGF </td><td> 시GMA </td><td> F0291 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td></tr></tbody></table>

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 explants와 근육 세포의 공동 문화

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

신경 구성 요소의 부재에서, 세포 분화가 제한되며 모터 신경 세포의 자극 1가 누락되어 자연스럽게 있기 때문에 인간의 기본 근육 세포 단일층에 aneurally 드물게 계약을 배양해. 이러한 제한은 교양 근육 세포에있는 많은 신경근육학 질병의 체외 연구를 방해. 중요한 monolayered, 교양 근육 세포의 실험적 제약이 공동 문화권에서 척수의 explants있는 myofibers의 기능 innervation에 의해 극복할 수있다. 여기서는 Askanas이 개발한 방법에 따라 차별화 및 섬유 수축을 완료하는 데 선도적인, 인간의 기본 근육 세포의 효율적이고 적절한 innervation을 달성하는 데 필요한 여러 단계를 보여줍니다. 이렇게하려면, 근육 세포는 여전히 척수의 조각에 부착된 지느러미 루트 신경으로 ED 13.5에서 쥐의 배아의 척수의 explants와 공동 배양해 있습니다. 며칠 후, 근육이 좋bers 계약에 시작하고 결국 근육 세포에 연결되는 척수의 explants에서 돌출 기능 neurites 의해 innervation을 통해 교차 줄무늬가된다. 이 구조는 단순히 문화 매체의 정기 교류에 의해, 많은 달 동안 유지하실 수 있습니다. 그것이 인간의 근육 발달과 innervation의 종합 분석을위한 기능적인 모델을 대표로 귀중한 도구의 응용 프로그램은 다수 있습니다. 사실, 완벽한 드 노보 신경근육학 접합 설치 기본 및 생리적 컨텍스트의 각 단계에서 여러 매개 변수를 쉽게 측정을 수 있도록 문화 접시에 발생합니다. 몇 가지 예제, 게놈 및 / 또는 proteomic 연구를 인용하는 것은 공동의 문화에서 직접 수행할 수 있습니다. 두 구성 요소가 서로 다른 종에서 온 있기 때문에 또한, 사전 및 사후 시냅스 효과는 특별히 별도로, 신경근육학 교차점에서 평가 수쥐, 인간, 각각. 신경 근육의 공동 문화는 또한 근육이나 신경근육학 질병 3 앓고 환자 격리 인간의 근육 세포를 수행할 수 있으며, 따라서 후보 의약품에 대한 선별 도구로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 특별한 장비가 있지만 일반 BSL2 시설은 문화 접시에있는 기능적인 운동 단위를 재현하는 데 필요하지 않습니다. 이 방법은 따라서 정상과 질병 맥락에서, 근육뿐만 아니라 신경근육학 기능의 생리적 및 기계론의 연구 신경근육학 연구 지역 사회 모두에 유용합니다.

교양 근육 세포 innervated 근육을 요점을 되풀이하는 불충 분한 모델입니다<em&gt; 생체내에서</em&gt;. 기능적인 운동 단위가 복제하실 수 있습니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 쥐의 배아 척수의 explants를 사용하여 차별화된 인간의 기본 근육 세포의 innervation에 의해. 이 문서는 척수의 explants와 근육 세포의 공동 문화가 확립되는 방법을 설명합니다.

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

단층으로 신경 없이 배양된 인간 일차 근육 세포는 신경 성분이 없기 때문에 세포... 가 드물게 자발적으로 수축합니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 체외에서 기능적인 운동 단위(motor unit)를 재현하는 것입니다. 이는 인간의 일차 근육 세포를 쥐 배아에서 분리한 척수 이식편(spinal cord explan)과 함께 배양함으로써 달성됩니다. 이후 척수 이식편이 부착된 상태에서 인간 근육 세포에 신경을 분포시키도록 합니다.근육 세포가 완전히 분화될 때까지 배양액을 조심스럽게 공급합니다. 이후 선택적인 분자 도구들을 통해 분화된 근육 세포의 분자적 또는 세포적 표현형을 평가할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요한데, 우선 척수를 분리하는 방법을 익히는 것이 어렵기 때문입니다.무엇보다도 혁신적인 근육 세포에 배양액을 추가할 때 매우 세심하게 처리해야 합니다. 배아 단계가 ED 12.5에서 ED 13.5 사이인 임신한 쥐를 안락사시키십시오.단계 설정이 전체 과정에서 매우 중요하므로 정확하게 수행하십시오. 실체현미경 하에서 10% FBS가 포함된 HBSS 배지를 사용하여 자궁을 해부하고 전체 배아 체인을 수집한 뒤, 각 배아를 분리하고 머리 부분을 제거하십시오. 척수를 한 조각으로 분리하고 주변 근육과 결합 조직을 제거하십시오.이를 위해 먼저 마이크로 가위로 배아를 고정합니다. 척수 양측에 선을 따라 절개한 후 피부를 조심스럽게 벗겨냅니다. 그다음 배아를 옆으로 눕히고, 배측 신경절(dorsal root ganglion, DRG)이 부착된 상태로 척수를 조심스럽게 분리합니다.DRG(배근신경절)가 척수에 부착된 상태로 유지되지 않으면 기능적 신경 지배가 일어나지 않습니다. 척수는 주변의 분홍색 결합 조직 및 근육보다 더 하얗게 보입니다. DRG를 건드리지 않도록 주의하며 주변 조직을 제거하십시오.분리된 후, 마이크로 시린지의 바늘을 사용하여 각 척수를 횡단면으로 절단하여 최소 두 개의 DRG가 부착된 정육면체 형태로 만듭니다. 이렇게 만들어진 조직 조각은 약 1mm³ 크기이며, 이제 표준 인간 근육 세포 배양액과 함께 공동 배양할 준비가 된 것입니다. 이 프로토콜에서는 조직 생검을 통해 배양된 인간 근육 세포가 필요합니다.이 절차에 대한 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 먼저 근육 세포 배양액의 융합 배지를 제거하고, 단층 위에 얇은 배지 층만 남깁니다. 다음으로 x explan을 근육 세포 위에 조심스럽게 배치하십시오.35 밀리미터 배양 접시 하나당 5개의 X 외식편을 일정한 간격으로 층을 이루어 배치할 수 있습니다. 각 X 외식편 위에 융합 배지를 천천히 한 방울씩 가합니다. 융합 배지를 너무 빠르게 가하거나 너무 많은 양을 넣지 마십시오.그렇지 않으면 x 외식편이 떠올라 근육 세포에 신경 지배를 형성하지 못하게 됩니다. 그 다음 배양 접시를 매우 조심스럽게 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 배지를 천천히 계속해서 추가하십시오.조심스럽게 취급하면, x 조직편은 배지에서 떠다니는 것을 멈추고 약 1시간 후에 세포에 부착됩니다. 부착이 완료되면, 35 mm 디쉬당 융합 배지 부피를 2 mL로 늘리십시오. 하룻밤 기다린 후에도 X 조직편이 여전히 배지에 떠 있다면, 근육 세포층의 합류도(confluency)가 충분하지 않았거나 배지가 추가된 것입니다.대략 두 번입니다. 이 X explan들은 일주일에 두 번 절대 부착되지 않을 것입니다. 세포 박리를 방지하기 위해 모든 융합 배지를 매우 천천히 한 방울씩 교체하십시오.X 설명은 첫 일주일 동안 매우 취약하며 쉽게 떨어질 수 있습니다. 이는 혁신 이후 배양액을 측정하거나 수집하는 것만으로도 공동 배양의-ome을 측정할 수 있다는 점에서 매우 훌륭한 기술입니다. 또한 분자 도구를 신중하게 선택하면 근육에서 유래한 것과 신경에서 유래한 것을 구분할 수 있습니다.각 설명물(explan)에서 신경 지배 돌기가 나타나고 버튼 모양의 구조로 나타나는 근육 세포와 접촉을 형성하기까지 이틀이 걸립니다. 돌기가 나타나지 않는 경우, 아마도 DRG 부착 부족으로 인해 신경 지배가 실패하게 됩니다. 신경 지배 후 이르면 4~6일 뒤에 몇 개의 개별 섬유들이 수축하기 시작했습니다.수축은 단순히 배양액을 일주일에 두 번 교체함으로써 수개월 동안 지속되었습니다. 예상대로 약 2주 후에 척수 이식편 자체는 퇴행하였으나, 신경 지배는 유지되었습니다. 신경 성분의 얇은 층이 근세포 층의 표면에 남아 있었으며, 이 신경망은 운동 단위의 기능을 유지하기에 충분했습니다.이 기술의 큰 장점 중 하나는 환자로부터 샘플을 채취하여 대조군과 환자 샘플 간의 공배양 표현형을 측정하거나 비교할 수 있다는 점입니다. 그리고 이 절차에 따라 실시간 PCR, Western blot, 면역조직화학 염색과 같은 매우 일반적인 고전적 기술을 사용하여 공배양된 근육 또는 신경 유래 표현형을 실제로 연구할 수 있습니다.

a-functional-motor-unit-culture-dish-co-culture-spinal-cord-explants

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

척수에서 마우스 배아 motoneurons를 분리의 대체 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 계정에 렉틴은 낮은 친화 신경 성장 인자 수용체 p75NTR에 바인딩할 수있다는 사실이 걸립니다. 이 렉틴과 기반 preplating는 p75NTR에 대한 특정 항체와 비슷한 정화 수 있습니다.

마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

우리는 병아리 E4 statoacoustic 신경절 및 E6 척수의 explants을 해부하다 문화하는 방법을 보여줍니다. Explants는 24 시간 동안 3D 콜라겐 젤의 혈청 무료 조건에서 양식입니다. Neurite 대응은 성장 인자 - 보충 매체와 단백질 코팅 비즈와 함께 테스트됩니다.

Neurite 가지의 Assays에 대한 해부와 칙 Statoacoustic 신경절과 콜라겐 젤에서 척수의 Explants의 문화

설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

슬라이스 문화 유전자와 약리 섭동에 의해 배아 개발의 조작을 용이하게합니다. 그러나, 문화 조건은 일반적인 개발 슬라이스의 감소 환경 내에서 수행 할 수 있는지 확인해야합니다. 우리는 최소 24 시간 동안 진행되는 것이 정상적인 척추의 개발을 용이하게하는 프로토콜을 보여줍니다.

닭의 배아 척수 코드 슬라이스 문화 프로토콜

여기에서 우리는 체외에서 propriospinal 연결 기능 재생을 연구하기 위해 다중 전극 배열에 배양 척수 조각을 기반으로하는 프로토콜을 제시한다.

다중 전극 배열에 성장의 Organotypic 척수 공동 문화 기능 재생 조사

축색 수송은 운동 신경 건강을 위한 중요한 기계장치입니다. 이 프로토콜에서 우리는 미세 유체 챔버를 사용하여 운동 뉴런 축축에서 산성 구획및 미토콘드리아의 축산 수송을 추적하기위한 상세한 방법을 제공합니다.

미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송

이 프로토콜에서 근육 줄기 세포에 대한 체외 배양 및 기능 분석 방법이 설명되어 있어 내인성 틈새 시장을 통해 대부분의 상호 작용을 보존합니다.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

이 원고는 수축력 및 칼슘 취급 분석을 포함하여 기능분석에서 3D 인간 골격 근 미세 조직 및 최소 침습 다운스트림의 배열을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 골격 근육 미세 조직에서 골격 근육 건강의 기능 메트릭 평가

당사는 인간 원발성 메소포스트 유래 근투와 인간 유도만능 줄기 세포 유래 모터 뉴런을 공동 배양하여 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 인간 모터 유닛을 생성하는 방법을 설명하며, 이로 인해 기능적으로 활성 신경 근육 접합이 형성된다.

미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

배우세요 척수 explant와 근육 세포 공동 배양을 통한 기능성 모터 유닛 체외 재현 방법. 쥐 배아 척수와 인간 원발성 근육 세포를 사용하여 근육 신경 지배 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

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