크로스 종 이식에 의한 신경 크레스트 마이 그 레이션과 차별화 분석

이 실험 절차의 전체적인 목적은 퀘일 배아의 등쪽 신경관 절편을 발달 단계가 일치하는 닭 배아에 이식하여, 신경능세포의 이동과 운명을 추적하는 것입니다. 이를 위해 먼저 숙주인 닭 배아의 IGN 막에 작은 구멍을 내어 신경관에 접근합니다. 그 다음, 공여체인 퀘일 배아를 알에서 꺼내 이식할 조직을 절제할 준비를 합니다.

다음 단계에서, 숙주 배아의 신경관으로부터 관심 영역을 절제합니다. 그런 다음, 이식할 공여 신경관에서 유사한 영역을 절제합니다. 이어서, 공여 신경관을 숙주 신경관으로 이식합니다.

마지막으로, 선택한 장기에 도착한 신경능세포를 검출하기 위해 키메라 배아를 원하는 단계까지 배양합니다. 최종적으로, 공여체 유래 신경능세포가 숙주 배아의 다양한 위치로 이동하고 분화하는 과정을 면역형광 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다. 미세 절제 및 이식 단계는 매우 정교한 운동 기술을 요구하여 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

먼저 미온수를 사용하여 병아리 알에 묻은 이물질을 씻어내십시오. 알을 트레이 위에 수평으로 배열한 다음, 배아가 위치할 영역을 표시하기 위해 위를 향한 쪽에 연필로 표시하십시오. 공여 배아의 X ovo 준비를 위해 메추리 알은 뭉툭한 쪽이 아래로 가도록 하여 배양하십시오.

다음으로, 알을 38 °C의 가습 인큐베이터에 넣고 로킹(rocking) 기능을 켭니다. 배아가 부화한 후, 70% ethanol을 분사하고 Kimwipe로 빠르게 닦아내어 알의 윗부분을 멸균합니다. 알 껍질을 통한 흡수를 방지하기 위해, 멸균된 각 알을 여기 보이는 것처럼 접은 Kimwipe를 깐 페트리 접시와 유사한 개별 알 홀더 위에 놓습니다. 그런 다음 멸균된 AA 핀셋을 사용하여 알의 뾰족한 끝부분 쪽 껍질 상단에 작은 구멍을 냅니다.

5 mL 주사기에 18.5 gauge 피하 주사 바늘을 장착합니다. 그다음 바늘의 사면이 달걀의 뾰족한 끝부분을 향하게 하여, 달걀 껍데기의 구멍으로 바늘을 수직으로 삽입합니다. 흡입으로 인해 난황이 실수로 손상되는 것을 방지하기 위해, 이전과 마찬가지로 구멍을 70% ethanol로 세척하고 스카치테이프로 구멍을 밀봉합니다.

그 다음 double A forceps를 사용하여, 수평 다리의 표시된 윗면 중 정점에 slightly 못 미치는 지점에 또 다른 구멍을 뚫습니다. 이어서 곡선형 iris forceps의 한쪽 끝을 알과 평행하게 구멍 속으로 삽입합니다. 그런 다음 껍질을 아래로 집어 누르며 원형으로 움직여 껍질을 제거합니다.

닭 알의 껍질에 지름 2cm의 창을 내고, 제거된 알껍질은 버립니다. 배아는 난황 상단의 불투명한 원반 형태로 나타나야 합니다. 난황 표면에 작은 흰색 점이 있거나 배반이 없는 것으로 확인된 무정란은 폐기하십시오.

이제 적절한 보안경을 착용한 상태에서, 26.5 gauge 하이포더믹 바늘의 기부부터 45도 각도로 구부립니다. 구부린 바늘의 베벨 면이 위로 오도록 1 mL 주사기에 장착한 후, 희석된 인디아 잉크를 바늘에 채웁니다. 블래스터 외곽의 난황막을 천자하고, 바늘 끝을 배아 아래쪽, 난황 표면에 가깝게 밀어 넣되 배아 층 내부로 들어가지 않도록 합니다.

그런 다음 배아의 윤곽을 잡을 수 있을 만큼의 잉크만 주입하고, 기포가 주입되지 않도록 주의합니다. 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 이제 여기 보이는 광섬유 구즈넥 램프와 같이 열 부하가 적은 광원과 실체 현미경을 사용합니다.

Hamburger 및 Hamilton 기준에 따라 배아의 단계를 결정합니다. 각 달걀 껍질에 해당 단계를 기록하십시오. 그 다음, 탈수와 오염을 방지하기 위해 따뜻한 멸균 Ringer 용액 2~3방울을 배아 표면에 처리합니다.

그런 다음 파라필름을 알 표면 위로 늘려 윈도우를 일시적으로 밀봉합니다. 다음으로 메추라기 알을 이식 준비합니다. 인큐베이터에서 알을 꺼내기 전에 페트리 접시에 링거액을 채웁니다.

그 후 곡선 핀셋을 사용하여 알의 둔한 쪽을 열어 배아를 노출시킵니다. 해부 가위를 사용하여 배아 외부의 융모막과 배아외막을 따라 사각형 모양으로 네 번 절개하되, 모든 절단면이 서로 맞닿도록 합니다. 그런 다음 곡선 아이리스 핀셋으로 절단된 가장자리 한 곳을 살며시 잡고, 알에서 배아를 들어 올려 준비된 페트리 접시에 옮깁니다.

마지막으로, 5번 핀셋을 사용하여 난황막을 조심스럽게 제거한 다음, 해부 현미경 하에서 배아의 단계를 확인합니다. 숙주 병아리 배아에서 파라필름을 제거합니다. 그런 다음 끝을 뾰족하게 만든 텅스텐 바늘을 사용하여 신경관의 원하는 부위에 있는 VII 막에 작은 구멍을 냅니다.

배아에 링거 용액 한 방울을 추가합니다. 다음으로, 이 영상에서 수행하는 것과 같은 일측성 이식의 경우, 연마된 유리 니들을 사용하여 신경관의 중뇌 부위에 횡방향의 앞쪽 및 뒤쪽 절개를 조심스럽게 가하되, 내강 너머로 확장되지 않도록 합니다. 그런 다음 배측 신경관과 벽측 중배엽 사이를 양측으로 절개합니다.

마지막으로, 절제된 ex explan을 신경관에서 조심스럽게 분리한 다음, 유리 마이크로 피펫으로 흡입하여 배아에서 제거합니다. 먼저, 발달 단계가 일치하는 메추라기 배아를 준비합니다. 그 다음 앞서 보여준 것과 유사한 크기의 신경관 영역을 절제하고, 공여체 X explan을 링거액(ringers solution)이 담긴 유리 마이크로 피펫으로 흡입합니다.

X 설명편을 병아리 숙주의 절제된 영역 인접 부위로 옮깁니다. 그다음 가늘게 뽑은 유리침을 사용하여 설명편을 조심스럽게 유도해 소작된 영역 내부로 배치합니다. 배아의 탈수를 방지하기 위해 링거액을 몇 방울 조심스럽게 첨가합니다.

마지막으로, 패킹 테이프로 윈도우를 밀봉하여 윈도우가 생성된 달걀의 전체 영역이 완전히 밀봉되었는지 확인한 후, 원하는 단계에 도달할 때까지 달걀을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이때 kyira를 배양하는 동안 로킹(rocking) 기능은 꺼두어야 하며, 생존율을 높이기 위해 하루에 두 번씩 X를 손으로 부드럽게 돌려줄 수 있습니다. 더 후기의 발달 단계를 목표로 하는 경우, HH 11까지 6시간 동안 재배양한 후 신경관의 이식 부위를 촬영한 이 대표 이미지는 이식된 메추라기 공여 조직이 호스트 병아리 신경관으로 예상대로 통합되었음을 보여줍니다. HH 11 단계에서 이식 부위를 가로지르는 이 단면은 hnk로 표지된 신경능 세포를 보여주며, 그 중 하나가 신경관에서 측면으로 이동하고 있습니다.

신경능 세포 이동 흐름과 신경관에 기여하는 메추라기 세포들이 QCPN으로 명확하게 표지되어 있습니다. 후기 단계에서는 메추라기 신경능 세포 유래 세포들이 최종 표적 조직으로 이동하는 경로를 추적할 수 있습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, QCPN 표지 세포들이 E5 단계의 닭 배아 상악 돌기 내에 흩어져 있습니다. QCPN 항체는 다른 항체들과 쉽게 병용하여 메추라기 유래 신경능 세포의 분화를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

숙주 환경 내에서의 모습입니다. 여기에서 보시다시피, 메추라기 신경능세포 유래 삼차신경 감각 뉴런들이 QCPN 및 T UJ one 항체에 의해 표지되었습니다. 이 절차 이후에 면역조직화학 및 in situ hybridization과 같은 다른 방법들을 수행하여, 신경능세포가 어떤 조직으로 발달하는지, 그리고 다양한 조직으로 분화하면서 어떤 유전자를 발현하는지와 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.