크로스 종 이식에 의한 신경 크레스트 마이 그 레이션과 차별화 분석

이 절차의 전반적인 목적은 메추라기 배아에서 배쪽 신경관 익스플랜을 단계적으로 일치하는 닭 배아에 이식하여 신경능선 세포의 이동과 운명을 추적하는 것입니다. 이것은 먼저 숙주 닭 배아의 IGN 막에 있는 작은 구멍을 뚫어 신경관에 접근함으로써 이루어집니다. 그런 다음 기증자 메추라기 배아를 난자에서 제거하여 이식편 절제를 준비합니다.

다음 단계에서는 숙주 배아의 신경관에서 관심 영역을 절제합니다. 그런 다음 이식을 위해 기증자 신경관에서 유사한 부위를 절제합니다. 다음으로, 기증자 신경관을 숙주 신경관에 이식합니다.

마지막으로, 키메라 배아(chimeric embryo)는 선택한 기관에서 신경능선(neural crest)에 도착한 세포를 검출하기 위해 원하는 단계로 배양됩니다. 궁극적으로, 기증자 유래 신경능선 세포가 숙주 배아의 다양한 위치로 이동하고 분화하는 것은 면역형광 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 마이크로 해부 및 이식 단계에는 매우 미세한 운동 기술이 필요하여 배우기가 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

병아리 알의 찌꺼기를 미지근한 물로 씻는 것으로 시작하십시오. 쟁반에 난자를 수평으로 배열한 다음 배아가 국소화될 영역을 나타내기 위해 연필로 위를 향하도록 면을 표시합니다. 기증자 배아의 X ovo 준비를 위해 메추라기 다리가 뭉툭한 쪽을 배양합니다.

다음으로 섭씨 38도의 가습 인큐베이터에 계란을 넣고 흔들기 기능을 켭니다. 난자가 완성 된 후, 부화 : 70 % 에탄올을 뿌려 윗부분을 살균 한 다음 김 물티슈로 빠르게 닦아내십시오.달걀을 통한 흡수를 피하기 위해 살균 된 각 달걀을 여기에 보이는 접힌 김 물티슈가 늘어선 페트리 접시와 유사한 개별 달걀 홀더에 껍질을 벗기십시오. 그런 다음 멸균된 AA 집게를 사용하여 달걀의 뾰족한 끝에 있는 달걀 껍질의 윗면에 작은 구멍을 뚫습니다.

5ml 주사기에 18 및 5 게이지 피하 주사 바늘을 장착하십시오. 그런 다음 경사가 달걀의 뾰족한 끝을 향하게 하여 바늘을 달걀 껍질의 구멍에 수직으로 삽입합니다. 흡입을 통해 실수로 노른자가 손상되는 것을 방지하려면 이전과 같이 70% 에탄올로 구멍을 청소하고 스카치 테이프로 구멍을 밀봉하십시오.

그런 다음 더블 A 집게를 사용하여 정점이 아닌 수평 다리의 표시된 윗면에 다른 구멍을 두드립니다. 그런 다음 구부러진 홍채 집게의 한쪽을 난자와 평행한 구멍에 삽입합니다. 그런 다음 쉘을 꼬집어 원을 그리며 작업합니다.

닭 달걀에서 직경 2cm의 창문을 깨고 껍질을 벗기고 제거 된 달걀 껍질을 버립니다. 배아는 난황 위에 불투명한 원반으로 나타나야 합니다. 노른자 표면에 작은 흰색 반점이 있거나 블래스터 덤이 없는 것으로 식별되는 수정되지 않은 난자는 모두 폐기하십시오.

이제 적절한 보안경을 착용한 상태에서 26 및 반 게이지 피하 주사 바늘을 바늘 바닥에서 시작하여 45도 각도로 구부립니다. 구부러진 바늘 베벨 면을 1ml 주사기에 부착한 후 희석된 인도 잉크를 바늘에 채웁니다. 블래스터 주변 바깥쪽의 난황 막에 구멍을 뚫고 바늘 끝을 배아 아래의 노른자 표면 가까이로 밀어 넣되 배아 층에는 넣지 마십시오.

그런 다음 배아의 윤곽을 그릴 만큼만 잉크를 주입하고 거품을 주입하지 마십시오. 조심스럽게 바늘을 빼냅니다. 이제 실체 현미경과 여기에 표시된 광섬유 구즈넥 램프와 같이 열 부하가 제한된 광원을 사용합니다.

햄버거와 해밀턴에 따라 배아를 준비합니다. 달걀 껍질에 무대를 녹음하십시오. 그런 다음 탈수와 오염을 방지하기 위해 배아 표면에 따뜻한 멸균 링거 용액 2-3방울을 바르십시오.

그런 다음 달걀 표면에 파라 필름을 펴서 창문을 임시로 밀봉합니다. 다음으로, 이식을 위해 메추라기 알을 준비합니다. 인큐베이터에서 계란을 꺼내기 전에 페트리 접시에 링거 용액을 채우십시오.

그런 다음 구부러진 집게로 뭉툭한 면의 난자를 열어 배아를 드러냅니다. 해부 가위를 사용하여 배아 외부의 빌리 막과 블래스터 덤을 통해 사각형 모양으로 네 번 자르고 모든 절단이 만나도록 합니다. 그런 다음 구부러진 홍채 집게를 사용하여 절단된 모서리 하나를 부드럽게 잡고 난자에서 배아를 들어 올려 준비된 페트리 접시에 옮깁니다.

마지막으로, 5번 겸자로 바이텔린 막을 부드럽게 제거한 다음 해부 현미경으로 배아를 상기시킵니다. 숙주 병아리 배아에서 파라 필름을 제거합니다. 그런 다음 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 신경관의 원하는 영역에서 VII 멤브레인의 작은 구멍을 뚫습니다.

배아에 링거 용액 한 방울을 추가합니다. 다음으로, 이 비디오에서 수행되는 것과 같은 편측 이식의 경우 유리 바늘을 부어 내강 너머로 확장되지 않고 신경관의 중뇌 영역을 가로 주부 및 척추 절개를 조심스럽게 만듭니다. 그런 다음 등쪽 신경관과 두엽 중배엽 사이를 양측으로 자릅니다.

마지막으로, 신경관에서 절제된 explan을 조심스럽게 분리한 다음 유리 마이크로 피펫으로 흡인하여 배아에서 제거합니다. 먼저 단계와 일치하는 메추라기 배아를 사용합니다. 그런 다음 방금 표시된 것과 같이 비슷한 크기의 신경관 영역을 절제하고 기증자 X를 링거 용액이 들어 있는 유리 마이크로 피펫으로 흡인합니다.

병아리 숙주의 절제된 영역에 인접한 X 익스플랜을 전송합니다. 그런 다음 당겨진 유리 바늘을 사용하여 ex explan을 절제 부위로 부드럽게 안내하는 방향을 지정합니다. 탈수를 방지하기 위해 배아에 링거 용액 몇 방울을 조심스럽게 첨가하십시오.

마지막으로, 포장 테이프로 창문을 밀봉하고 테이프가 창문이 있는 알의 전체 영역을 밀봉하도록 하고 원하는 단계까지 알을 인큐베이터에 다시 넣고 키이라를 부화하는 동안 흔들 기능을 끄면 X는 생존력을 높이기 위해 하루에 두 번 손으로 부드럽게 돌릴 수 있습니다. 발달의 후반 단계를 대상으로 하는 경우, HH 11로 6시간 동안 다시 배양한 후 신경관의 이식된 부위에 대한 이 대표적인 이미지는 이식된 메추라기 기증자 조직이 숙주 병아리 신경관에 통합될 것으로 예상되는 것을 보여줍니다. HH 11의 이식된 영역을 통한 이 단면은 hnk로 표지된 신경능선세포를 보여주며, 이 세포는 신경관에서 측면으로 이동합니다.

신경능선세포의 이동 흐름과 신경관에 기여하는 메추라기 세포는 QCPN으로 명확하게 표지되어 있습니다. 후기 단계에서 메추라기 신경능선세포 유래 세포는 최종 표적 조직까지 추적할 수 있습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, QCPN 표지 세포는 상악돌기의 병아리 배아 meen chi 내에 산재되어 있습니다.E five에서, QCPN 항체는 다른 항체와 쉽게 결합하여 메추라기 유래 신경능선 세포의 분화를 검사할 수 있습니다.

호스트 환경에서. 여기에서 볼 수 있듯이 메추라기 신경능선세포 유래 삼차능관 감각 뉴런은 QCPN 및 T UJ one 항체에 의해 표지됩니다. 이 절차에 따라 면역조직화학 및 현장 혼성화와 같은 다른 방법을 수행하여 신경능선세포가 어떤 조직을 생성하는지, 신경능선세포가 다양한 조직으로 분화할 때 어떤 유전자를 발현하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.