Name: 크로스 종 이식에 의한 신경 크레스트 마이 그 레이션과 차별화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 배우세요 메추라기-닭 교배 배아에서 신경 크레스트 세포의 이동과 분화를 추적하는 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에서 세포 운명을 분석하는 데 활용됩니다.

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저자는 원고의 비판에 대한 Lwigale 실험실의 구성원 감사드립니다. SLG는 국립 안과 연구소 (F32 EY02167301)에서 루스 L. Kirschstein NRSA 원정대에 의해 지원됩니다. PYL은 국립 안과 연구소 (EY018050)에 의해 지원됩니다.

1. 원하는 단계까지 품어 병아리와 메추라기 달걀 HH9 배아 들어, 일반적인 배양 시간은 38 ° C. 63시 29~33시간 이르기까지 다양 <ol><li> 미지근한 물로 달걀에서 모든 파편을 씻으십시오. </li><li> 수평 트레이에있는 닭 계란을 마련. 연필 함께 직면하고있는 측면을 선택,이 배아는 현지 예정 지역에 해당됩니다. 메추라기 알을 뭉툭한 끝을 품어. </li><li> 38 장소 ° C humidified 인큐베이터. 기능 락을를 켭니다. </li></ol> 2. 윈도우 및 해부를 위해 계란을 준비 <ol><li> 인큐베이터에서 알을 제거하고, 70 % 에탄올로 정상을 소독. 그것은 에탄올에 뿌리와 달걀 껍질을 통해 에탄올의 흡수를 방지하기 위해 종이 타월이나 Kimwipe로 빨리 닦아 것이 가장 좋습니다. </li><li> 개별 계란 홀더 (우리가 접힌 종이 타올이 줄지어 페트리 접시, 예를 들어, &quot;Kimwipes&quot;를 사용)쪽으로 장소 닭 달걀. AA의 포셉 사용하여 작은 홀 탭계란의 뾰족한 끝에 달걀 껍질의 위쪽 표면에 전자. </li><li> 18시 G 피하 바늘 5 ML의 주사기와 닭고기 달걀의 알부민 빛의 1.5-3mL를 제거합니다. 그것은 계란 (그림 2A)의 뾰족한 끝을 마주 베벨과 함께 구멍에 수직으로 바늘을 삽입하는 것이 가장 좋습니다. 이 방법은 알부민이 철회되면, 실수로 흡입을 통해 노른자를 손상의 위험이 거의 있습니다. 알부민 폐기하십시오. 이 단계는 달걀 껍질에서 열 수있는 창 수 있도록 계란 이내에 노른자와 배아를 낮춰드립니다. </li><li> 위의 설명과 스카치 테이프로 봉인으로 70 % 에탄올로 입구를 닦아주십시오. 그것은 구멍을 둘러싼 달걀 껍질이 완전히없는 상태 알부민 건조 또는 접착제는 밀봉하지 않을 것이 중요합니다. </li><li> AA의 포셉으로, 아직 꼭대기에서 수평 달걀 표시된 위쪽 표면에 다른 구멍을 누릅니다. 포셉은 노른자이나 배아 손상을 방지하기 위해 달걀 껍질을 너무 많이 보내 줘야되지주의를 기울입니다. </li><li> 에달걀 껍질에 구멍 병렬로 곡선 홍채 포셉의 한쪽 면만 sert. 닭 알 껍질에 직경 창의 ~ 2cm를 깰 수 원운동에서 근무 쉘에 엎드려 곤란. 삭제 달걀 껍질 폐기하십시오. 또는 테이프 포장과 계란의 위쪽 표면을 커버하고 창 밖을 잘라 가위를 사용합니다. 이것은 계란으로 떨어지는 달걀 껍질 파편의 기회를 최소화합니다. 난자는 노른자 위에 불투명 디스크로 나타납니다. 어떤 unfertilized 계란 (배반엽 작은 흰 노른자의 표면에 지점이나 부재로 식별) 폐기하십시오. </li><li> 배아를 지보 돕기 위해 배반엽 아래. : 인도 잉크 소량 (최종 농도 100 μg / ML 페니실린과 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 &quot;펜 / Strep&quot;를 포함하는 무균 울리는의 솔루션에 1시 10분을 희석 항생제)을 주사 또는 일mA, 1 ML의 주사기 26 ½ G의 피하 바늘, 바늘의 기지에서 45 ° 각도로 구부 러, 최대 직면 베벨로 사용y는 뽑아 유리 파스퇴르의 pipet 및 입 pipetting 장치를 (피하 주사를 벤딩이나 유리 바늘을 깨는 경우 안구 보호를 착용)을 사용합니다. 노른자의 배반엽의 경계 바깥 막과 가까운 노른자의 표면에, 배아 아래 바늘의 끝을 밀어 찔린 아니라 배아 층에서 (그림 2B). 배아를 대략적으로 충분 잉크를 주사 후 조심스럽게 바늘 (그림 2C)을 철회. 너무 많은 잉크를 주입하면 태아 사망을 초래할 수 있습니다. 그것은이 오염에 대한 원천이 될 수 있으므로, 배아 아래에있는 기포를 주입하지 않는 것이 중요합니다. 주의 :이 절차에 사용된 모든 울리는의 솔루션 소독 및 펜 / 위에서 정의된대로 Strep을 포함합니다. 멸균 인산은 식염수 (PBS)가 또한이 프로토콜의 모든 단계에서 울리는의 솔루션에 대한 수용 가능한 대안입니다 버퍼링된. </li><li> 햄버거와 해밀턴 63에 따라 배아를 무대와 영구 잉크 또는 연필로 달걀 껍질의 무대를 기록합니다. 단계는 최고 stere 아래 평가됩니다omicroscopy, 제한된 열부하가 광섬유 &#39;거위 목처럼 생긴 것 &quot;광원과. </li><li> 적용 2-3 탈수 및 오염을 방지하기 위해 배아의 표면에 따뜻한 멸균 울리는의 솔루션을 떨어뜨 려요. parafilm가 난자의 표면에 걸쳐 뻗어과 함께 일시적으로 창문을 봉쇄. </li><li> 반복 이식 실험을 시작하기 전에 모든 여자는 달걀과 함께 2.2-2.9 단계를 반복합니다. </li><li> 메추라기의 배아에만 공여 조직에 사용되므로 비켜 단계에서 2.2-2.9 생략 수 있습니다. 공여 배아의 전 비켜 준비 들면, 메추라기 계란은 뭉툭한 쪽을 incubated하고 배아를 나타내기 위해 곡선 포셉 함께이 지역에서 열었습니다. 해부 가위를 사용하여 배아 외부 vitelline 막과 배반엽 (모든 인하 충족하는지 확인)을 통해 사각형 모양에서 네번이나 상처를 확인하십시오. 곡선 홍채 집게를 사용하여 부드럽게 한 커팅 에지를 파악하고 난자에서 배아를 채취해서 배양 접시에있는 Ringers 솔루션에 전송할 수 있습니다. 양자 택일로, 하나는 곡선을 사용할 수 있습니다D 홍채는 계란의 배아를 전송하는 데 사용될 수 있습니다, 아래, 또는 배아 스푼이나 실린더의 넓은 부분을 잘라 비닐 트랜스퍼 피펫에서 excised 배아를 들어올리 포셉. 부드럽게 # 5 포셉와 vitelline 멤브레인를 제거합니다. 위와 같이 나머지 메추라기의 배아를 수집하고, 해부 현미경으로 그들을 통제하는 무대. </li></ol> 3. 그라 프트를받을 호스트의 배아를 준비 <ol><li> 호스트 (여자) 배아에서 parafilm를 제거하고 날카롭게 텅스텐 바늘 또는 # 5 집게를 이용하여 신경 튜브 (그림 3A)의 원하는 지역에서 vitelline 막의 작은 구멍을내는 거죠. </li><li> 배아에 울리는의 솔루션의 방울을 추가합니다. 완전히 조직의 탈수를 방지하기위한 모든 절차 중에 울리는의 솔루션에 빠져들 배아를 유지하기 위해주의를 기울입니다. 트랜스퍼 피펫 필요한 경우를 통해 태아의 표면에 울리는의 솔루션의 방울을 추가하는 유지. </li><li> 가져온 유리 바늘을 사용하여 조심스럽게 주동이의 및 CA하다지느러미 신경 튜브에 대한 관심의 길이와 지역에 해당 udal 횡방향 incisions. (아이고, 유리 바늘은 바늘이 기기를 당기는으로 열을 아래 됐네 실리콘 유리 모세관 튜브에서 생성됩니다.) 일방적 이식의 경우 incisions은 지느러미 신경 튜브 루멘으로 확장해야하고, 양국간 이식을 위해, 건너편 incisions하다 전체 지느러미 신경 튜브. 그런 다음 지느러미 신경 튜브와 paraxial mesoderm 사이에 양자 했네요. </li><li> 신경 튜브에서 excised explant을 조심스럽게 분리 후 유리 micropipette (그림 3B)에 aspirating하여 배아에서 제거합니다. </li></ol> 4. 기증자 이식 조직을 준비한다 <ol><li> 무대 일치 메추라기의 배아를 선택합니다. AA의 집게로 배아를 누른 vitelline 막을 제거하고, 소비세 위에서 설명한대로 신경 튜브와 비슷한 크기의 영역 (3.3-3.4) (그림 3A&#39;-B &#39;). 실험의 필요에 따라이 지역이있을 수 있습니다호스트 (여자) 신경 튜브 또는 rostro - 꼬리 축을 따라 다른 영역에서 상호 보완적인 영역입니다. (주의 : 완전한 신경 튜브 이식술을 포함한 큰 지역 이식을 위해, 연구자들은 이전 이식에 공여 조직에서 언제 자기편 mesenchymal 조직을 제거하려면이 단계에서 단백 분해 효소는 소화를 추가할 수도 있습니다 그러나 작은 지느러미 신경 튜브 이식을 위해 초기 단계에서. 신경 튜브 쉽게 엄격 수술 기법에 의해 인접한 mesenchyme에서​​ 분리되는 경우처럼 여기 설명된되는 단백 분해 효소는 소화 필요가 없습니다.) </li></ol> 5. 그라 프트 조직 <ol><li> 울리는의 솔루션을 포함하는 유리 micropipette으로 기증자 explant을 기음. 피펫으로 모든 거품을 소개하지 않도록주의하십시오. </li><li> 여자 호스트의 excised 지역에 인접한 explant을 전송합니다. 동양은 뽑았 유리 바늘을 explant 사용하고 부드럽게 ablated 지역 (그림 3C)에 그것을 가이드. </li><li> 조심스럽게 울리는의 솔루션 몇 방울을 추가탈수를 방지하기 위해 배아합니다. 이것은 이식을 이동시키다 수 있으므로 그라 프트 사이트에 직접 액체를 포기하지 않도록주의를 기울입니다. </li><li> 테이프 포장과 함께 창문을 밀봉합니다. 테이프 봉인 창 계란의 전체 영역을 해당 있는지 확인하십시오. 이것은 이후의 인큐베이션 기간 동안 탈수와 배아의 오염을 방지합니다. </li><li> 원하는 단계까지 배양기에 계란을 반환합니다. chimeras을 잠복기 동안 &quot;락&quot;기능이 꺼져 있는지 확인합니다. 달걀은 부드럽게 손으로 두 번 개발의 후기 단계가 타겟으로하는 경우에는이 그들의 생존을 증가시킬 수로 하루가 설정되어있을 수 있습니다. </li></ol> 6. sectioning 위해 키메라 배아 준비 <ol><li> 실험 종점에서 미세 가위를 사용하여 윈도우를 덮고 테이프를 버려야. </li><li> 곡선 아이리스 포셉 (가장 쉬운 방법은 톱니 모양의 조언과 관계)와 배반엽의 가장자리를 잡고 다음 배반엽의 경계 밖에서 네 큰 상처와 노른자에서 떨어져 배아를 잘라. </lI&gt; <li> 울리는의 솔루션을 포함하는 배양 접시에 배아를 전송합니다. 조직의 탈수를 방지하기 위해 공기와 배아의 노출을 최소화하기 위해주의를 기울입니다. </li><li> stereomicroscopy에서 부드럽게 # 5 집게를 사용하여 배반엽에서 vitelline 막 분리. </li><li> 그것이 평평한 펼쳐 주위의 점막과 함께 계란에 있었던 것처럼 배아가 같은 방향에되도록 접시에서 배아를 조심스럽게을 마련. </li><li> 깔끔하게 접시의 바닥에 텅스텐 와이어 병렬의 길이로, 배아 및 extraembryonic 조직의 경계에서 바늘을 정리하여 배아에서 주변 배반엽를 제거하는 텅스텐 와이어를 64로 만든 바늘을 해부 사용합니다. 조직을 자르기를 부드럽게 톱질 모션을 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 # 5 포셉으로 양막을 제거합니다. 이 시점에서 당신은 더 이상 관심의 영역을 해부하거나, 배아 전체를 떠나 두하실 수 있습니다. </li><li> 얼음 차가운 4 % paraf로 배아를 전송4 ° C.에 ormaldehyde와 하룻밤 바위 </li><li> 샘플을 준비하고 cryo-혹은 파라핀의 sectioning 위해 삽입. </li></ol> 호스트 배아 내에 이식할 조직을 추적. hematoxylin의 염색법에 의한 메추라기 nucleoli의 검출 (메추라기의 핵이 여자는 핵보다 매우 크고 어두운 염색법의 흠도있다), Feulgen-Rossenbeck 반응, acridine-주황색이나 비즈 - benzamide 얼룩을 포함하여 여자의 배아, 안에 메추라기 조직을 식별하는 여러 가지 방법이 필요하다 메추라기 특정 항원 3,47,65,66에 대한 전자 현미경, 또는 immunolabeling과 결합. 여기 메추라기 - 병아리 chimeras (그림 4)에서 메추라기 신경 능선 세포를 식별할 수 있도록 QCPN 항원 및 표준 전체 마운트 또는 섹션 immunofluorescence 기법을 사용합니다. QCPN의 immunofluorescence도 기증자 (메추라기) 조직에서 파생 차별화된 세포를 확인하기 위해 다른 항체와 결합될 수 있기 때문에이 기술은 실험 설계에서 가장 유연성을 제공합니다. standa 사용RD 전체 마운트 또는 섹션 immunofluorescence 기법은 chimeras에 메추라기 파생 세포를 레이블합니다. 7. 대표 결과 다시 부화의 6h 후에 신경 튜브 이식할 지방의 대표적인 이미지 (HH11까지) 호스트 (여자) 신경 튜브 (그림 4A)에 이식할 기증 (메추라기) 조직의 기대 설립을 보여줍니다. reinc​​ubation 후 이식편의 완전 통합, 또는 두개골 지역 또는 somites의 비대칭 발전을 보여주는 태아도 폐기해야합니다. HNK-1 laterally 거리에 신경 튜브에서 마이 그 레이션으로 표시 HH11 쇼 NCCs에 이식할 지방을 통해 섹션을 보도록. 메추리 세포 NCC 철새 스트림에 기여하고, 신경 튜브에들은 분명 QCPN (그림 4B)으로 표시됩니다. 나중 단계에서 메추라기 NCC-파생 세포들은 최종 목표 조직까지 추적하실 수 있습니다. QCPN 표시된 전지는 여자의 배아 mesenchyme 내에 interspersed있다E5 (그림 4C)에서 상악 과정. QCPN 항체 쉽게 호스트 환경에서 메추라기 파생 NCCs의 분화를 조사하기 위해 다른 항체와 결합할 수 있습니다. 메추리 NCC-파생 삼차 감각 뉴런은 QCPN 및 Tuj1 항체 (그림 4D)에 의해 분류된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig1.jpg" /> 1 그림. 실험 절차 및 필요한 악기의 개요.) 호스트 (아가씨)와 기증자 (메추라기) 배아 단계가 일치해야합니다. 삼차 신경절 및 maxillo-mandibular 영역에 기여 NCC 스트림 레이블을 지정하려면 HH9가 이상적입니다. HH9에서 신경 튜브가 주동이의 영역에 가까이하기 시작되지만 아직 완전히 밀폐되지 않습니다. 다이어그램에서 회색 라인은 폐쇄 신경 튜브의 중간선을 나타냅니다. 점선 흰색 라인은 호스트 및 기증자로부터 신경 튜브의 오른쪽의 midbrain 영역을 절개하는 컷 라인을 나타내는 그들bryos. 호스트 배아의 excised 지역은 폐기 및 기증자 조직 키메라 배아를 생성하기에 이식된다. B) 필요한 악기는 다음과 같습니다) 5mL 18과 주사기 ½ G의 피하 바늘, B) 26 1 개 ML의 주사기 ½ 45 ° 각도, C) 인도 잉크에서 G의 피하 주사 바늘 구부러진, D) 투명 포장 테이프, 전자)을 입 pipetting과 유리 피펫 장치, F) 60mm-페트리 접시, G) AA 포셉, H) 톱니 모양의 팁, 내가 가진 곡선 홍채 포셉) # 5 포셉, J) 미세 가위, K)가 나, 텅스텐 와이어를 날카롭게) 유리 바늘, M) parafilm을 뽑아 사각형. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig2.jpg" /> 그림 2. 18 이상적인 삽입 지점을 포함한 계란 계란과 배아의 준비.)가 교차 단면 그림, ½ 알부민 빛의 인출을위한 G의 피하 주사 바늘. B) 라이트 알부민의 ~ 3mL을 철수 후, 노른자와 배아가 연구자 t에서 &quot;창&quot;(화살표)자를 수 있도록 계란 안에 낮춰그는 배아에 액세스할 달걀 껍질. 인도 잉크는 무균 울리는의 솔루션에 희석 1시 10분 후 배아 쉽게 준비에 대한 대비를 제공하기 위해 배반엽 아래에 주입 할 수 있습니다. inking 후 C) 칙의 배아. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig3.jpg" /> 그림 3. 이식 절차의 각 단계에서 약도와 HH 단계 9 기증자와 호스트 배아의 예입니다.) 칙 호스트 배아. vitelline 막가 접목에 대한 두개골 지역에 액세스할 갈라져 있어야 어디 다이어그램에서 점선 줄이 나타냅니다. vitelline 막의 일단 찢어진 삼각형 플랩은 caudally 벗겨해야합니다. 이미지 상자 (BC)에 사용 삽입된 페이지를 나타냅니다. &#39;) 메추리 기증자의 배아. 이미지가 난자에서 excised 및 이식 조직의 절개에 대한 배양 접시에 놓여 기증자의 배아입니다. 이미지 상자에 사용 삽입된 페이지 나타냅니다 (B &#39;). vitelline와 노른자의 점막이 t를 제거하기 위하여 절단해야 어디 도식 다이어그램에서 점선 라인 ( &#39;) 표시계란에서 그는 배아. 이식을 기다리는 excised 신경 튜브 (흰색 화살표)의 일방적 midbrain 지역과 B)를 호스트 배아. 인하는 midbrain 지방 소비세 신경 튜브로 이루어져야 어디 도식 다이어그램에서 점선 나타냅니다. 지느러미 신경 튜브 그래프트 조직과 B &#39;) 기증 배아는 (이식 조직이 흑인 화살촉으로 표시) excised. 상처가 신경 튜브의 midbrain 지방의 접목 일방적 위해 소비세 기증자 조직에 메추라기 배아에서 만든 있어야 할 곳에 다이어그램에서 점선 나타냅니다. 여자는 midbrain 영역으로 메추라기 지느러미 신경 튜브 explant의 접목 후 C) 키메라 배아. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig4.jpg" /> 4 그림. Immunofluorescence 키메라 배아의 기증자 파생 셀에 메추라기 특정 핵 항원 QCPN를 감지. 키메라 HH11가 (HH9에 이식할) 빨간색으로 QCPN의 염색법을 보여주 및 HNK-1 염색법 (NCCs 마이 그 레이션의 마커)의) 전체 마운트 이미지 에녹색. 10X 배율, 지느러미 볼 수 있습니다. 신경 튜브와 철새 NCC HNK-1 (녹색)와 공동으로 물들일에 QCPN - 긍정 메추라기 유래 세포를 보여주는 ()의 배아를 통해 B) 크로스 섹션. 40X 확대. 키메라 E5의 상악 동의 과정을 통해 C) 단면 (3 일 게시물 이식을 위해 incubated), 배아의 최종 위치에 신경 튜브 이식할 지역에서 마이그레이션한 QCPN 양성 NCC-파생 세포 (적색)를 보여주고 있습니다. 10X 확대. TuJ1 - 긍정적인 뉴런 (녹색)으로 삼차 신경절 (적색)과 차별화로 NCC를 파생 메추라기의 키메라 E5 보여주는 기부를 통해 D) 항. 40X 확대. * NCCs, MP, 상악 동의 절차, NT, 신경 튜브, TG, 삼차 신경절.

저자가 공개하는 게 없다.

호스트 여자는 배아에 메추라기 신경 튜브 접목은 rostro - 꼬리 축 21,67-69 따라 여러 지역에서 냄새가 나는데 NCCs 마이 그 레이션의 특정 subpopulations를 추적을위한 간단하고 저렴한 기술이다 여기에서 설명한. 이 기술은 실험적으로 검토하기 위해, 조류 배아 (같은 포유류의 배아에 비해)에 대한 접근의 용이성 활용과 같은 표현 plasmids의 electroporation을 통해 조직 절제, 억제 분자의 주입, 또는 유전자 조작과 같은 다른 기술과 결합 수 있습니다 배아 47,69 내에서 서로 다른 발달 단서에 대한 구체적인 철새 NCC의 인구의 반응. 메추리 - 여자는 chimeras는 NCC 마이 그 레이션과 차별을 조사하고,이 기술은 신경 튜브 이외의 다른 조직의 이식을 포함하도록 적응 수를위한 강력한 도구입니다. 여자의 배아에 메추라기 조직 이식하는 것은 물론 창업 techniqu입니다신경 튜브의 작은 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 칙 달걀 </td><td> 종합 - 우리는 텍사스 A &amp; M 대학의 가금류 과학학과, TX를 사용합니다. </td><td></td></tr><tr><td> 메추리의 계란 </td><td> 종합 - 우리는 Ozarks 에그 회사, MO를 사용합니다. </td><td></td></tr><tr><td> 에그 인큐베이터 (디지털 판독 1,502 운동가 인큐베이터 W / 습도 110-120 볼트 AC) </td><td> <a href="http://www.poultrysupply.com" target="_blank">www.poultrysupply.com</a> </td><td> 1502 </td></tr><tr><td> 뒤몽 AA 포셉, Inox 에폭시 코팅 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11210-10 </td></tr><tr><td> 스카치 테이프 </td><td> 어떤 사무실 공급 가게 </td><td></td></tr><tr><td> 곡선 아이리스 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11065-07 </td></tr><tr><td> 나ndia 잉크 </td><td> 다른 예술 공급 가게 </td><td></td></tr><tr><td> 펜 / Strep (페니실린, 스트렙토 마이신) 솔루션 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 101447-068 </td></tr><tr><td> 투명 포장 테이프 </td><td> 어떤 사무실 공급 가게 </td><td></td></tr><tr><td> 니들 당기는 장치 </td><td> Narashige, 일본 </td><td> PE-21 </td></tr><tr><td> 아이고, 유리 바늘, 1.5-1.8 X 100mm borosilicate 유리 모세관 튜브로 만든 </td><td> 킴블의 추격 </td><td> 34,500 99 </td></tr><tr><td> 5에서 만든 유리 피펫, 압니다 &quot;파스퇴르 피펫을 뽑아 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-678-6A </td></tr><tr><td> 구강 피펫 장치 (보정 microcapillary 피펫을위한 흡인기 튜브 조립체) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A5177-52A </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11251-30 </td></tr><tr><td> 용량 단위gsten 와이어, 0.1mm 직경 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> AA10404-H2 </td></tr><tr><td> 니들 홀더 (니켈 도금 핀 홀더) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 26018-17 </td></tr><tr><td> QCPN 항혈청 </td><td> 발달 연구 하이 브리 도마 은행, 아이오와 대학교 </td><td> QCPN </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 이차 항체 (예, 알렉사 형석 594 염소 항 마우스 IgG1) </td><td> Invitrogen </td><td> A21125 </td></tr><tr><td> 울리는의 솔루션 (2L) : <ul><li> 14.4g NaCl </li><li> 0.34g CaCl 2 </li><li> 0.74g KCl </li><li> 0.230g 나 2 HPO 4 </li><li> 0.04g KH 2 PO 4 </li><li> 2L에 ddH 2 O </li><li> 필터 및 압력솥 </li></ul></td><td> 피셔 과학의 모든 시약 </td><td><ul><li> 7647-14-5 </li><li> 10043-52-4 </li><li> 7447-40-7 </li><li> 7558-79-4 </li><li> 7778-77-0 </li></ul></td></tr></tbody></table>

크로스 종 이식에 의한 신경 크레스트 마이 그 레이션과 차별화 분석

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

조류 배아는 난자 내에서 배아의 쉬운 접근으로 인해 많은 척추 발달 과정을 연구하기위한 독특한 플랫폼을 제공합니다. 메추라기의 공여 조직을 비켜에서 여자의 배아에 이식되는 배아 키메라 조류는 조류 배아에 의해 수여 조작의 용이성과 세포 인구의 씻을 수없는 유전 라벨의 파워를 결합. 메추리 - 여자는 chimeras 1-3 철새 신경 능선 세포 (NCCs)를 추적하는 고전적인 도구입니다. NCCs는 개발 신경 튜브 4 지느러미 지역에서 발생한 배아에서 세포의 과도 철새 인구입니다. 그들은 mesenchymal 전환으로 상피를 받아야하고 이후 그들이 연골 5-13, melanocytes 11,14-20, 뉴런과 glia 21-32 등 다양한 세포 유형으로 차별 배아의 다른 지역으로 마이 그 레이션. NCCs는 multipotent 있으며, 그들의 궁극적인 운명은 influ입니다1) 그들은 배아 11,33-37, 2 rostro - 꼬리 축을 따라 발생한하는 신경 튜브 지역) 그들은 38-44을 마이 그 레이션으로 인접 세포로부터 신호를, 그들의 궁극 3) microenvironment에 의해 enced 배아 45,46 이내 도착. 배아 내에서 그들의 최종 위치와 운명에, 신경 튜브의 원산지 그들의 관점에서 이러한 세포를 추적, patterning 및 organogenesis 조절 발달 과정에 중요한 통찰력을 제공합니다. 기증자 신경 튜브 (접목 homotopic) 또는 기증자 신경 튜브 (접목 heterotopic)의 다른 지역의 상호 보완적인 지역의 이식은 rostro - 꼬리 축 2,47 함께 NCCs 사전 사양의 차이를 밝힐 수 있습니다. 이 기술은 더 이상 한쪽은 기증자의 조직에서 파생되는 이러한 신경 튜브의 일방적인 구획을 이식하기 위해 적응하고, contralateral 사이드 유적 호스트 배아, 이순신에 교란되지 않은 수동일한 샘플 2,47 내에서 내부 통제를 elding. 앞부분은 신경 튜브 47 폐쇄되면 또한, HH10 후, 나중에 태아의 뇌 세그먼트의 이식을위한 적응하실 수 있습니다. 여기 신경 튜브의 이산 세그먼트에서 파생된 철새 NCCs의 추적을 허용 신경 튜브 이식를 통해 메추라기 - 여자는 chimeras 창출을위한 기술을보고합니다. 메추라기 특정 QCPN 항체 48-56 가진 기증자 파생 세포의 종 특정 레이블은 연구자가 실험 종료 시점에서 기증자와 호스트 세포를 구별할 수 있습니다. 이 기술은 저렴, 간단하고, 운명 - 매핑, 추적 세포 혈통, 그리고 rostro - 꼬리 축을 따라 45 미리 patterning 이벤트를 식별하는 등 많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 때문에 조류 배아에 대한 접근의 용이성으로 인해 메추라기 - 여자 그래프트 기술을 포함한 다른 조작, 결합 수 있지만 렌즈 절제 4 국한되지0, 배아의 발달 프로그램의 perturbations에 NCCs의 특정 철새 스트림의 반응을 파악하기위한 억제 분자 57,58, 또는 표현 plasmids 59-61의 electroporation을 통해 유전자 조작의 주입. 또한이 접목 기술은 또한 조류 배아의 조작의 용이성과 함께 마우스 유전학의 전원을 결합하는 craniofacial morphogenesis, 또는 마우스 여자는 chimeras에 NCC의 공헌을 공부하고 같은 메추라기 - 오리 chimeras 등 다른 이종 간의 키메라 배아를 생성하는 데 사용할 수 있습니다 . 62

메추라기 - 병아리 키메라 배아에서 조류 신경 능선 세포의 마이 그 레이션 및 최종 운명을 분석을위한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 unmanipulated 여자의 배아 내에 구별하기 어렵습니다 별도로 마이 그 레이션과 차별화하는 동안 신경 능선 세포를 추적하는 단순하고 간단 기법입니다.

조류 배아는 알 내부의 배아에 쉽게 접근할 수 있기 때문에, 많은 척추동물 발달 과정을 연구하는 데 매우 유용한 플랫폼을 제공합니다. ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 신경능 세포의 이동과 운명을 추적하기 위해 메추라기 배아의 등쪽 신경관 절편을 발달 단계가 일치하는 닭 배아에 이식하는 것입니다. 이를 위해 먼저 숙주 닭 배아의 IGN 막에 작은 구멍을 내어 신경관에 접근합니다. 그 다음, 이식할 조직을 절제하기 위해 공여자 메추라기 배아를 알에서 꺼내 준비합니다.다음 단계에서는 호스트 배아의 신경관에서 관심 영역을 절제합니다. 그 다음, 이식 공여를 위해 공여 신경관에서도 유사한 영역을 절제합니다. 이어서, 공여 신경관을 호스트 신경관으로 이식합니다.마지막으로, 선택한 기관 내에 도달한 신경능세포를 검출하기 위해 키메라 배아를 원하는 단계까지 배양합니다. 최종적으로, 기증자 유래 신경능세포가 숙주 배아의 다양한 위치로 이동하고 분화하는 과정을 면역형광 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다. 미세 절제 및 이식 단계에는 매우 정교한 운동 기술이 필요하여 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.먼저 미온수로 병아리 알의 이물질을 씻어냅니다. 알을 트레이 위에 가로로 배열한 다음, 배아가 위치할 부위를 표시하기 위해 위를 향한 면에 연필로 표시합니다. 공여 배아의 X ovo 준비를 위해 메추라기 다리의 뭉툭한 쪽이 아래로 가도록 배양합니다.다음으로, 알을 38 °C의 가습 인큐베이터에 넣고 로킹(rocking) 기능을 켭니다. 배아가 부화한 후, 70% ethanol을 뿌리고 Kimwipe로 빠르게 닦아내어 상단을 멸균합니다. 알 껍질을 통해 용액이 흡수되는 것을 방지하기 위해, 멸균된 각 알을 여기에 보이는 것처럼 접은 Kimwipe를 깐 페트리 접시와 유사한 개별 알 홀더 위에 놓습니다. 그런 다음 멸균된 AA 핀셋을 사용하여 알의 뾰족한 끝부분인 알 껍질 상단 표면에 작은 구멍을 냅니다.5 mL 주사기에 18.5G 피하주사 바늘을 장착합니다. 그런 다음 바늘의 사면(bevel)이 달걀의 뾰족한 끝부분을 향하게 하여, 달걀 껍질의 구멍에 바늘을 수직으로 삽입합니다. 흡입으로 인해 난황이 우발적으로 손상되는 것을 방지하기 위해, 이전과 같이 구멍을 70% ethanol로 세척하고 스카치테이프로 구멍을 밀봉합니다.그 다음 double A 포셉을 사용하여, 정점은 아니지만 표시해 둔 수평 다리의 윗부분에 구멍을 하나 더 뚫습니다. 이어서, 굴곡진 아이리스 포셉의 한쪽 끝을 알과 평행하게 구멍 속으로 삽입합니다. 그 후 껍질을 아래로 꼬집듯이 누르며 원을 그리듯 움직여 껍질을 제거합니다.닭알 껍질에 지름 2cm의 창을 내고, 제거한 껍질 조각은 버립니다. 배아는 노른자 위에 불투명한 원반 형태로 나타나야 합니다. 노른자 표면에 작은 흰색 점이 있거나 배반(blastoderm)이 없는 것으로 확인된 무정란은 모두 폐기하십시오.이제 적절한 보안경을 착용한 상태에서, 26.5 gauge 피하 주사바늘의 하단부부터 45도 각도로 구부립니다. 구부린 바늘의 사면(bevel)이 위를 향하도록 1 mL 주사기에 연결한 후, 희석된 인디아 잉크를 바늘에 채웁니다. 블래스터(blaster)의 외곽 영역에서 난황막을 찌르고, 바늘 끝을 배아 층에 닿지 않게 주의하며 난황 표면 근처의 배아 아래로 밀어 넣습니다.그다음 배아의 외곽선을 그릴 정도의 잉크만 주입하고, 기포가 들어가지 않도록 주의합니다. 바늘을 조심스럽게 뽑아냅니다. 이제 실체 현미경과 여기에 표시된 광섬유 구스넥 램프와 같이 열 부하가 적은 광원을 사용하십시오.Hamburger-Hamilton 기준에 따라 배아의 단계를 구분합니다. 달걀 껍질에 해당 단계를 기록하십시오. 그 다음, 탈수와 오염을 방지하기 위해 따뜻한 멸균 ringer solution 두 세 방울을 배아 표면에 떨어뜨립니다.그 다음 파라필름을 달걀 표면에 씌워 창 부분을 일시적으로 밀봉합니다. 다음으로 메추리알을 이식 준비합니다. 달걀을 인큐베이터에서 꺼내기 전에 페트리 접시에 링거액을 채웁니다.그다음 곡선 핀셋을 사용하여 알의 뭉툭한 쪽을 열어 배아를 노출시킵니다. 해부 가위를 사용하여 배아 바깥쪽의 융모막과 배반막을 따라 네 번 절개하여 정사각형 모양으로 자르되, 모든 절개선이 서로 맞닿도록 합니다. 그런 다음 곡선 아이리스 핀셋으로 절개된 가장자리 한 곳을 조심스럽게 잡고 배아를 알에서 들어 올려 준비된 페트리 접시에 옮깁니다.마지막으로, 5번 핀셋을 사용하여 난황막을 조심스럽게 제거한 후, 해부 현미경 아래에서 배아의 발달 단계를 확인합니다. 숙주 닭 배아에서 파라필름을 제거합니다. 그다음, 끝을 날카롭게 갈아낸 텅스텐 바늘을 사용하여 신경관의 원하는 부위에서 VII 막에 작은 구멍을 냅니다.배아에 링거액(ringer solution) 한 방울을 첨가합니다. 다음으로, 본 영상에서 수행하는 것과 같은 일측성 이식을 위해, 연마된 유리 바늘을 사용하여 신경관의 중뇌 부위에 가로 방향의 전방 및 후방 절개를 조심스럽게 가하되, 내강을 넘지 않도록 합니다. 그런 다음 등쪽 신경관과 벽측 중배엽 사이를 양측으로 절개합니다.마지막으로, 절제된 X explant를 신경관에서 조심스럽게 분리한 다음, 유리 마이크로 피펫으로 흡입하여 배아로부터 제거합니다. 먼저, 단계가 일치하는 메추라기 배아를 사용하십시오. 그런 다음 방금 보여드린 것과 비슷한 크기의 신경관 영역을 절제하고, 공여체 X explant를 링거 용액이 들어 있는 유리 마이크로 피펫으로 흡입합니다.절제된 부위 인접한 곳으로 X explan을 옮깁니다. 그런 다음, 가늘게 뽑은 유리 니들을 사용하여 ex explan을 유도하여 절제 부위 안으로 부드럽게 정렬시킵니다. 배아의 탈수를 방지하기 위해 링거액(ringer solution)을 조심스럽게 몇 방울 첨가합니다.마지막으로, 패킹 테이프로 창을 밀봉하여 테이프가 창이 뚫린 알의 전체 영역을 완전히 밀봉하도록 한 다음, 원하는 단계에 도달할 때까지 알을 인큐베이터에 넣습니다. 배아를 배양하는 동안 로킹(rocking) 기능은 꺼두되, 생존율을 높이기 위해 하루에 두 번씩 손으로 조심스럽게 돌려줍니다. 발달의 더 후기 단계를 목표로 하는 경우, HH 11까지 6시간 동안 재배양한 후 신경관의 이식 부위를 촬영한 이 대표 이미지는 이식된 메추라기 공여 조직이 호스트 닭의 신경관으로 성공적으로 통합된 모습을 보여줍니다. HH 11 단계에서 이식 부위를 가로지르는 이 횡단면은 hnk로 표지된 신경능 세포를 보여주며, 그중 하나가 신경관에서 측면으로 이동하고 있습니다.신경능 세포 이동 흐름과 신경관에 기여하는 메추라기 세포들이 QCPN으로 명확하게 표지되었습니다. 후기 단계에서는 메추라기 신경능 유래 세포들이 최종 표적 조직까지 추적될 수 있습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, QCPN 표지 세포들이 닭 배아 상악돌기의 중간 부위 내에 흩어져 있습니다. E5 단계에서 QCPN 항체는 다른 항체들과 쉽게 병용하여 메추라기 유래 신경능 세포의 분화를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.숙주 환경 내에서의 모습입니다. 여기서 보는 바와 같이, 메추라기 신경능세포 유래 삼차신경 감각 뉴런들이 QCPN 및 T UJ one 항체에 의해 표지되었습니다. 이 절차 이후에, 신경능세포가 어떤 조직으로 분화하는지, 그리고 다양한 조직으로 분화함에 따라 어떤 유전자를 발현하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역조직화학 및 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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