종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

본 절차의 전반적인 목표는 실시간 세포 간 상호작용의 라이브 세포 이미징에 사용될 유방 구조 및 미세환경 엔지니어링, 즉 MAM이라 불리는 3D 공동 배양 모델을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 커버 슬립을 피브로블라스트 D 퀀칭, 즉 DQ collagen one 콜라겐 1 매트릭스로 코팅함으로써 수행됩니다.

다음으로 quenching된 collagen IV를 준비합니다. 응고된 DQ collagen IV 위에 재구성된 기저막 매트릭스를 추가하며, 이는 섬유아세포가 내장된 collagen IV 매트릭스가 됩니다. 세 번째 단계로, 상피세포 또는 종양 세포 현탁액을 커버슬립 위에 층층이 도포하여 세포가 DQ collagen IV 및 재구성된 기저막 매트릭스에 부착되도록 한 후 배지를 첨가합니다.

마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 유방암 공동 배양의 3차원 공간 차원과 시간 차원을 함께 분석하는 4D 이미징을 수행합니다. 궁극적으로 4D 이미징을 통해 유방암 세포와 종양 미세환경 내 다른 세포들 사이의 역동적인 상호작용을 시각화하고 분석할 수 있으며, 이는 침습적 표현형으로의 진행에 영향을 미칠 수 있습니다. 생체 내(intra vital) 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 관찰되는 상호작용이 예를 들어 인간 종양 세포와 마우스 기질 세포 사이가 아니라, 인간 종양 세포와 인간 종양 관련 세포라는 동일 종의 세포들 사이에서 일어난다는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 메인 코어 배양물을 조립하는 과정을 먼저 시각적으로 파악해야 하며, 성공을 위해 어느 정도의 기술과 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 알코올로 멸균된 직사각형 플라스틱 커버 하나를 배치합니다. 35mm 배양 접시에 넣거나 IBI tree 35mm mu 접시를 사용하십시오.

그런 다음 원하는 수의 섬유아세포를 DQ collagen과 혼합합니다. 다음으로, 100 µL 마이크로 피펫을 사용하여 섬유아세포 DQ collagen(1 collagen 1 matrix) 70 µL를 커버슬립 전체 표면에 조심스럽게 분주하여 펴 바른 후, 배양 접시를 이산화탄소가 없는 37 °C 습윤 배양기에 넣고 30분 동안 둡니다. 매트릭스가 응고된 후, 5% 이산화탄소가 포함된 37 °C 배양기에서 10분 동안 평형을 맞춥니다.

그 다음, 디쉬를 후드 아래에 두고 실온이 될 때까지 둡니다. 응고된 DQ collagen 위에 60 µL의 DQ collagen, four reconstituted basement membrane matrix를 추가하고, 섬유아세포가 포함된 collagen one matrix를 올립니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 섬유아세포가 포함된 DQ collagen one, collagen one matrix에 긁힘이 생기지 않도록 주의하며 DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix를 고르게 펴 바릅니다.

그 다음, DQ collagen IV 재구성 기저막 매트릭스가 응고되는 동안 디쉬와 커버슬립을 5% carbon dioxide가 포함된 37 °C 인큐베이터에 10분 동안 보관하며, trypsin 처리된 세포의 수를 세어 공동 배양을 준비합니다. 이제 세포 현탁액 50 µL를 코팅된 커버슬립 위에 분주하고, 세포가 DQ collagen IV 재구성 기저막 매트릭스에 부착될 수 있도록 5% carbon dioxide가 포함된 37 °C 인큐베이터에 40~60분 동안 보관합니다. 세포가 매트릭스에 부착된 후, 2% 재구성 기저막이 포함된 배양액 2 mL를 35 mm 디쉬에 첨가합니다.

그런 다음 PBS로 세척한 후, 원하는 시간 동안 배양하여 이미징합니다. 공동 배양물을 MEGM 배지 내 5 µM Cell Tracker Orange와 함께 37 °C, 5% CO2 배양기에서 45분 동안 배양합니다. 배양 후, 공동 배양물을 다시 PBS로 세척하고 예열된 MEGM 배지와 함께 37 °C, 5% CO2 배양기에서 30분 동안 배양합니다. 공동 배양물을 저배율(예: 공초점 현미경의 수침 렌즈를 이용한 10x)로 생세포 이미징하며, 구조물의 전체 깊이에 걸쳐 10 µm 간격으로 광학 절편을 캡처합니다.

velocity 소프트웨어 또는 유사한 프로그램을 사용하여 광학 절편을 3D로 재구성하십시오. 구조, 세포 간 상호작용 및 주변 매트릭스와의 상호작용을 시각화할 수 있도록 3D 재구성 영상을 제작하십시오. 이 대표적인 공동 배양 모식도에서는 IBI 처리 µ-dish를 먼저 콜라겐으로 코팅했으며, 하나에는 DQ collagen이 포함되어 있고, 다른 하나에는 여기 magenta 색으로 표시된 섬유아세포가 포함되어 있습니다.

그런 다음 DQ collagen four가 포함된 재구성 기저막의 두 번째 층을 추가했습니다. 이어서 빨간색으로 표시된 종양 세포를 그 위에 도말하고 2% 재구성 기저막 내에서 배양했습니다.

크림색 점으로 표시된 배지는 배지를 교체할 때마다 겹쳐서 표시되었습니다. DQ collagen one 및 four의 형광 분해 산물은 녹색으로 표시되었습니다. 이 대표적인 MCF 10 DCIS와 WS 12 TI 공배양의 23일 동안, 여기와 다음 그림들에서 빨간색으로 표시된 세포의 증식과 여기 및 다음 그림들에서 녹색으로 표시된 DQ collagen four 및 one의 분해가 관찰되었으며, 공배양 부피의 감소로 나타난 콜라겐 매트릭스의 분해가 확인되었습니다.

동일한 생세포 공배양물을 23일 동안 관찰하였으며, 공배양 3일, 16일 및 23일에 공초점 현미경으로 이미지를 캡처하였습니다. Mame 공배양물의 상호작용은 역동적이며 시간이 지남에 따라 변화할 수 있습니다. 예를 들어, 공배양 3일 차의 세포 멤(cell mam) 3D 모델에서 볼 수 있듯이, 이 시점의 세포들은 매트릭스 내에서 막 증식하기 시작했으며, 녹색 형광이 나타나지 않는 것으로 보아 여전히 상당히 안정적인 상태입니다.

하지만 16일째가 되면, 세포가 계속해서 증식함에 따라 여기서 초록색으로 관찰되는 DQ collagen 1 및 4 분해 산물과, 매트릭스와 세포가 함께 형광을 내어 노란색으로 관찰되는 세포에 의한 활발한 매트릭스 분해가 시작되었음을 알 수 있습니다. 공배양 부피가 110,000 µm³였던 3일째와 비교했을 때, 23일째에는 빠르게 증식하는 세포들에 의해 매트릭스의 거의 절반이 분해되었습니다. 16일에서 23일 사이에 부피는 해당 일자에 단 46,250 µm³까지 감소했습니다.

16 공동 배양에서, 빨간색으로 표시된 DCIS 세포 표면의 DQ collagen four 단백분해와 흰색으로 표시된 섬유아세포 주변 영역의 확산된 DQ collagen one 단백분해가 관찰될 수 있습니다. 이 공동 배양에 사용된 차등 염색을 통해 두 세포 유형의 발달 후 뚜렷한 이동 및 증식 패턴을 관찰할 수도 있습니다. 이 기술은 유방암 분야의 연구자들이 암세포와 주변 기질 세포 간의 동적인 상호작용을 실시간 세포 이미징으로 확인하여, 종양 거시환경이 암 진행에 미치는 영향을 탐구하는 길을 열어주었습니다.