Name: 종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 유방 종양 세포와 미세환경의 실시간 상호작용을 4D 라이브 세포 이미징으로 분석하는 MAME 3D 공배양 모델을 구축하는 방법을. 이 기법은 침윤 표현형 진행 메커니즘 연구와 전임상 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 R01 CA131990 (BFS 및 RRM)의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원되었다. 라이브 세포 이미징은 Karmanos 암 연구소, 웨인 주립 대학 및 아동 건강 및 개발 국립 연구소의 Perinatology 조사 지점에 의해 NIH 센터 보조금 P30 CA22453 의해 일부 지원 현미경, 이미징 및 Cytometry 자원 코어에서 수행되었다 , 웨인 주립 대학교.

1. 아이스크림 - 기판을 준비한다 <ol><li> 허용 아이스크림 - 기판은 4 ° C.에 50 μl aliquots 및 매장으로, 탈이온수에서 아이스크림-기판의 1 밀리그램 / ML의 재고 솔루션을 준비 열기 튜브 전에 실내 온도에 격차 따뜻하게 동결 건조된 </li></ol> 그것은 ~ 50-5 분, 열이 ° C 분산을 촉진하기위한 초음파 중탕 냄비에서 아이스크림 - 기판을 선동하는 데 필요할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 4에 하룻밤 얼음 해동의 rBM는 ° C; rBM 항상 얼음 다루어 져야합니다. </li><li> 10X 인산염을 만들려면 염분이 (PBS), 80g NaCl을 용해 (1.37 M), 2g KCl (0.027 M), 14.4 g 나 2 HPO 4 (1 M) 및 2.4 g KH 2 PO 4 (0.02 M)에서는 버퍼 800 ML의 ultrapure 물. 1.0 M HCL과 7.4로 PBS 버퍼 용액의 산도를 조정합니다. 볼륨 1리터에 지참, 여과하여 멸균. </li><li> 냉장 콜라겐 전 냉장 10X PBS 1 일부로 8 부품 : 얼음 콜라겐 전 솔루션을 준비합니다. 산도를 조절혼합물의 멸균 0.1 M NaOH를 사용하여 7.2-7.6 있습니다. 산도 스트립과 산도를 확인하고 멸균 물로 10 부분에 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 각각, 25 μg / ML 및 2.4 밀리그램 / ML의 최종 농도로 prechilled 튜브에 콜라겐 전 용액에 아이스크림 - 콜라겐 봐도 diluting하여 콜라겐 나는 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 전을 준비합니다. </li><li> 각각, 25 μg / ML 및 12-15 밀리그램 / ML의 최종 농도로 prechilled 튜브 rBM에서 아이스크림 - 콜라겐 IV를 (Cultrex 혹은 Matrigel) diluting에 의해 재구성 지하 막 (rBM) 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 IV를 준비합니다. 거품을 만드는 피하기 위해 부드러운 pipetting을 사용하여 얼음에 섞는다. </li></ol> 2. MAME cocultures 준비 cocultures의 개략도 그림 1을 참조하십시오. <ol><li> 장소 35 mm 배양 접시 또는 IbiTreat μ-요리 35-mm를 사용하여이 사각형 플라스틱 coverslips (10 분, 공기 건조를 위해 70 % 알코올로 소독). 여기 오시는 길 우리가 스튜에 사용하는 coverslips 및 μ-요리 모두를위한직립 현미경에 죽는다. 거꾸로 현미경에 대한 연구를 위해, 우리는 μ-접시를 사용합니다. </li><li> 콜라겐 나는 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 I과 섬유아 세포의 원하는 번호를 섞는다. 콜라겐 나는 매트릭스 : 그림 2와 3에서 그림 장기 cocultures 위해서는 미디어의 10 μl 플러스 아이스크림 - 콜라겐 전 60 μl 500 섬유아 세포를 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 피펫은 100 μl micropipettor를 사용하고 fibroblast의 70 μl 확산 : 아이스크림 - 콜라겐 I : 콜라겐 I 행렬 각 coverslip의 전체 표면 이상 고체화하기 위해 30 분 동안 CO 2없이 humidified 배양기에서 37 ° C에서 떠나야합니다. </li><li> 양도 35-mm 평형하는 10 분 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 요리. </li><li> 인큐베이터에서 제거하고 그들이 실내 온도에 올 때까지 후드를 35-mm 요리를 둡니다. </li><li> 경화 아이스크림 - 콜라겐 제가 위에 rBM 매트릭스 : 임베디드 섬유아 세포와 콜라겐 I 행렬 아이스크림 - 콜라겐 IV의 60 μl를 추가합니다. 피펫 팁, CA와아이스크림 - 콜라겐 나 : 저는 콜라겐 매트릭스 fibroblast를 긁적 피하 골고루 rBM 매트릭스 : refully 아이스크림 - 콜라겐 IV 뿌리 더군요. </li><li> 양도 35-mm 고체화하는 10 분 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 요리. 아이스크림 - 콜라겐 IV 동안 rBM 행렬이 응고되어 trypsinize과 상피 세포를 계산합니다. </li><li> rBM 매트릭스 : coverslips 향해 상피 / 종양 세포 현탁액의 장소 50 μl는 아이스크림 - 콜라겐 IV와 코팅. 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 장소 35-mm 요리. rBM 매트릭스 : 전지 40-60 분 아이스크림 - 콜라겐 IV에 연결하도록 허용합니다. 그림 2와 3에서 그림 장기 cocultures 위해 2500 상피 또는 종양 세포를 사용합니다. </li><li> 각각 35 mm 접시에 2 % rBM를 포함하는 배지 2 ML을 추가합니다. 어떠한 약물 치료를하는 경우, 약물이 시간에 추가되어야합니다. </li><li> 이미징 전에 시간 원하는 기간 동안 품어. 장기 배양의 경우, 미디어마다 3~4일 변경해야합니다. 세포 유지하실 수 있습니다그들의 정상적인 문화 매체 인치 유방암 세포 라인 MAME cocultures 위해 MEGM의 SingleQuots로 보충 상피 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간에 (MEBM-PRF)을 사용합니다. </li></ol> 3. 공촛점 현미경으로 살아있는 MAME cocultures의 4D (3D + 시간) 이미징을 수행 <ol><li> 그림 증명 주요 연구 내용은 MAME cocultures 우리의 출판 절차 1에 따라 형광 셀 추적 염료로 분류했다. 이미징 전에 5% CO 2 배양기와 37 ° C에서 PBS로 세척 후 cocultures는 37 ° C 배양기에서 45 분 동안 MEGM 매체에 5 μm의 제품 CellTracker의 오렌지와 incubated했다 PBS로 다시 씻어 30 분 prewarmed MEGMmedium 함께 incubated . </li><li> 이미지 MAME cocultures은 자이스 혈구 LSM-510 메타 공촛점 현미경의 낮은 배율 (10X, 물 마른 렌즈)에 살고 있습니다. </li><li> 광학 부분은 구조의 전체 깊이에 걸쳐 간격으로 캡처됩니다. 우리의 연구에 대해서는 10 광학 부분을 캡처μm의 간격. </li><li> 3D의 이미지를 재구성하기 위해 광학 섹션을 사용합니다. 우리는 3 차원 reconstructions를 생성합니다 Volocity 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 세포 상호 작용과 그 주변 매트릭스와 상호 작용을 시각이 될 수있다 : 구조, 세포 있도록 3D reconstructions의 동영상을 확인하십시오. 우리는 QuikTime 플레이어 7에서 영화를했다. </li></ol> 4. 대표 결과 우리가 개발한 MAME cocultures은 유방 종양과 그 microenvironment을 구성하는 다양한 세포 성분 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 취급하기 쉬운 실험 모델입니다. 여기에 휴대폰 요점을 되풀이하는 MAME 모델의 기능을 설명 : 유방암의 진행 중에, 라이브 세포 이미징의 세포 상호 작용은 시간이 지남에 따라 이러한 상호 작용을 수행합니다. 우리는 이상, preinvasive MCF10.DCIS 인간 유방암 세포주와 인간의 유방 암 관련 fibroblast 라인, WS-12Ti 사이의 이미지 상호 작용에 대한 능력을 보여주는문화의 3 주 이상의 기간. cocultures 3, 16, 23 일 정도 몇 군데 있었다. cocultures의 전체 볼륨을 통해 광학 부분은 그림 2에서 세 timepoints 각각에 대해 표시됩니다 3D 및 대표 예제 년에 복원되었다. 그림 2의 붉은 형광은 MCF10.DCIS 및 WS-12Ti 세포를 나타냅니다. 두 세포 유형 간의 장기 cocultures에 대한 차별하기 위해, 하나는 문화를 확립하기 전에 형광 단백질에 각각의 셀 유형을 transfect 또는 transduce 수 있습니다. differentially 식별을위한 형광 단백질로 분류되어 MCF10.DCIS 및 WS-12Ti 세포의 MAME의 coculture는 그림 3과 그림한다. 통합 기판으로,이 경우 아이스크림 - 콜라겐에 MAME cocultures로, 우리는 침략 표현형으로의 전환과 관련된 proteolysis의 시간이지나면서 변화를 평가하고 계량하실 수 있습니다. 우리는 형광 절단 제품을 quantifying위한 메소드를 설립했습니다 그 결과아이스크림 - 콜라겐 저하 2,3에서. 우리는 레이블링 및 세포 핵을 세어 당 셀 단위로 MAME cocultures의 전체 3D 볼륨에 걸쳐 저하 제품을 정상화. 더욱이, 우리는 세포와 세포 내 구획에 저하를 집중하고 우리가 이전에이 설명한 것처럼 총 세포내 및 세포외 저하 제품을 계량하실 수 있습니다. 그림 2와 3의 녹색 형광은 두 개의 아이스크림 - 콜라겐 기판 절단 제품을 나타냅니다. 이때 differentially-라벨이 콜라겐은 우리가 유형 나 콜라겐 유형 IV는 콜라겐과 열화의 저하를 구분할 수 있겠 사용할 수 없습니다. MAME cocultures의 상호 작용은 동적이고 시간이 지남에 따라 변경할 수 있습니다. 현세와 동적 정보를 얻으려면,보기 같은 분야는 주 분부터 일정 기간 동안 반복해서 볼륨의 전체 표본을 통해 찍은 몇 군데와 광학 섹션 수따라서 4-D에 데이터를 수집. 그림 2에서는 23 일 동안에 발생할 오히려 극적인 변화를 보여주는 : 휴대폰 번호의 변화, 세포 마이 그 레이션 및 세포 상호 작용, 구조 볼륨, 구조 모양, 구형의 구조의 편차, 침략 outgrowths과 proteolysis합니다. 또한, 우리는 또한 인한 MAME cocultures로 볼륨의 전반적인 변화를 보여주는 굴욕적인 그들의이 기간 동안 세포외 기질을 둘러싼. 그림 2A에서 그림과 같이 삼일에서 볼륨 110000 μm의 3. 반면, 16 23일에서 MAME cocultures의 볼륨은 그림 2B와 C로 그림에만 46250 μm의 3입니다 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig1.jpg" /> 1 그림. MAME cocultures.의 개략도는 플라스틱 coverslip는 아이스크림 - 콜라겐 I 및 섬유아 세포 (마젠타)를 포함하는, 콜라겐 나는 코팅됩니다. 아이스크림 - 열을 포함하는 재구성 지하 막의 두번째 레이어 (rBM)lagen IV가 추가됩니다. 종양 세포 (적색)은 위에 도금과 문화 미디어의 2 % rBM는 오버레이 (흰색 도트) 미디어의 모든 변화가있는가 있습니다. 녹색은 아이스크림 - 콜라겐 I와 IV의 형광 절단 제품을 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig2.jpg" /> 그림 2. MCF10.DCIS 인간 유방암 세포와 WS-12Ti 인간 유방 섬유아 세포의 MAME cocultures. 섬유아 세포는 콜라겐 아이스크림 - 콜라겐 IV를 포함 rBM와 I / 아이스크림 - 콜라겐 I 및 오버레이에 박혀 있었다. DCIS 세포 그런 다음 2 % rBM을 포함 매체와 rBM 및 오버레이에 놓는되었다. cocultures의 볼륨의 감소에 표시된대로 여기에 그림 coculture에서 23 일 동안 세포 증식, 아이스크림 - 콜라겐 IV와 (녹색)과 콜라겐 매트릭스의 저하가 발생했습니다. 세포 이미징 (적색)하기 전에 원래의 장소에 CellTracker의 오렌지와 레이블링에 의해 현지되었다. 같은 라이브 cocultures는 C로 촬영한 이미지를 23 일 동안 관찰되었다coculture 3, 16, 23 일 정도 onfocal 현미경. 그 결과 광학 조각은 Volocity 소프트웨어로 3D 년에 복원되었다. 배율, 10X. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig3.jpg" /> 그림 3. MAME 16일의 MCF10.DCIS 인간 유방암 세포와 WS-12Ti 인간 유방 섬유아 세포의 cocultures 그 각각 명시 RFP (적색)와 YFP (흰색). Cocultures 설립과 그림 2에서와 같이 분석했다. 여기에 표시된 두 세포 유형은 그러나 differentially 그들은 서로 구분할 수 있도록 분류 하였다. 이 그림에서 높은 배율 이미지, 그림 2에서 이들에 비해, DCIS 세포 및 섬유아 세포 근처 분야에서 아이스크림 - 콜라겐 내의 확산 proteolysis의 표면에서 아이스크림 - 콜라겐 IV의 proteolysis를 보여줍니다. 배율, 20X.

<ol><li>Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+proteolysis%3A+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).</li>
<li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+protease+activity+in+living+cells%3A+from+two+dimensions+to+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).</li>
<li>Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+hepatocyte+growth+factor+promotes+invasion+of+human+mammary+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ.</a> Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).</li>
<li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+live-cell+imaging+demonstrates+that+beta1-integrin+promotes+type+IV+collagen+degradation+by+breast+and+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells.</a> Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).</li>
<li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21-activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> Neoplasia. 10, 314-328 (2008).</li>
<li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+quantifying+the+dynamics+of+tumor+associated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).</li>
<li>Cavallo-Medved, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+demonstrates+that+proteases+in+caveolae+of+endothelial+cells+degrade+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix.</a> Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).</li>
<li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microvasculature+and+microenvironment%3A+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

보여준 바와 같이, MAME cocultures은 유방 종양과 그 microenvironment을 구성하는 다양한 세포 성분 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징에 사용될 수 있습니다. 저희 연구실에서는 지속적인 연구에서 우리는 proteolytic DCIS의 침략 ductal 암종으로의 전환과 연관된 경로뿐만 아니라 같은 케모카인 / 시토킨 / 성장 인자의 통로로서 이런 변화에 참여 proteolytic 경로와 다른 경로 간의 상호 작용을 확인하기 위해 MAME cocultures을 사용한 . 우리는 더 MAME 모델, 작은 분자 억제제의 효과를 심사한 proteolytic / 케모카인 / 시토킨 / 성장 인자 경로에게 3-5 변조 항체 또는 shRNAs을 차단하기위한 도구로 사용될 수 있다고했다. 여기에 그림 2와 3의 그림과 같이 우리가 이전에 주, 6,7 보여준대로 MAME 모델, 분, 시간에 이르기까지 배 이상의 종양 성장, 침략과 proteolysis의 라이브 세포 이미...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 재구성 지하 막 (Cultrex) </td><td> Trevigen </td><td> 3445-005-01 </td><td> Matrigel (BD Biosciences)과 비교 </td></tr><tr><td> 콜라겐 전 </td><td> 응집 연구소 </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> 아이스크림 - 기판 (콜라겐 I, IV) </td><td> Invitrogen </td><td> 아이스크림 - 열 I-D12060 아이스크림 - 열 IV D12052 </td><td></td></tr><tr><td> 22-mm 플라스틱 coverslips </td><td> 피셔 과학 (주) </td><td> 12-547 </td><td> 10 분하고 사용 전 공기 건조를 위해 70 %의 에탄올에두고 반으로 잘라. </td></tr><tr><td> 세포 배양 배지 </td><td> Lonza </td><td> MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 </td><td> 붉은 무료로 페놀 </td></tr><tr><td> μ-접시를 ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80,136 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity 소프트웨어 </td><td> Perkin-엘머 </td><td> 버전 5.5 </td><td> 이미징 소프트웨어의 다른 브랜드는 3D reconstructions 및 동영상을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table>

종양의 4d 라이브 세포 이미징을위한 mame 모델 : microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

세포 상호 작용 : 우리는 용어 MAME (M ammary rchitecture 및 M icroenvironment 전자 ngineering), 그리고이 세포의 실시간 라이브 세포 이미징을 위해 그들을 이용하는 3D coculture 모델을 개발했습니다. 우리의 전반적인 목표는 침입 표현형 자신의 진행을 공부하는 preinvasive 유방 병변의 구조를 요점을 되풀이 모델을 개발하는 것이었습니다. 특히, 우리는 침략 ductal carcinomas에 preinvasive 유방 상피 세포의 진행을 강화하거나 감소에 연루되어 종양 microenvironment의 사전 악성 유방 상피 세포 변형 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 분석하는 모델을 개발했습니다. 다른 세포 유형의 최신 연구는 myoepithelial 세포, 섬유아 세포, macrophages과 혈액 및 림프의 microvascular 내피 세포 수 있습니다. 동안 유방 내에서 세포 상호 작용 요점을 되풀이하도록 설계되었습니다 MAME 모델 외에도암 진행, 우리는 전립선 암의 진행에 대해 비교 가능한 모델을 개발했습니다. 여기에서 라이브 세포 이미징 및 현장에서 유방 ductal 암종 (DCIS) 시간이 지남에 침입 표현형에 대한 세포 및 섬유아 세포의 cocultures의 전환을 수행하는 기능 proteolysis 분석의 사용과 함께 3D cocultures 설립을위한 절차를 설명 문화 이십삼일 이상이 경우. MAME cocultures은 여러 개의 레이어로 구성되어 있습니다. 섬유아 세포는 종류 나 콜라겐의 맨 아래 레이어에 포함됩니다. 그 문제는 DCIS 세포가 놓는이되는 재구성 지하 막 (rBM)의 레이어를 배치됩니다. 2 % rBM의 최종 상위 계층이 포함되어 있으며 미디어의 모든 변화 보충함있다. 침입 표현형에 진행과 관련된 영상 proteolysis에, 우리는 (아이스크림) 염료 침묵 형광등 매트릭스 단백질 (아이스크림 - 콜라겐 나 RB의 중간 계층과 혼합 콜라겐 I과 아이스크림 - 콜라겐 IV의 레이어와 혼합을 사​​용하여M)하고 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 문화를 관찰합니다. 광학 부분은 캡처 처리 및 Volocity 시각화 소프트웨어와 3D 년에 복원되었습니다. MAME cocultures 23 일 과정 동안, DCIS 전지는 분아 따위에 의해 중식 대형 침략 구조로 뭉쳤다. 섬유아 세포는 마이 그 레이션하고 이러한 침략적 구조에 포함된다. 콜라겐의 형광등 proteolytic 조각 DCIS 구조의 표면으로 협회에서 발견되며, intracellularly, 또한 주변의 매트릭스에 걸쳐 분산. 대상 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로 또는 cocultures의 세포 성분의 개조가 MAME 모델 소설 치료적 접근에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수있는 제안, invasiveness을 줄일 수있는 약물.

우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

본 연구진은 MAME(유선 구조 및 미세환경 공학, mammary architecture and microenvironment engineering)라고 명명한 3D 공배양 모델을 개발하였으며, 이를 ...에서의 살아있는 세포 이미징(live-cell imaging)에 활용하였습니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 실시간 세포 간 상호작용의 라이브 세포 이미징에 사용할 수 있도록 유방 구조 및 미세환경 공학(mammary architecture and microenvironment engineering, MAM)이라 명명된 3D 공동 배양 모델을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 커버슬립을 fibroblast D quenched, 또는 DQ collagen one 콜라겐 1 매트릭스로 코팅함으로써 달성됩니다.다음으로 DQ 퀀칭 콜라겐(quenched collagen)을 준비합니다. 응고된 DQ 콜라겐 I 매트릭스 위에 재구성된 기저막 매트릭스(bassent membrane matrix)를 추가하여, 섬유아세포가 내포된 콜라겐 I 매트릭스를 형성합니다. 세 번째 단계에서는 상피 세포 또는 종양 세포 현탁액을 커버슬립 위에 층을 이루도록 도포하여 세포가 DQ 콜라겐 IV 재구성 기저막 매트릭스에 부착되도록 한 후, 배지를 추가합니다.마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 mam 공동 배양의 3차원 공간 및 시간 차원을 분석하는 4D 이미징을 수행합니다. 궁극적으로 4D 이미징을 통해 유방암 세포와 종양 미세환경의 다른 세포들 사이의 역동적인 상호작용을 시각화하고 분석할 수 있으며, 이는 침습적 표현형으로의 진행에 영향을 미칠 수 있습니다. 생체 내 이미징(intra vital imaging)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 관찰되는 상호작용이 예를 들어 인간 종양 세포와 마우스 기질 세포 사이가 아니라, 인간 종양 세포와 인간 종양 관련 세포라는 단일 종의 세포들 사이에서 일어난다는 점입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 메인 코어 배양물을 조립하는 과정을 먼저 시각적으로 이해해야 하며, 성공을 위해서는 어느 정도의 기술과 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 알코올로 멸균한 직사각형 플라스틱 커버 한 개를 배치하십시오. 이를 35 mm 배양 접시에 넣거나 IBI tree 35 mm mu 접시를 사용하십시오.그런 다음 원하는 수의 섬유아세포를 DQ 콜라겐과 혼합합니다. 다음으로, 100 µL 마이크로 피펫을 사용하여 70 µL의 섬유아세포 DQ 콜라겐(1-collagen 1-matrix)을 커버슬립 전체 표면에 조심스럽게 피펫팅하여 도포하고, 배양 접시를 이산화탄소가 없는 37 °C 습윤 배양기에 30분 동안 둡니다. 매트릭스가 응고된 후, 5% 이산화탄소가 포함된 37 °C 배양기에서 10분 동안 평형을 유지하도록 합니다.그런 다음 디쉬를 후드 아래에 두고 실온이 될 때까지 둡니다. 응고된 DQ 콜라겐 위에 DQ collagen, four reconstituted basement membrane matrix 60 µL를 첨가하고, 섬유아세포가 내장된 collagen one matrix를 올립니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 섬유아세포가 포함된 DQ collagen one, collagen one matrix에 긁힘이 생기지 않도록 주의하며 DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix를 고르게 펴줍니다.그 다음, DQ collagen IV reconstituted basement membrane matrix가 응고되는 동안 디쉬와 커버슬립을 5% carbon dioxide 농도의 37 °C 인큐베이터에 10분간 옮겨 둡니다. 그 사이 trypsin을 처리한 세포를 분리하여 공동 배양을 위한 세포 수를 측정합니다. 이제 세포 현탁액 50 µL를 코팅된 커버슬립 위에 분주하고, 세포가 DQ collagen IV reconstituted basement membrane matrix에 부착될 수 있도록 디쉬를 5% carbon dioxide 농도의 37 °C 인큐베이터에 40~60분간 넣어 둡니다. 세포가 매트릭스에 부착된 후, 2% reconstituted basement membrane이 포함된 배양액 2 mL를 35 mm 디쉬에 첨가합니다.그런 다음 PBS로 세척한 후, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 5 µM의 Cell Tracker Orange가 포함된 MEGM 배지로 공배양물을 45분 동안 배양합니다. 배양 후 공배양물을 PBS로 다시 세척하고, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 미리 데워둔 MEGM 배지와 함께 30분 동안 배양합니다. 공배양물을 저배율(예를 들어, 공초점 현미경의 water dipping 렌즈를 사용하여 10x)로 이미징합니다. 구조물의 전체 깊이에 걸쳐 10 µm 간격으로 광학 절편을 캡처합니다.velocity 소프트웨어 또는 유사한 프로그램을 사용하여 광학 섹션을 통해 이미지를 3D로 재구성하십시오. 구조, 세포 간 상호작용 및 주변 기질과의 상호작용을 시각화할 수 있도록 3D 재구성 영상을 제작하십시오. 이 대표적인 공동 배양 도식도에서, IBI 처리된 mu dish는 먼저 콜라겐으로 코팅되었으며, 하나는 DQ 콜라겐을 포함하고, 다른 하나는 여기에서 마젠타색으로 표시된 섬유아세포를 포함하고 있습니다.그 다음 DQ collagen four가 포함된 재구성된 기저막의 두 번째 층을 추가했습니다. 다음으로 빨간색으로 표시된 종양 세포를 그 위에 2% 재구성된 기저막 배양액과 함께 파종했습니다.크림색 점으로 표시된 배지는 매 배지 교체 시마다 겹쳐서 추가되었습니다. DQ collagen one 및 four의 형광 분해 산물은 녹색으로 표시되었습니다. 이 대표적인 MCF 10 DCIS와 WS 12 TI 공배양의 23일 동안, 여기와 다음 그림들에서 빨간색으로 나타난 세포들의 증식과 여기서 및 다음 그림들에서 녹색으로 관찰된 DQ collagen four 및 one의 분해가 있었으며, 공배양의 부피 감소를 통해 콜라겐 매트릭스의 분해가 확인되었습니다.동일한 생세포 공동 배양물을 23일 동안 관찰하였으며, 공동 배양 3일, 16일, 23일째에 공초점 현미경으로 이미지를 캡처하였습니다. Mame 공동 배양물의 상호작용은 역동적이며 시간에 따라 변화할 수 있습니다. 예를 들어, 배양 3일째의 세포 mam 공동 배양 3D 모델에서 볼 수 있듯이, 이 시점에서 세포들은 매트릭스 내에서 막 증식하기 시작했으며, 녹색 형광이 나타나지 않는 것으로 보아 여전히 매우 안정적인 상태입니다.하지만 16일째가 되면, 세포가 계속 증식함에 따라 여기서 초록색으로 관찰되는 DQ collagen 1 및 4 절단 생성물과, 매트릭스와 세포가 함께 형광을 발하여 노란색으로 관찰되는 세포에 의한 매트릭스의 활발한 분해가 시작됩니다. 공배양 부피가 110,000 cubic micrometers였던 3일째와 비교했을 때, 23일째에는 급격히 증식하는 세포들에 의해 매트릭스의 거의 절반이 분해되었습니다. 16일에서 23일 사이에 부피는 이 날 기준으로 46,250 cubic micrometers까지 감소했습니다.16 공배양에서, 빨간색으로 표시된 DCIS 세포 표면의 DQ collagen four 단백질 분해와 흰색으로 표시된 섬유아세포 인근 영역의 DQ collagen one의 확산성 단백질 분해를 관찰할 수 있습니다. 이 공배양에 사용된 차별적 염색법을 통해 두 세포 유형의 발달 후 뚜렷한 이동 및 증식 패턴을 관찰할 수 있습니다. 이 기술은 유방암 분야의 연구자들이 암세포와 주변 기질 세포 간의 역동적인 상호작용에 대한 살아있는 세포 이미징을 통해 종양 거시환경이 암 진행에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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