Name: 이종 교잡 현장에서 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 배우세요 모기 조직과 배아에서 특정 전사체의 국소화 및 축적 패턴을 결정하기 위한 현장에서 하이브리드화 방법을. 이 기술은 기능적 게놈학 연구에서 유전자 발현 조절을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자들은 이후 적응과에서 하이브 리다이 제이션을 위해 여기에서 설명한 프로토콜을 개발하기 위해 수정된 아노 펠 레스 gambiae의 배아의 현장에서 하이브 리다이 제이션을위한 프로토콜의 논의 부드러운 조직 및 유리 제품 Goltsev위한 원위치 방법으로 개발 하이브 리다이 제이션의 조언 마리카 월터스 감사드립니다 Aedes과 Culex의 배아의 현장. 또한 아담 정지와 데이빗 Kosman 준 유용한 권장 사항을 인정합니다. 우리는 과학적 논의 Osvaldo Marinotti 감사 및 프로토콜 텍스트 편집.

<ol><li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit.+Vectors%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1(2011).</li>
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</ol>

저자는 전혀 공개가 없습니다.

현장과 colorimetric 염색법 프로토콜의 하이브 리다이 제이션은 전체 마운트 모기 조직 및 배아를 보시려면 여기를 제시하는 것은 특정 장기 및 세포 유형 내에서 성적의 지방화를위한 유용한 기술입니다. 이러한 절차는 우리 이전에 보고된 방법을 통해 모두 광범위한 세차 단계를 능률화 및 추가 기술적인 세부 사항 및 시약 소스를 제공하는 개선입니다. 우리의 경험에서 하이브 리다이 제이션 신호 colorimetric 감지 형광 기반의 탐지 방식에 비해 하이브리드화 신호의 감도와 선명도에서 우수합니다. 또한 colorimetric 감지 본질적 자동 형광 있습니다 배아에서 신호 차별과 관련된 문제를 circumvents. 낮은 풍부 성적이 타겟으로하는 경우 하이브리드화 신호 검출에 한계가 발생 배경 염색법은 분명하다. 65 하이브리드화 온도를 높이면 ° C는 다시 감소하는 것으로 확인되었습니다지상 하이브리드화 신호, 독특 대상 특정 RNA 프로브를 설계를위한 제안 대체할 수 없습니다. 이 프로토콜은 전체 마운트 타액 Aedes aegypti의 분비와 난소 및 아노 펠 레스 gambiae, 아노 펠 레스 stephensi, 애의 배아의 현장에서 하이브 리다이 제이션을 수행하는 데 사용되었습니다. aegypti 및 Culex quinquefasciatus. 이 방법은 또한 다른 모기 조직에 적용, 그리고 아마도 다른 곤충 분들입니다. 또한, 세 벡터 모기, 애의 배아 발달의 준비에 대해 처음으로 비교 지침에 대해 컴파일된. aegypti,. gambiae 및 CX. fatigans. 관찰은 신중하고 양육 조건이 세 종류의 특정 변종을 위해보고되었습니다. 그것은 발달 시간 코스 모기 종의 서로 다른 변종과 다른 양육 조건 하에서 다를 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 현장 보충제의 Hybridizations 아나에 노력을에 지속적모기와 다른 arthropods의 transcriptomes을 lyze, 이러한 생물의 유전자 발현의 조절의 더 나은 사진을 제공할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M 트리스-HCL </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ML의 microfuge 튜브 </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> 샘플 영상에서 에이즈, 이하 표준 튜브보다 불투명 </td></tr><tr><td> Deionized 포름 아미드 </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> 4에 보관 ° C </td></tr><tr><td> DEPC 물 </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5.25 %의 나트륨 차아 염소 산염 </td><td> 오스틴의 </td><td></td><td> A-1 브랜드 </td></tr><tr><td> T3 RNA 중합 효소 플러스 </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> T7 RNA 중합 효소의 </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 95 % 에탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand 일회용 폴리에틸렌 전송 pipettes </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37%의 포름 알데히드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC 등급의 메탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 </td><td> 피셔 과학 </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 덮개 유리 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-헵탄 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-크실렌 </td><td> 피셔 과학 </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9 잘 스팟 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (소금) </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn 레드 클리어 - 라이너 가발 테이프 </td><td> 직접 헤어 </td><td> RED-75R12 </td><td> 폴리 / X 12야드 테이프 롤의 피부 기지 재료 0.75 </td></tr><tr><td> 하나와 Sequening위한 TOPOTA 클로닝 키트 Top10 화학적-관할 E를 샷 대장균 </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 반응 40 반응 </td></tr><tr><td> Sonicated 연어 정자 DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 안티 digoxigenin-AP 팹 조각 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 1,093,274 </td><td> 4에 보관 ° C </td></tr><tr><td> 쫄지마 RNA 라벨 믹스 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 1,277,073 </td><td> -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> NBT / BCIP 재고 솔루션 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 1,681,451 </td><td> 4에 보관 ° C </td></tr><tr><td> 서양 차단 시약 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11921673001 </td><td> 4에 보관 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech 폴리에스터 메쉬 (330.130) </td><td> Saati 인쇄 </td><td> 330.34 UO PW </td><td> 330 스레드 / 인치, 34 마이크론 나사 직경, 오렌지 색상 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 시그마 </td><td> G6279-1 </td><td> PBT 70 % </td></tr><tr><td> 헤파린 나트륨 소금 </td><td> 시그마 </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37%의 포름 알데히드 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 18,508 </td><td> 호박 ampoules 10 ML aliquots </td></tr><tr><td> 16온스 뚜껑있는 솔로 종이 용기 </td><td> 제지 회사 </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 scintillat무소속의 스크루 캡과 이온 유리병 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 66022-128 </td><td> 500 20 ML 케이스 </td></tr><tr><td> 봉인된 에어 버블 랩 celluar 쿠션 재료 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 500018-081 </td><td> 10 피트 / 롤 0.188 인치 두께 </td></tr><tr><td> 닭 혈청 </td><td></td><td></td><td> 전체 혈액 중 날개 정맥이나 소년 닭의 심장 주사에 의해 수집되었다. 혈액은 coagulated 후 30 분 동안 얼음에 배치 때까지 1 H에 대해 37 ° C에서 incubated되었다. 혈청 10 분 3,000 XG에서 수집된 및 centrifuged되었다. 결과 뜨는가 (혈청을 명확히) 사용하기 전까지 수집 및 -20 ° C에 보관되었다. </td></tr></tbody></table> 표 4. 현장에서 하이브 리다이 제이션을위한 특정 시약 및 장비의 표.

이종 교잡<em&gt; 현장에서</em&gt; 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

모기 arboviruses, protozoan 기생충 및 nematodes 포함한 병원균의 다양한 집합에 대한 벡터입니다. 재생에 관련된 모기 호스트와 병원체 상호 작용, 그리고 장기에이 모기 질병일 전송을 줄이고 달걀 개발을 중단하는 전략에 대해 큰 관심되는 티슈로 표현되는 성적 증명서 및 유전자 규제 당국의 조사. 도구의 숫자는 유전자 발현의 시간적 및 조직 관련 규정을 연구하고 검증 고용되었습니다. 여기서는 특정 유전자가 표현하고 그들의 제품이 축적되는 곳이 우리의 이해를 향상시켜 공간적 정보를 얻기 위해 개발되었습니다 프로토콜을 설명합니다. 설명한 프로토콜은 다시하는 표현을 확인하고 이러한 여성 침샘뿐만 아니라 난소와 배아의 subcellular 구획 등 모기 매개로 병원체 전송에 관련된 조직에 성적 축적 패턴을 결정하는 데 사용되었습니다모기 복제 및 개발에 늦었어. 다음 절차는 대상 특정 하이브리드화 신호의 손실없이 프로토콜의 여러 단계의 효율성을 향상 최적화된 방법론을 나타냅니다. 수집, 고정, 사전 하이브리드화 및 모기 배아의 하이브 리다이 제이션을위한 구체적인 단계는 부품 B.에 상세히하는 동안 RNA 프로브 준비에 대한 지침은 부드러운 조직 및 고정과 하이브 리다이 제이션을위한 일반적인 절차의 해부는 부분에 설명되어 있습니다

시간적 및 공간적 유전자 발현 분석은 기능 유전체학에 중요한 역할을합니다. 전체 마운트 하이브리드화<em&gt; 현장에서</em&gt; 조직 및 subcellular 구획 내에서 성적의 지방화를 결정하는 데 유용합니다. 여기 하이브 리다이 제이션을 설명<em&gt; 현장에서</em모기의 특정 대상 조직에 대한 수정&gt; 프로토콜.

모기는 아르보바이러스, 원생동물 기생충 및 선충을 포함한 다양한 병원체의 매개체입니다. 전사체 및 유전자의 조사는...

다음 실험의 전반적인 목적은 모기 조직 및 배아 내에서 특정 전사체의 국소화 및 축적 패턴을 결정하기 위해 C two에서 하이브리다이제이션을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 모기 조직 또는 배아를 고정하여 조직의 미세 구조와 mRNA 표적을 보존함으로써 안티센스 RNA 프로브와 하이브리다이제이션이 가능하도록 하여 달성됩니다. 그다음, 고정된 조직 또는 배아 내의 표적 전사체에 안티센스 RNA 프로브를 하이브리다이제이션합니다.그런 다음 대상 mRNA의 국소화 및 축적 패턴을 검출하기 위해 콜레라 분석 항체 염색법을 수행합니다. C2 및 비색 검출법의 하이브리드화에 기반한 RNA 축적의 공간적 패턴을 보여주는 결과를 얻습니다. 이 방법은 유전자 산물이 모기의 어느 부위에서 언제 축적되는지와 같은 기능 유전체학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 절차를 통해 공간적 국소화 정보를 얻을 수 있으며, 이를 통해 생식 발달 및 모기-병원체 상호작용과 같은 생물학적 과정에서 유전자 발현이 어떻게 조절되는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 모기 조직에 digoxigenin 표지 RNA 프로브를 하이브리드화하기 위한 준비 단계로, 먼저 난소와 타액선을 적출합니다. 그런 다음 조직을 고정하고, 필요한 경우 proteinase K로 처리합니다.조직의 후고정이 완료되면, 1:1 비율로 혼합된 hybridization solution PBT 또는 HIB PBT 1 mL에 조직을 넣고 30분 동안 평형화한 후, 조직이 가라앉을 때까지 기다렸다가 HIB PBT를 최대한 따라냅니다. 그런 다음 각 샘플 튜브에 HIB 1 mL를 추가합니다. 샘플 튜브를 에어캡과 같이 밀봉된 공기 보호 포장재로 감싸고, 이를 하이브리다이제이션 병 안에 넣습니다.혼성화 병 캡으로 병을 밀봉하고 55 °C에서 30분 동안 회전시키며 배양합니다. 인큐베이터에서 병을 꺼내 조직이 가라앉을 때까지 기다린 후, 샘플 손실을 방지하기 위해 튜브에 50 µL의 용액을 남기고 전혼성화 버퍼를 조심스럽게 따라냅니다. 다음으로, 동일한 샘플에 미리 데운 하이 버퍼 50 µL를 첨가하고 55 °C로 설정된 히트 블록에 넣으며, 이전에 준비한 RNA 프로브를 85 °C에서 5분 동안 변성시킵니다.그런 다음 즉시 얼음에 5분 동안 둡니다. 이어서 RNA 프로브를 샘플 튜브에 피펫으로 넣습니다. RNA 프로브는 HI 용액 위 표면에 뜨게 됩니다.튜브를 가볍게 쳐서 혼합합니다. 하이브리드화 오븐 내의 고정된 마이크로 원심분리기 랙에 샘플을 넣고 55 °C에서 16~24시간 동안 부드럽게 배양합니다. 이후 서면 프로토콜에 설명된 대로 RNA 처리 및 항체 염색을 수행합니다.먼저 200 µL 피펫 팁을 사용하여 조직 샘플을 Pyrex 스팟 플레이트의 개별 라운드 바텀 웰로 옮겨 마운팅합니다. PBT를 가능한 한 많이 제거하고 샘플을 70% glycerol in water로 덮습니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 글리세롤이 샘플에 스며들도록 둡니다.현미경 슬라이드를 준비하려면, 먼저 Kim wipes로 슬라이드 표면을 깨끗이 닦으십시오. 다음으로, 세밀 붓을 사용하여 투명 테이프 두 조각을 서로 평행하게 부착하여 좁은 채널을 만듭니다. 샘플을 하나씩 집어 채널의 길이를 따라 배치하되, 각 샘플이 전방, 후방 및 배측-복측 정렬에 대해 동일한 방향을 갖도록 배치하십시오.각 샘플의 위치를 잡은 후, Kim wipe 면봉을 사용하여 조직 주변의 과잉 글리세롤 용액을 흡수합니다. 과잉 글리세롤을 제거하는 것은 커버 슬립으로 마운팅된 샘플을 슬라이드에 밀봉할 때 기포가 형성되는 것을 방지하는 데 중요합니다. 정렬된 샘플이 포함된 채널 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮습니다. 투명 매니큐어를 사용하여 커버 슬립의 모서리를 톡톡 두드려 슬라이드에 반영구적으로 고정합니다. 200 µL 피펫을 사용하여 채널의 한쪽 끝에 70% glycerol을 천천히 분주하여 채널과 커버 슬립 아래 영역을 영구적으로 채웁니다.커버슬립의 네 면을 따라 매니큐어를 발라 고정된 샘플을 밀봉합니다. 샘플을 촬영하기 전에 매니큐어가 충분히 마르도록 둡니다. 교미한 성체 암컷 모기 300마리가 들어있는 케이지에서 배아를 수집하고 원하는 단계까지 발달시킨 후, 수집 용기에서 80개의 배아가 들어가는 tylene 메쉬 장식 포획 튜브로 옮깁니다.포집 튜브를 증류수가 채워진 비커에 넣으며, 이때 포집 튜브 부피의 절반 정도까지 증류수가 차도록 합니다. 미술용 붓을 사용하여 tylene 메쉬에서 배아를 떼어내어 증류수가 채워진 포집 튜브로 옮깁니다. 배아가 잘 떨어지지 않을 경우에는 수집 용기에서 tylene 메쉬를 분리한 다음, 메쉬를 조심스럽게 접어 깔때기 모양으로 만들어 한 손으로 잡습니다.다른 쪽 손으로 깔때기 옆면을 따라 물을 뿌려 배아를 포집 튜브로 씻어 내립니다. 이 방법은 이상 배아에 적용할 수 있는데, 이는 이상 배아가 정상 배아 표면에 존재하는 접착 물질이 부족하여 알이 주변 기질에 달라붙지 않기 때문입니다. 40 milliliters의 장식 용액을 준비하여 100 millimeter 페트리 접시에 붓습니다.100 milliliter 비커에 증류수 50 milliliters를 넣고 따로 둡니다. 다음으로 배아를 탈코팅 용액(dec decoration solution)이 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 일회용 폴리에틸렌 전이 피펫을 사용하여 배아를 세척하며, 이때 포집 바이알을 회전시켜 배아가 탈코팅 용액 속에 잠겨 계속 섞이도록 합니다.탈피(Decoration)는 프로토콜에서 가장 민감한 단계 중 하나이며, 8세포기 배아의 차아염소산나트륨 처리를 과도하게 연장하면 내난막(endo corion)의 적절한 균열이 방해받을 수 있습니다. 8세포기 배아에는 최대 35초의 처리가 필요하며, 75세포기 배아에는 75초면 충분합니다. 저배율의 실체 현미경 하에서 탈피 여부를 확인하십시오. 8세포기 배아는 그물 모양의 외난막(exo corion)이 사라지며, 75세포기 배아의 경우 매끄럽고 광택이 나는 검은색 내난막 표면만 나타납니다.배아가 코팅되면 외막(exo chorion)의 부유물과 능선 구조가 사라집니다. 서면 프로토콜에 설명된 절차에 따라 내막(endo chorion)을 고정하고 파괴하십시오. 파괴된 내막을 벗겨내기 위해, 대구경 200 µL 피펫 팁을 사용하여 3 cm 페트리 접시 중앙에 양면 투피 테이프(toupee tape) 조각을 배치하십시오.배아를 메탄올에서 양면테이프로 옮깁니다. 배아가 가라앉아 테이프 표면에 부착될 때까지 1~2분간 기다린 후, 과량의 메탄올을 따라내고 표면이 약간 마르도록 1~2분간 둡니다. 그다음, 배아를 테이프에 더욱 고정시키기 위해 페트리 접시에 95% ethanol을 추가하고, 증류수 600 µL를 에탄올에 넣은 뒤 소용돌이 모양으로 저어 섞어줍니다.다음으로, 1mL 시린지 배럴에 27.5G 바늘을 장착하여 갈라진 내막(endo corion)을 벗겨냅니다. 세밀한 팁의 미술용 붓을 사용하여 검은색 내막 잔해로부터 흰색 배아를 분리한 후, 테이프에서 페트리 접시의 에탄올 저장소로 배아를 즉시 옮깁니다. 그런 다음 3mm 피펫 팁을 사용하여 500 µL의 100% Ethanol이 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 배아를 옮깁니다. 마지막으로 배아를 100% ethanol로 2~3회 세척하고, -20 °C의 에탄올에 배아를 보관합니다.그림 C의 이 이미지에서, 아밀라아제 1D7S2 및 1D7L2를 표적으로 하는 mRNA 프로브를 이용한 암컷 Aedes aegypti 전체 마운트 침샘의 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization) 결과, 각각 근위 외측엽, 원위 외측엽 및 원위 외측 내측엽에서 이러한 전사체의 축적이 나타납니다. 본 실험에서는 세 가지 모기 종의 전체 마운트 배아를 각각의 상동 Oscar 전사체를 특이적으로 표적으로 하는 mRNA 프로브와 하이브리다이제이션 시켰습니다. 여기 C2에서는 Anopheles gambiae, Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus의 전체 마운트 배아를 대상으로 각각의 모기 Oscar 상동 전사체를 표적으로 하는 안티센스 RNA 프로브를 사용하여 인시튜 하이브리다이제이션을 수행하였습니다.이 영상을 시청하고 나면, 특정 모기 조직 또는 배아 내 전사체의 국소화 및 축적을 결정하기 위한 C two hybridization 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

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