마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

본 실험 절차의 전반적인 목표는 쥐의 피질 위에 안정적이고 얇은 두개골 윈도우(skull window)를 생성하여, 두개 내 환경의 교란 없이 반복적인 이미징이 가능하도록 하는 것입니다. 이를 위해 먼저 이미징 장치 아래에서 머리를 안정적으로 고정할 수 있는 헤드 마운트를 부착합니다. 그다음, 뇌의 등쪽 표면 상부 영역의 두개골을 조심스럽게 얇게 깎아내고 고운 연마제로 표면을 연마합니다.

그 다음, 시아노아크릴레이트 접착제를 소량 바르고 커버 글라스를 덮어 윈도우를 보강합니다. 마지막 단계는 이광자 현미경으로 이미징하기 위해 동물을 준비하는 것입니다. 최종적으로 생체 내(in vivo) 이광자 현미경 촬영은 세동맥, 정맥, 모세혈관 및 신경세포 수지상돌기와 같은 미세 구조를 관찰하는 데 사용되며, 수주에 걸쳐 피질 내 최대 250 micrometers 깊이까지 이미징할 수 있습니다.

이 두개골 창(cranial window) 기법의 주요 장점은 피질 위의 두개골을 완전히 제거하지 않는다는 것입니다. 먼저, 광학적 투명도를 확보하기 위해 두개골을 얇게 만든 다음, 시아노아크릴레이트 접착제와 커버 슬립으로 두개골을 보강합니다. 이 방법은 마취 상태 또는 OIC 상태의 다양한 형광 형질전환 마우스를 연구하는 데 유용할 것입니다.

이 절차를 시작하기 위해 필요한 수술 도구를 오토클레이브로 멸균하고, 함께 제공된 원고의 방법에 따라 약 3~6주령의 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기 반응을 통해 마우스가 수술 가능 수준의 마취 상태에 있는지 확인하십시오. 그 다음, 마우스를 정위 고정 장치에 고정합니다.

마우스의 체온을 37 °C로 유지하십시오. 피드백 조절식 직장 프로브와 가열 패드를 사용합니다. 안구의 수분을 유지하기 위해 눈에 안연고를 도포하십시오.

그런 다음 소형 전기 면도기로 두피를 면도합니다. 그 후 Betadine으로 두피를 세척하고, 이어서 70% isopropyl alcohol로 닦아냅니다. 그런 다음 현미경 하에서 멸균 인공 뇌척수액의 일부를 37 °C로 가온합니다.

수술용 가위로 두개골 배측 표면 전체의 두피를 제거합니다. 피부를 두개골 양측의 측두근 가장자리와 목 근육 뒤쪽까지 외측으로 다듬어 줍니다. 다음으로, 메스 날을 사용하여 두개골 표면의 얇은 골막을 제거합니다.

그 다음 두개골을 건조시키고 세척합니다. 그 후, 두개골 표면에 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 도포합니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 기다립니다.

치과용 시멘트의 적절한 접착을 위해 이 접착제 층이 필요합니다. 이후 단계에서는 깨어 있는 상태의 이미징 준비를 위해 드릴로 구멍을 뚫고, 반대측 두개골 표면에 0 0 0 번 셀프 태핑 나사 두 개를 삽입합니다.

그 다음, 두 개의 부착 지점이 있는 맞춤 제작된 견고한 커넥터를 두개골에 부착합니다. 이렇게 하면 자유도가 크게 감소하여 종단 연구에서 동일한 영상 영역을 다시 설정하는 과정이 간소화됩니다. 또한 넓은 크로스바는 전극 배치와 진동 자극을 위한 충분한 공간을 제공합니다.

다음으로, 윈도우 위치를 제외한 두개골 표면 전체를 치과용 시멘트로 덮고, 노출된 피부의 모든 가장자리가 시멘트로 덮였는지 확인하십시오. 두개골을 얇게 만들기 전에 드릴 버(burr)가 날카로운지 확인하고 재사용을 피하십시오. 저속 치과용 드릴과 0.5 mm 버를 사용하여 체성감각 피질 위의 2 mm × 2 mm 영역을 얇게 깎아내십시오.

그 다음, 가열되는 것을 방지하기 위해 주기적으로 CSF를 공급하면서 건조된 두개골 표면을 한 번에 몇 초씩만 얇게 깎아냅니다. 이어서 뼈를 얇게 만듭니다. 그 후 드릴의 속도를 낮추어 두개골 표면을 가볍게 접촉시키며 얇게 깎아냅니다.

드릴은 수직에서 약 30도 각도로 표면에 접근해야 합니다. 혈관층을 지나 두 번째 뼈 층까지 계속해서 뼈를 얇게 깎아냅니다. 뇌 표면 위쪽까지 진행합니다.

드릴을 세밀하게 조절하며 움직이고, 오직 측면 방향으로만 힘을 가하십시오. 뼈의 두께가 약 50 microns 정도가 되면, 젖은 뼈를 통해 박리 혈관(peel vessels)이 명확하게 보일 것입니다. 이 깊이에서 뼈 내부의 작은 흰색 점들이 몇 초 동안 나타나게 됩니다.

건조된 두개골 표면을 적신 직후, 최종 뼈 두께는 약 10 to 15 microns가 되어야 합니다. 뼈가 충분히 얇아지면, 건조된 두개골 표면을 적셨을 때 뼈 내부의 작은 흰색 반점들이 더 이상 보이지 않게 됩니다. 이제 산화주석 분말로 윈도우를 연마하십시오.

윈도우 크기의 약 4분의 1 정도 되는 적은 양의 분말을 사용하여, 실리콘 휩(silicone whip)이 달린 기성 드릴 비트로 CSF와 함께 분말 슬러리를 교반합니다. 표면을 10분 동안 연마한 후, 윈도우에서 산화주석 분말을 완전히 씻어내고 뼈를 건조시킵니다. 이 과정은 박층화(thinning) 과정 중 드릴 비트로 인해 남은 거친 모서리를 줄이는 데 도움이 됩니다.

다음으로, 윈도우 크기보다 약간 작은 크기로 0번 커버글라스를 정사각형 조각으로 몇 개 자릅니다. 스크라이버를 사용하여 커버글라스에 분리된 가로 및 세로선을 부드럽게 긋습니다. 유리가 깨지지 않도록 직선 자를 이용해 미끄러지듯 자릅니다.

그런 다음 커버 슬립을 페트리 접시에 넣습니다. 접시를 테이블 가장자리에 가볍게 쳐서 유리 조각들을 분리합니다. 그 후, 부러진 면봉의 나무 끝부분을 사용하여 윈도우 위에 Sano ACRL 접착제를 소량 도포합니다.

미리 잘라둔 커버 글라스 조각을 접착제 위에 빠르게 올립니다. 접착제가 15분 이상 완전히 건조될 때까지 기다린 후, 커버 글라스 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 커버 글라스 상단 표면에 묻은 과잉 시아노아크릴레이트 접착제는 메스 날을 사용하여 제거합니다.

치과용 시멘트로 윈도우의 가장자리를 밀봉합니다. 그런 다음 마지막 단계에서 디핑 렌즈(dipping lens)용 물을 담을 수 있도록 약간 솟아오른 웰(well)을 형성합니다. 동물을 따뜻한 케이지에 넣고 마취에서 완전히 회복될 때까지 둡니다.

이 단계에서는 이미징을 위해 동물을 광학 브레드보드 위에 고정하고, 프레임을 머리 지지대로 사용합니다. 별도의 플레이트를 이용하면 동물과 조립된 모든 생리적 모니터링 장치를 하나의 단위로 하여 수술 부위와 이광자 이미징 부위 사이로 운반할 수 있습니다. 혈류 이미징을 원하는 경우, 혈청을 표지하기 위해 안와하정맥을 통해 5% 형광 덱스트란 염료 0.05 milliliters를 주입하십시오.

이 과정은 전신 마취 하에 수행되어야 하며, 염료는 보통 수 시간 동안 혈액 순환계에 남아 있습니다. 체액과 에너지 요구량을 유지하기 위해 2시간마다 g당 3 µL의 젖산 링거액을 복강 내로 주입하십시오. 이소플루란 투여를 중단하여 마우스가 깨어나게 합니다.

잠에서 깬 지 한 시간이 지나면 마우스의 이미징 준비가 완료됩니다. 빛 오염을 방지하기 위해 현미경 위로 케이지를 닫으십시오. 표시된 내용은 정맥 주사로 dextran conjugated Texas red를 표지한 YFP 마우스 허벅지의 피질 혈관 예시입니다. 경막 혈관은 종종 피질 표면 약간 위쪽의 경막에서 관찰됩니다.

큰 표층 동맥과 정맥은 피질 표면에 위치합니다. 관통 혈관은 이 표면 네트워크에서 분지하여 피질 내부로 진입하며, 그곳에서 조밀한 모세혈관망으로 분지하여 피질 조직에 영양을 공급합니다. 이 영상은 깨어 있는 생쥐의 표층 혈관 구조를 보여줍니다.

동물이 조용한 휴식 상태에 있을 때 동맥 직경의 자발적 진동이 관찰될 수 있습니다. 이 방법은 마취 상태 또는 각성 상태의 매우 다양한 형광 초음파 투과 동물을 연구하는 데 유용할 것입니다.