Name: 마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 장기 이미징을 위한 세련된 두개골 창 제작법을. 두께를 얇게 하고 강화한 창으로 250마이크로미터 깊이까지 혈관과 세포 구조를 반복 촬영할 수 있습니다.

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이 작품은 미국 심장 협회 (AYS로 포스트 박사 교제)와 국립 보건원 (MH085499, EB003832 및 OD006831 디케이까지)에 의해 지원되었다. 우리는 원고에 대한 의견에 대해 베스 프리드먼과 파블로 무계획 감사드립니다.

1. 수술 준비하기 전 <ol><li> 초음파 세척기의 Maxizyme, 외과 우유의 혼합물에 sonicating하여 수술 도구를 청소합니다. 각 실험 전에 수술 도구를 압력솥. </li><li> 필요한 모든 시약과 disposables를 사용할 수 있는지 확인합니다. 시약 및 disposables의 목록은 표 2에 제공됩니다. 가능하면 노출된 조직과 접촉 시약 및 disposables는 살균해야합니다. </li><li> 마취를 유도. 생존 연구에 적합한 일반 anesthetics는 표 1에 설명되어 있습니다. 발가락 핀치 반사의 부족으로 확인하여 마취의 수술 비행기를 확인합니다. 마우스의 최적의 나이는 생후 3-6주입니다. 어린 생쥐의 두개골은 부드럽고 얇은 더 어렵습니다. 이전 마우스는 벗겨 절차를 수행하는 동안 더 피를 봐야 두꺼운 두개골이 있습니다. </li><li> stereotaxic 프레임 1에서 동물을 고정합니다. 수술 장비의 목록은 표 2에 제공됩니다. </li><li> 몸의 온도를 유지37 진짜야 ° C에서 피드백 규제 직장 프로브 및 열 패드를 사용합니다. </li><li> 수분을 유지하기 위해 눈에 안과 연고를 바릅니다. </li><li> 작은 전기 면도기로 머리를 면도. </li><li> 70% (V / V) 이소 프로필 알콜과 함께 보라고 뒤에 Betadine로 두피를 청소합니다. </li><li> 원하는 경우 심장과 호흡 속도는 펄스 산소 농도계를 사용하여 정상 범위 내에 있는지 확인하십시오. 마우스, 숫자는 각각 약 10 센터와 2 Hz에서해야합니다. </li><li> 37 ° C (125 MM NaCl, 10 MM 포도당, 10 밀리미터 HEPES, 3.1 MM CaCl 2, 1.3 밀리미터 MgCl 2, 산도 7.4) (시그마에서 모든 화학 물질)로 멸균-필터링된 인공 대뇌 척수 (ACSF)의 나누어지는을 따뜻하게 2. </li></ol> 2. 헤드 프레임 마운트 <ol><li> 포셉, 외과 가위로 전체 지느러미 두개골 표면을 통해 두피를 제거합니다. 두개골 및 게시물의 양쪽에 laterally 측두엽 근육의 가장자리에 피부 손질목 (그림 1A)의 근육에 erior. </li><li> 두개골의 표면에서 얇은 골막을 제거 메스 블레이드를 사용하십시오. </li><li> 젖은 솜으로 두개골을 청소 작은 주걱을 끌어내려하고 먼지 수에서 공기의 흐름으로 두개골 표면을 건조. 그런 다음 전체 두개골 표면 cyanoacrylate 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다. 접착제가 완전히 건조하도록 허용합니다. 접착제의이 계층은 후속 단계에서 치과 시멘트의 적절한 준수가 필요합니다. cyanoacrylate 접착제는 소독을 할 필요가 없습니다. </li><li> 멀리 원하는 창의 영역에서 두개골 표면에 금속 커넥터를 연결합니다. anesthetized 준비 들면, 작은 너트는 나중에 볼트를 사용하여 이미지 설정 (그림의 1B, 1L와 1N)으로 망하는 수 cyanoacrylate 접착제의 명인과 두개골을 확보할 수 있습니다. 접착제가 두개골에 첨부하는 동안 스레드를 입력하지 않도록 테이프로 너트의 뒷부분을 밀봉합니다. 너트와 테이프은 멸균 처리 해야해<html> 이전 수술에 의한 autoclaving. </li><li> 깨어 이미징 준비를 위해 두 개의 첨부 지점 (그림 1M와 1N)으로보다 엄격한 정의 커넥터를 연결합니다. ½ mm 드릴 버와 contralateral 피질 반구 위에 두개골에 구멍을 뚫을 및 후 두 # 000 셀프 태핑 나사를 소개합니다. 이러한 나사는 머리 두개골에 마운트 정박하는 데 도움이됩니다. 기본 피질에 압력을 적용하지 않도록하기 위해, 나사의 한 차례를 적용합니다. 그런 다음, 소뇌 이상 cyanoacrylate 접착제의 작은 소량으로 정의 금속 크로스 모음을 첨부합니다. cyanoacrylate 접착제가 완전히 건조하도록 허용합니다. 이 금속 커넥터는 크게 자유의 학위를 감소시키고 길이 방향의 연구에 동일한 이미징 분야의 재배치를 단순화합니다. 넓은 크로스 바는 vibrissae의 전극 배치 및 자극을위한 충분한 공간을 제공합니다. 사용자 정의 헤드 마운트 및 첨부 장치를 생성하는 상세한 계획은 온라인에서 구할 수 있습니다 (그를 이길 / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). 나사와 크로스 바 전에 수술에 autoclaving 소독을해야합니다. </li><li> 치과 시멘트의 계층과 윈도우의 위치 (그림 1C 및 1D) 제외, 전체 두개골 표면을 커버. 피부의 모든 노출된 가장자리는 시멘트로 덮여 있는지 확인하십시오. 치과 시멘트의 구성 요소는 멸균 처리하지 않아도됩니다. </li></ol> 3. 번쩍의 생성 및 Thinned-해골 (포트) 창 강화 <ol><li> 드릴 털은 날카로운 것을 확인하고이를 재사용하지 마십시오. ½ mm 버와 somatosensory 피질 이상 2mm 지역으로 2mm 얇은 치과 훈련에 낮은 속도를 사용합니다. 냉각을위한 땀 및 썼음을위한 건조, ACSF으로 두개골을 wetting 후 가스 살포기에서 공기의 부드러운 흐름으로 두개골 표면을 건조 사이의 대체. 이것은 과다 출혈 있습니다 두개골의 해면 모양의 계층을 통해 썼음 필요하지만 controll 수ACSF (그림 1E)으로 세정하여 에드. 두개골은 ~ 50 μm의이며, pial 혈관이 젖었 뼈 (그림 1 층)를 통해 볼 수있을 때 훈련의 약간의 압력을 받고 굽히는 시작한다. 이 두께에서는 뼈 사이 작은 흰 반점이 건조 두개골 표면이 moistened되는 직후 몇 초간 표시가됩니다. </li><li> 이 시점에서, 뼈를 얇은 더욱. 단지 약간의 터치와 함께 두개골 표면을 미는 느린 훈련 속도, 즉, 1000 RPM을 사용하십시오. 펜처럼 훈련을 누른 상태에서 작은 움직임 제어를 사용하고 오직 측면 방향으로 힘을 적용됩니다. 뼈가 최종 두께 (그림 1G)에서 10-15 μm의를 낙제야해야합니다. 건조 두개골 표면이 moistened 때 뼈를 충분히 얇은되면 뼈에 작은 흰 반점은 더 이상 볼 수 없습니다. </li><li> 주석 산화물 분말과 윈도우 영역을 갈고 닦아서. 실리콘 수족관 밀봉 재와 함께 담근되어 미리 만든 드릴 비트를 첨부테이퍼 채찍을 (삽입된 페이지, 그림. 1H) 떠나, 그린. 실리콘 채찍은 수술 전에 최소한 하나의 하루를 준비하고 사용하기 전에 이소프로판올 70%로 소독해야한다. ACSF (그림 1H)의 방울과 함께 창을 분말의 작은 핀치를 놓습니다. 부드럽게 두개골 표면으로 이동 채찍의 끝을 만져 의해 10 분 동안 창문을 통해 슬러리를 선동. ACSF를 사용하여 창문에서 철저하게 주석 산화물 분말을 멀리 플러시와 공기의 부드러운 흐름과 함께 철저하게 뼈를 건조. 이전 단계에서 드릴링으로 남아 표면 불규칙과 자기편 골 칩은 연마 (그림 1H와 1I) 이후에 제거하여야한다. 주석 산화물 분말은 멸균 처리하지 않아도됩니다. </li><li> 노 평방 조각을 잘라. 윈도우의 크기보다 약간 작은 공 덮개 유리. 부드럽게 스트레이트 에지를 사용하여 커버 슬립으로 구분하여 수평 및 수직 라인을 득점하는 학자를 사용합니다. 그렇다면 배양 접시와 KN에서 커버 슬립을 배치유리 조각을 분리하기 위해 테이블​​ 가장자리로부터 요리를 ock. 전체 배양 접시 그런 다음 불임을 보장하기 위해 autoclaved 수 있습니다. </li><li> 적절한 규모의 커버 유리 근처 말린 창을 놓습니다. 부러진 나무 목화 팁 작은 주걱의 끝부분을 사용하여 창을 통해 cyanoacrylate 접착제의 작은 소량을 적용하고, 신속하게 접착제 꼭대기 커버 유리 precut 조각을 밀어. 커버 유리 밑에 거품을 생성하지 마십시오. 부드럽게 두개골 표면에 대한 커버 유리를 밀고하고, 몇 초 (그림 1J 및 1O)을 누르고 있습니다. 접착제 15 분 이상 완전히 건조하도록 허용합니다. 그것이 건조 후 초과 cyanoacrylate 접착제는 메스 블레이드로 커버 유리의 위쪽 표면에서 제거할 수 있습니다. 치과용 시멘트와 커버 유리의 가장자리를 밀봉하고 형성 약간 마른 렌즈 (그림의 1K 및 1O)에 물을 잡고 잘 키웠습니다. </li></ol> 4. 회복 <ol><li> 따뜻한 케이지 다음과 같은 수술에 동물을 배치합니다. 을 모니터링동물은 정기적으로 그것은 완전히 마취에서 회복까지. </li><li> 준비가 하루 이상 생존하기위한 경우 진통제에 대한 buprenorphine을 (G의 설치류 당 0.03 μg)을 제공합니다. 초기 주입 후 우리는 일반적으로 이미지 동물 적어도 하나의 하루. </li></ol> 5. 이미징 준비 <ol><li> 머리 지원 (그림 1L와 1M)와 같은 프레임을 사용하여 이미징을위한 광학 브레드 보드에 동물을 안정화. 구속 장치는 Qioptiq 또는 ThorLabs에서 상용 optomechanical 구성 요소로 만들 수 있습니다. 각자의 접시는 동물과 하나의 단위 3로 조립된 모든 생리적 모니터링 장치와 외과와 두 광자 이미징 스위트 사이에 옮겨질 수 있습니다. </li><li> 혈액 흐름 이미징이 원하는 경우 5 % 0.05 ML (W / V) 형광등-dextran 염료는 혈액 혈청 (그림 2A와 2C 2 시간에 레이블을 지정하는 두 꼬리 정맥 또는 infraorbital 정맥을 통해 무균 식염수에 용해 투입 </strong&gt;) 4-7. 이것은 전신 마취하에 수행되어야합니다. dextran 솔루션보다 점성만큼 Infraorbital 정맥 관리는 초보자를 위해 쉽게있을 수 있습니다. 꼬리 정맥은 어두운 색의 생쥐에서 찾을 어려울 수 있으며, 정맥은 실패 주사 후 축소하는 경향이있다. 녹색 발광과 이미징 vasculature 들어, 플루오레신 isothiocyanate dextran을 사용합니다. 붉은 방출 들면, 텍사스 레드 dextran을 사용합니다. 높은 분자량의 dextrans으로 염료는 여러 시간 동안 순환에 남아 있습니다. 또는 내생 형광 레이블과 동물은 적절한 두 광자 여기 파장에 직접 몇 군데하실 수 있습니다. dextran 솔루션은 나중에 사용할 수 aliquots 동안 얼어있을 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 젖은 솜으로 윈도우 표면을 청소하는 것은 작은 주걱 줬지. </li><li> anesthetized 준비 장시간 이미징 들어, 체액 및 에너지 요구 사항을 유지하기 위해 g 2 시간마다 당 3 μL의 볼륨에서 멸균 lactated 울리는의 솔루션 intraperitoneally을 주입. &lt;/ 리&gt; <li> 언제 깨어있는 상태에서 이미징 동물, 스트레스 수준을 줄이기 위해 한 번에 몇 시간에 머리 구속을 제한하고 있습니다. 음식과 물을위한 이미징 세션 사이의 홈 새장에 동물을 반환합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 성공 창이 몇 달 동안 pial 표면 아래 250 μm의로 이미징 깊이를 최대 수 있습니다. 이 방법은 대뇌 피질의 실질 팔 안에 생체내 모세관 혈액의 흐름 4, 8, microglial 활성화 8, 9, 돌기 구조를 공부하는 데 사용되었습니다. 한 예로, 우리는 혈액 혈청은 텍사스 레드 dextran (그림 2A)의 정맥 주사에 의해 표시된 후, anesthetized Thy1 - 노란색 형광 단백질 (YFP) 마우스의 대뇌 피질 vasculature을 보여 두 광자 이미징을 사용합니다. Dural 혈관은 종종 약간 경질의 mater에서 대뇌 피질의 표면 (그림 2C, 화살표) 위에서 볼 수 있습니다. 대형 pial arterioles 및 venules 리대뇌 피질의 표면에 전자 (그림 2D). 그들은 대뇌 피질의 조직에 영양을줍니다 고밀도 모세관 침대 (그림의 2E까지 2 시간)으로 가지를 내다 피질로이 표면 네트워크 및 다이빙에서 관통 혈관 지점. 대뇌 피질의 뉴런을 표현 깊은 YFP이 마우스 라인에 신호 내생의 돌기 arbors는 두 번째 채널 10 (그림 2B 2 시간까지)에 동시에 몇 군데하실 수 있습니다. 뼈의 두 번째 고조파 신호 3이 채널에 수집되고, 이미지 스택의 수집 후 thinned 두개골 (2C에 그림의 2A)의 두께를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 두피 혈관 역학은 심히 anesthetics 11 시까지 영향을받습니다. 두 번째 예제에서, 우리는 길들여지지 깨어 마우스에서 두 개의 광자 현미경에 의해 수집된 자발 vasoactivity의 동영상을 보여줍니다. 루멘 직경 유명 vasomotor의 oscillations는 pial arteriole로 보지 아니지만 이웃 venule으로하고 있습니다. 이vasoactivity의 기초 범위는 우레탄 마취의 4 줄어들 수 있습니다. 혈액 흐름의 자연과 evoked 변화를 계량하기 위해 우리는 각 혈관의 혈관 직경과 적혈구 속도를 모두 캡처하는 적응 라인 스캔 기법을 사용합니다. 두 광자 현미경을 사용하여 정량 혈액 흐름 이미징에 대한 자세한 자료는, 12 3 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> 1 그림. 포트 윈도우를위한 절차. 포트 윈도우를 생성하기위한 절차의 순차적 단계 (에 K) 이미지. 자세한 지침은 텍스트를 참조하십시오. β = bregma와 λ = 람다. anesthetized 준비 이미징 동안 머리 보안을위한 (L) 볼트 및 너트 시스템. (M) 정의 깨어 준비를위한 크로스 바 헤드 마운트를 가공. 이 예제에서는 커넥터도 반복 electrocorticogram 녹음을 위해 이식되었다. (N)도식 다이어그램은 헤드 마운트 및 다양한 구성 요소의 위치 지느러미 전망을 보여주고 있습니다. 패널 L에 사용되는 너트는 패널 M. 두에서 사용하는 크로스 바에 대한 대안으로 의미 # 000 셀프 태핑 나사 것은 깨어 이미징 준비와 추가된 안정성을위한 크로스 바 장착으로 추가됩니다. 포트 윈도우의 단면을 보여주는 (O) 도식 다이어그램. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 피질의 vasculature과의 연결 구조의 2 광자 영상. 모든 이미지는 윈도우 주입 10시 이일에 Thy1-YFP 마우스에서 포트 창문을 통해 수집되었다. vasculature ()과 dendrites (B)와 관련 thinned 두개골을 보여주는 코로나 방향으로 조직을 150 μm의 이상 최대한의 투영. 뼈 (파란색)가 900 나노미터 여기에 450 nm의 방출에서 두 번째 고조파 형광을 수집하여 감지되었습니다 <sup&gt; 8. vasculature (적색)을 정맥 주사 70 kDa 텍사스 레드 dextran 6 시까지로 분류되었다. 뉴런의 돌기 분야 (녹색) Thy1-YFP 유전자 변형 마우스 라인 내생 있습니다. PIA 아래 서로 다른 깊이에서 수평 방향으로 조직의 50 μm의 이상 (CH) 최대한의 전망. 데이터 패널에 표시된 동일한 이미지 스택 출신 A와 B Dural 혈관 막 대뇌 피질의 표면 (C에서 화살표) 위에서 볼 수 있습니다. 약어 ACSF은 = 인공 대뇌 척수 포트 = 광택 및 철근 thinned 두개골 창 YFP은 = 노란색 형광 단백질 제가 설명한 절차가 현지 기관 동물 케어에 의해 승인되었다는 확인하고위원회를 사용하십시오.

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공개하는 아무것도.

두 광자 포트 창을 통해 영상은 레이저 빛을 attenuates하고 더 깊이 8 시에 광학 aberrations을 추가 thinned 뼈 및 경질 통해 전송을 필요로합니다. 그러나이 단점에도 불구하고 최대 pial 표면 아래 250 μm의에 이미징 깊이는 900 nm의 여기를 구현할 수 있습니다. 그레이터 이미징 깊이는 원칙적으로 13 이상 여기 파장과 수도 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 완전한 craniotomy 14, 15과 관련된 방법에 transiently 존재할 수 대뇌 피질의 염증이없는 상태입니다. 잘 준비된 포트 창이 주입 8 다음 angiogenesis이나 염증에 대한 명백한 징후를 보여주지해야합니다. 이것은 이미징 vasculature 구조에 의한 실험의 과정 동안 생체내에 부과되거나 CX (3) CR1-GFP 마우스 라인 8, 16, 17에서 microglia의 형태학의 변화를 감지하여. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 대리인 </td><td> 인도의 루트 </td><td> 마우스에 대한 선량 </td><td> 존속 기간 </td><td> 노트 </td><td> 출처 </td><td> 심판 심판 </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 μg / g </td><td> 15-60 분 </td><td> 좁은 여유가 없다. 천천히 마취의 적절한 복용량까지 작동합니다. 필요에 따라 유도 선량의 10 %를 보완. </td><td> 036093; 버틀러 Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 케타민을 (Ketaset)는 Xylazine (Anased) 섞인 </td><td> IP </td><td> 60 μg / G (K) 10 μg / g (X) (동일 주사기에 혼합) </td><td> 20-30 분 </td><td> Xylazine는 근육 이완 및 진통제로 공동 주입된다. 필요에 따라 유도 선량의 50 %에서만 케타민을 보완. </td><td> (K) 010177, (X) 033,198; 버틀러 Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Isoflurane (Isothesia) </td><td> 흡입 </td><td> 4 % 유도를위한 폐포 농도 (MAC)을 의미, 유지 보수 1-2% MAC </td><td> 4-6 H. </td><td> 70 % 산소 30 % 질소 산화물의 혼합물로 제공. 장시간 마취 회복을 늦추기 위해 이끌고 있습니다. </td><td> 029403; 버틀러 Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> 표 1. 생존 공부를 마취 요원을 제안했습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> ITEM </td><td> 회사 </td><td><stroNG&gt; 카탈로그 # / 모델 </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 6,906,950 </td></tr><tr><td> Buprenorphine (Buprenex) </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 031,919 </td></tr><tr><td> 플루오레신 isothiocyanate dextran, 2 MDA 분자량 </td><td> 시그마 </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> 이소 프로필 알코올 </td><td> 어부 </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Lactated 울리는의 솔루션 </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> Lidocaine 용액, 2 % (V / V) </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 002,468 </td></tr><tr><td> 식염 </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 009,861 </td></tr><tr><td> 외과 우유 </td><td> 버틀러 Schein </td><td&gt; 014,325 </td></tr><tr><td> 텍사스 레드 dextran, 70 kDa 분자량 </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 035,646 </td></tr><tr><td> DISPOSABLES </td></tr><tr><td> 초경 털은, 1 / 2mm 팁 크기 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Cottoned 팁 applicators </td><td> 피셔 과학 </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> 유리, 아니 보호해. 0 두께 </td><td> 토마스 과학 </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylate 접착제 </td><td> ND 산업 </td><td> 31,428 H04308 </td></tr><tr><td> 가스 살포기 </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> 그립 시멘트 분말 </td><td> Dentsply </td><td> 675,571 </td></tr><tr><td> 그립 시멘트 용매 </td><td> Dentsply </td><td> 675,572 </td></tr><tr><td> 인슐린 주사기, 29.5 게이지 바늘로 0.3 ML 볼륨 </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 018,384 </td></tr><tr><td> 너트와 머리를 고정 볼트 </td><td> Digikey </td><td> 너트, H723-ND, 볼트, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Opthalmic 연고 </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 039,886 </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> 나사, 셀프 태핑 # 000 </td><td> JI 모리스 회사 </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> 실리콘 수족관 밀봉 재 </td><td> 완벽 제조 </td><td> 31,001 </td></tr><tr><td> 주석 산화물 분말 </td><td> 엄마의 광물 </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> 장비 </td></tr><tr><td> 유리 학자 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> 현미경 해부 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td> 전기 파워 드릴 </td><td> Foredom 또는 Osada </td><td> K.1020 (Foredom) 또는 EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> 전기 면도기 </td><td> Wahl </td><td> 시리즈 8900 </td></tr><tr><td> 집게, 뒤몽 안돼. 55 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> 피드백 조절 열 패드 </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (직장 써미스터, 40 - 90 5D-02, H) 패드, 40-90-2-07 먹어 </td></tr><tr><td> Isoflurane 기화기 </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> 펄스 산소 농도계 </td><td> 스타 생명 과학 </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> 미니어처, 드라이버 </td><td> 가렛 웨이드 </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Stereotaxic 프레임 </td><td> Kopf 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 900 (마우스 마취 마스크와 비 파열 귀에 바 있음) </td></tr><tr><td> 외과 가위, 무딘 끝 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> 초음파 세척기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약, disposables 및 장비 목록.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 thinned-해골 창

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

생체내에서는 대뇌 피질 기능의 영상은 intracranial 환경의 방해없이 뇌로 광 액세스가 필요합니다. 우리는 직경 몇 mm에 걸쳐 그리고 수 개월 동안 안정 마우스 두개골에 광택과 철근 thinned 두개골 (포트) 윈도우를 구성하는 방법을 제시한다. 두개골이 광학 선명도를 달성하는 훈련을 실​​시 손으로 두께 10-15 μm의에 thinned하고 있으며, 다음으로 cyanoacrylate 접착제와 덮개 유리로 중첩됩니다 : 1) 강성, 2를 제공하는 것은) 뼈 regrowth을 억제하고 3) 빛의 산란을 감소 뼈 표면에 부정에서. 두개골이 터진 않았으므로, 공부중인 프로세스에 영향을 미칠 수있는 염증이 크게 줄어 듭니다. 최대 대뇌 피질의 표면 아래 250 μm의로의 이미징 깊이는 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 창문은 잘 anesthetized 정신 모두 준비에서 대뇌 혈류와 세포 기능을 공부하기 적합합니다. 그것은 더 이상 작전을 제공합니다portunity는 optogenetics를 사용하여 세포의 활동을 조작하거나 photosensitizers 순환의 조사의 대상이 혈관의 혈액 흐름을 방해한다.

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

피질 기능의 생체 내(in vivo) 이미징을 위해서는 두개강 내 환경을 파괴하지 않으면서 뇌로의 광학적 접근이 필요합니다. 본 연구에서는 ...를 형성하는 방법을 제시합니다.

본 실험 절차의 전반적인 목표는 쥐의 피질 위에 안정적이고 얇은 두개골 윈도우(skull window)를 생성하여, 두개 내 환경의 교란 없이 반복적인 이미징이 가능하도록 하는 것입니다. 이를 위해 먼저 이미징 장치 아래에서 머리를 안정적으로 고정할 수 있는 헤드 마운트를 부착합니다. 그다음, 뇌의 등쪽 표면 상부 영역의 두개골을 조심스럽게 얇게 깎아내고 고운 연마제로 표면을 연마합니다.그 다음, 시아노아크릴레이트 접착제를 소량 바르고 커버 글라스를 덮어 윈도우를 보강합니다. 마지막 단계는 이광자 현미경으로 이미징하기 위해 동물을 준비하는 것입니다. 최종적으로 생체 내(in vivo) 이광자 현미경 촬영은 세동맥, 정맥, 모세혈관 및 신경세포 수지상돌기와 같은 미세 구조를 관찰하는 데 사용되며, 수주에 걸쳐 피질 내 최대 250 micrometers 깊이까지 이미징할 수 있습니다.이 두개골 창(cranial window) 기법의 주요 장점은 피질 위의 두개골을 완전히 제거하지 않는다는 것입니다. 먼저, 광학적 투명도를 확보하기 위해 두개골을 얇게 만든 다음, 시아노아크릴레이트 접착제와 커버 슬립으로 두개골을 보강합니다. 이 방법은 마취 상태 또는 OIC 상태의 다양한 형광 형질전환 마우스를 연구하는 데 유용할 것입니다.이 절차를 시작하기 위해 필요한 수술 도구를 오토클레이브로 멸균하고, 함께 제공된 원고의 방법에 따라 약 3~6주령의 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기 반응을 통해 마우스가 수술 가능 수준의 마취 상태에 있는지 확인하십시오. 그 다음, 마우스를 정위 고정 장치에 고정합니다.마우스의 체온을 37 °C로 유지하십시오. 피드백 조절식 직장 프로브와 가열 패드를 사용합니다. 안구의 수분을 유지하기 위해 눈에 안연고를 도포하십시오.그런 다음 소형 전기 면도기로 두피를 면도합니다. 그 후 Betadine으로 두피를 세척하고, 이어서 70% isopropyl alcohol로 닦아냅니다. 그런 다음 현미경 하에서 멸균 인공 뇌척수액의 일부를 37 °C로 가온합니다.수술용 가위로 두개골 배측 표면 전체의 두피를 제거합니다. 피부를 두개골 양측의 측두근 가장자리와 목 근육 뒤쪽까지 외측으로 다듬어 줍니다. 다음으로, 메스 날을 사용하여 두개골 표면의 얇은 골막을 제거합니다.그 다음 두개골을 건조시키고 세척합니다. 그 후, 두개골 표면에 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 도포합니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 기다립니다.치과용 시멘트의 적절한 접착을 위해 이 접착제 층이 필요합니다. 이후 단계에서는 깨어 있는 상태의 이미징 준비를 위해 드릴로 구멍을 뚫고, 반대측 두개골 표면에 0 0 0 번 셀프 태핑 나사 두 개를 삽입합니다.그 다음, 두 개의 부착 지점이 있는 맞춤 제작된 견고한 커넥터를 두개골에 부착합니다. 이렇게 하면 자유도가 크게 감소하여 종단 연구에서 동일한 영상 영역을 다시 설정하는 과정이 간소화됩니다. 또한 넓은 크로스바는 전극 배치와 진동 자극을 위한 충분한 공간을 제공합니다.다음으로, 윈도우 위치를 제외한 두개골 표면 전체를 치과용 시멘트로 덮고, 노출된 피부의 모든 가장자리가 시멘트로 덮였는지 확인하십시오. 두개골을 얇게 만들기 전에 드릴 버(burr)가 날카로운지 확인하고 재사용을 피하십시오. 저속 치과용 드릴과 0.5 mm 버를 사용하여 체성감각 피질 위의 2 mm × 2 mm 영역을 얇게 깎아내십시오.그 다음, 가열되는 것을 방지하기 위해 주기적으로 CSF를 공급하면서 건조된 두개골 표면을 한 번에 몇 초씩만 얇게 깎아냅니다. 이어서 뼈를 얇게 만듭니다. 그 후 드릴의 속도를 낮추어 두개골 표면을 가볍게 접촉시키며 얇게 깎아냅니다.드릴은 수직에서 약 30도 각도로 표면에 접근해야 합니다. 혈관층을 지나 두 번째 뼈 층까지 계속해서 뼈를 얇게 깎아냅니다. 뇌 표면 위쪽까지 진행합니다.드릴을 세밀하게 조절하며 움직이고, 오직 측면 방향으로만 힘을 가하십시오. 뼈의 두께가 약 50 microns 정도가 되면, 젖은 뼈를 통해 박리 혈관(peel vessels)이 명확하게 보일 것입니다. 이 깊이에서 뼈 내부의 작은 흰색 점들이 몇 초 동안 나타나게 됩니다.건조된 두개골 표면을 적신 직후, 최종 뼈 두께는 약 10 to 15 microns가 되어야 합니다. 뼈가 충분히 얇아지면, 건조된 두개골 표면을 적셨을 때 뼈 내부의 작은 흰색 반점들이 더 이상 보이지 않게 됩니다. 이제 산화주석 분말로 윈도우를 연마하십시오.윈도우 크기의 약 4분의 1 정도 되는 적은 양의 분말을 사용하여, 실리콘 휩(silicone whip)이 달린 기성 드릴 비트로 CSF와 함께 분말 슬러리를 교반합니다. 표면을 10분 동안 연마한 후, 윈도우에서 산화주석 분말을 완전히 씻어내고 뼈를 건조시킵니다. 이 과정은 박층화(thinning) 과정 중 드릴 비트로 인해 남은 거친 모서리를 줄이는 데 도움이 됩니다.다음으로, 윈도우 크기보다 약간 작은 크기로 0번 커버글라스를 정사각형 조각으로 몇 개 자릅니다. 스크라이버를 사용하여 커버글라스에 분리된 가로 및 세로선을 부드럽게 긋습니다. 유리가 깨지지 않도록 직선 자를 이용해 미끄러지듯 자릅니다.그런 다음 커버 슬립을 페트리 접시에 넣습니다. 접시를 테이블 가장자리에 가볍게 쳐서 유리 조각들을 분리합니다. 그 후, 부러진 면봉의 나무 끝부분을 사용하여 윈도우 위에 Sano ACRL 접착제를 소량 도포합니다.미리 잘라둔 커버 글라스 조각을 접착제 위에 빠르게 올립니다. 접착제가 15분 이상 완전히 건조될 때까지 기다린 후, 커버 글라스 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 커버 글라스 상단 표면에 묻은 과잉 시아노아크릴레이트 접착제는 메스 날을 사용하여 제거합니다.치과용 시멘트로 윈도우의 가장자리를 밀봉합니다. 그런 다음 마지막 단계에서 디핑 렌즈(dipping lens)용 물을 담을 수 있도록 약간 솟아오른 웰(well)을 형성합니다. 동물을 따뜻한 케이지에 넣고 마취에서 완전히 회복될 때까지 둡니다.이 단계에서는 이미징을 위해 동물을 광학 브레드보드 위에 고정하고, 프레임을 머리 지지대로 사용합니다. 별도의 플레이트를 이용하면 동물과 조립된 모든 생리적 모니터링 장치를 하나의 단위로 하여 수술 부위와 이광자 이미징 부위 사이로 운반할 수 있습니다. 혈류 이미징을 원하는 경우, 혈청을 표지하기 위해 안와하정맥을 통해 5% 형광 덱스트란 염료 0.05 milliliters를 주입하십시오.이 과정은 전신 마취 하에 수행되어야 하며, 염료는 보통 수 시간 동안 혈액 순환계에 남아 있습니다. 체액과 에너지 요구량을 유지하기 위해 2시간마다 g당 3 µL의 젖산 링거액을 복강 내로 주입하십시오. 이소플루란 투여를 중단하여 마우스가 깨어나게 합니다.잠에서 깬 지 한 시간이 지나면 마우스의 이미징 준비가 완료됩니다. 빛 오염을 방지하기 위해 현미경 위로 케이지를 닫으십시오. 표시된 내용은 정맥 주사로 dextran conjugated Texas red를 표지한 YFP 마우스 허벅지의 피질 혈관 예시입니다. 경막 혈관은 종종 피질 표면 약간 위쪽의 경막에서 관찰됩니다.큰 표층 동맥과 정맥은 피질 표면에 위치합니다. 관통 혈관은 이 표면 네트워크에서 분지하여 피질 내부로 진입하며, 그곳에서 조밀한 모세혈관망으로 분지하여 피질 조직에 영양을 공급합니다. 이 영상은 깨어 있는 생쥐의 표층 혈관 구조를 보여줍니다.동물이 조용한 휴식 상태에 있을 때 동맥 직경의 자발적 진동이 관찰될 수 있습니다. 이 방법은 마취 상태 또는 각성 상태의 매우 다양한 형광 초음파 투과 동물을 연구하는 데 유용할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을...

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

광택 및 강화 된 얇은 두개골 (포트) 두개골 창 glioblastoma (GBM) 세포 주입을 결합함으로써, 우리는 glioma의 개시와 길이 방향 라이브 마우스의 뇌에 주입 GBM 세포의 성장을 관찰 할 수 있습니다.

이미징 Glioma 개시<em&gt; 생체 내</em&gt; 연마하고 강화 얇은 두개골 두개골 창을 통해

이 비디오는 뇌의 다른 영역에 대한 안정적인 광학 접근을 위해 마우스 모델에 두개골 창을 이식하는 수술 절차를 보여줍니다.

마우스 모델에 두개골 이미징 창 이식: 쥐 뇌 영역에 대한 안정적인 광학적 접근을 위해 유리 기반 커버슬립을 이식하는 수술 절차

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

이 원고는 세로 두 광자 현미경을 사용하여 생체 내에서 아밀로이드 플라크 축적 동안 cerebrovasculature의 리모델링을 추적하는 절차를 설명합니다. 얇아진 두개골 제제는 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 손상의 진행을 평가하기 위해, 형광 염료의 시각화를 가능하게한다.

종<em&gt; 생체</em&gt;은 Cerebrovasculature의 이미징 : CNS 질환에 관련성

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

배우세요 마우스 뇌 장기 이미징을 위한 세련된 두개골 창 제작법을. 두께를 얇게 하고 강화한 창으로 250마이크로미터 깊이까지 혈관과 세포 구조를 반복 촬영할 수 있습니다.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

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