Name: 사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 배우세요 Drosophila 조직에서 크로마틴 면역침전(ChIP)을 수행하는 방법을. 이 기술은 생리적 조건에서 염색질 상태를 정확히 분석하여 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자 시퀀스 결과를 제공하는 그들의 도움 박사 Keji 조의 연구소 (NIH / NHLBI)에 감사드립니다. 우리는 또한 매핑 시퀀싱 읽은을 시각화하기위한 게놈 브라우저의 사용을 위해 UCSC 게놈 프로젝트를 감사드립니다. 이 작품은 신생 XC로 자금 NICHD, Lucile Parkard 재단, 그리고 존스 홉킨스 대학에서 독립 수상 및 R01HD065816에 R00HD055052 NIH 경로에 의해 지원되었습니다

(전체 칩 절차는 오버 일 정도 소요됩니다. 높은 처리량 시퀀싱을위한 칩 라이브러리의 작성은 다른 2~3일 소요됩니다.) 1. 해부 및 칩 실험 (~ 1,000,000 세포)에 대한 조직의 준비 <ol><li> 차가운 PBS + 1X 프로 테아제 억제제 (7x 주식 솔루션을 얻기 위해 1.5 ML 1X PBS에서 테아제 억제제 칵테일 중 1 개의 펠릿를 해산)에서 (Drosophila testes의 예 2백쌍)에 관심있는 조직을 해부 + PMSF (최종 농도 100 μg / ml) 쇼핑. 두 조직을 씻어하고 억제제와 같은 PBS 용액 200 μL에 조직을 resuspend. </li><li> 예제를 해결하려면, 5.5 μL 37%의 포름 알데히드를 (37 사용하기 전에 1 분 용 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 포름 알데히드) 추가합니다. 15 분 와동 사이에 매 5 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 2 분 동안 진정시킬 수 있도록 조직을 위해 얼음에 샘플을 놓습니다. 450 μL PBS (프로 테아제 억제제와 PMSF와)과 2X 린스. 샘플은 이제 매장이 될 수-20 ° C.에서 D 감자칩 충분한 자료를 얻기 위해 절개를 여러 번 반복합니다. </li></ol> 2. 칩 분석을위한 단백질의 DNA 결합으로 뜨는 준비 <ol><li> 1.75 ML eppendorf 튜브의 단계 1.3에서 충분한 샘플을 결합. </li><li> 조직 샘플에서 PBS를 제거합니다. 200 용해 버퍼의 μL (50 MM 트리스-HCL, pH를 7.6, 1 ㎜ CaCl2, 0.2 % 트리톤 X-100이나 NP-40, 5 밀리미터 butyrate 및 1X proteinase 억제제 칵테일). 추가 용해 완충액 (0.5 mm의 PMSF 최종 농도)로 신선한 PMSF 주식 솔루션을 추가합니다. 조직은 10 분 RT (실내 온도)에서 품어 모든 집계하지 않고 완전히 해리까지 파란 균 질기 (피셔 고양이 # 749521-1590)로 Homogenize. </li><li> Sonication : 파워 20을 사용 microtip의 sonicator (Misonix HS-XL200). 50 초 동안 얼음에서 10 초 그리고 나머지 Sonicate. (이상 sonication 작은 조각을 얻을하므로 최적의 sonication 시간이, 경험적으로 결정되어야한다. histon 대한 항체를 사용하여 칩 4-5 회 반복전자 개조, 우리가 일반적으로 약 200-300 BP에 염색질 sonicate, 전사 인자 혹은 염색질 레귤레이터 (예 Polycomb 단백질)에 대해, 우리는 일반적 200-1000 BP에 염색질 sonicate. 그러나 최적의 조각 크기는 경험적으로 테스트해야합니다. 참고 : 항상에도 가열의 샘플을 방지하기 위해 SONICATING 동안 얼음 튜브를 유지! </li><li> 1.8 ML RIPA 버퍼를 (추가하여 샘플을 희석 10 설명된대로 MM 트리스-HCL, 산도 7.6, 같은 농도에서 테아제 억제제와 PMSF와 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % SDS, 0.1 % 나-Deoxycholate, 1 % 트리톤 X-100, 이전에). 65에서 2 μL 5M NaCl과 부화를 추가하여 입력 컨트롤 등 40 μL를 저장 ° C crosslink를 반대하는 (O / N) 하룻밤 사이에. </li><li> 구슬로 항체를 결합한하려면 1.5 ML eppendorf 튜브 40 μL 단백질에게 구슬을 추가한 후, 2 분 동안 4 ° C에서 600 μL PBS와 바위를 추가 자석에 구슬을 적용하고 뜨는 제거합니다. 100 PBS의 μL과 관심의 항체를 추가합니다 (항체의 양은 empir 결정한다ically). 4시간 1 시간 또는 4 ° C에 대한 RT에서 품어. </li><li> 자석에 의해 구슬에서 뜨는 제거하고 단계 2.4부터 비즈에 1mL 염색질 추출물을 추가합니다. 4에서 회전 ° CO / N. </li><li> 자석에 칩 샘플을 신청하고 뜨는 제거합니다. 십분 각각에 대해 4에서 다음 버퍼 ° C로 염주를 씻으십시오 : RIPA 버퍼 1 ML과 2X [1.89 ML &#39;RIPA 버퍼&#39;+ 315 μL 7x 테아제 억제제 + 20 μL PMSF]; RIPA 버퍼 1 ML과 2X + 0.3 M NaCl [1.89 ML RIPA 버퍼 + 220 μL 3 M NaCl]; LiCl 버퍼 1 ML (0.25 M LiCl, 0.5 % NP40, 0.5 % NaDOC)과 2X; 1X 1X TE의 1 ML과 + 0.2 % 트리톤 X-100; 1X TE 1 ML과 1X. </li><li> crosslink를 반대하려면, 100 μL TE 버퍼에 염주를 resuspend + 3 μL 10% SDS + proteinase K (20 밀리그램 / ML) 5 μL. 65 품어 ° CO / N. </li><li> 자석에 구슬을 적용하고 새 튜브로 뜨는을 전송. 뜨는 당신의 DNA 샘플이 포함되어 있습니다. 100 μL TE + 0.5 M로 구슬을 씻는다NaCl은 두 뜨는을 결합. </li><li> 페놀 - 클로로포름은 DNA 샘플을 추출합니다. Chlorofrom : : 200 μL 페놀 추가 IAA (25:24:1) 혼합 및 소용돌이. RT에서 5 분 14k에 봐. 또는 DNA는 Qiagen PCR 정화 키트를 사용하여 추출 할 수 있습니다. </li><li> 새로운 튜브로 뜨는 / 수성 레이어를 양도, 20 μg / ML (또는 20 밀리그램 / 뜨는의 모든 일 ML에 대한 ML의 글리코겐 1 μL의 최종 농도에 선형 아크릴 아미드를 추가도 사용하실 수 있습니다. 글리코겐이 사용됩니다 선형 아크릴 아미드가 assays를 시퀀스에 사용되는 동안 후속 qPCR 또는 PCR 분석.) 3M NaOAc 20 μL와 500 μL 100 % EtOH를 추가합니다. 잘 섞어서 80에 품어 ° C를 10 분. 4에서 20 분 동안 최대 속도로 스핀 ° C. </li><li> 뜨는 제거하고 300 μL 70 % EtOH로 씻는다. 50 μL TE 버퍼에 대기 건조하고 resuspend 샘플. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 시료는 정량 PCR (qPCR) 분석 (그림 1)을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 3A. qPCR을 사용하여 칩 에드 DNA를 분석 <ol><li> undiluted, 1 / 10, 100분의 1, 1 / 1000, 5천분의 1 : 표준 곡선을 만들기 위해 다음과 같은 농도에서 게놈 DNA를 희석. </li><li> 각 프라이머 쌍 들어, 단계 3a.1, 입력 제어 및 칩 에드의 DNA에서 게놈 DNA와 96 - 웰 플레이트에 중복으로 qPCR를 설정 : 10 μL 2X SYBR PCR 혼합 (Fermentas, K0222); 앞으로 1 μL 10 μm의 프라이머; 1 μL 10 μm의 역방향 프라이머; X μL 칩 에드 DNA (입력 제어, 또는 게놈 DNA); Y μL nuclease없는 H 2 O 20 μL로 반응 볼륨을 조정합니다. </li><li> 미니 플레이트 스피너 (Labnet)와 96 - 웰 플레이트를 봐. </li><li> 다음과 같은 조건을 사용하여 ABI 7,300 실시간 PCR 시스템 (또는 기타 실시간 PCR 시스템)으로 qPCR을 수행합니다 : 1 단계 : 50 ° 2 분, 1주기위한 C; 2 단계 : 95 10 분, 1 사이클에 대한 ° C; 3 단계 : 95 ° 15 초, 60 ° C 1 분 용 C, 40 Cycles; 4 단계 (분리 단계) : 95 ° 15 초, 60 ° C 1 분, 95 용 C ° 15 s에 대한 C #. </li><li> 해리 곡선을 확인하십시오 : 열 분해 계획에서 하나의 피크는 PCR 반응에서 단일 amplicon을 제안합니다. 하나 이상의 피크는 프라이머 쌍과 비 특정 제품을 나타냅니다, qPCR 데이터는 사용하지 않아야합니다. </li><li> 3A의 희석 게놈 DNA의 시리즈를 사용하여 표준 곡선을 기반으로 CT (사이클 한계) 값에 따라 DNA의 양을 해결 수식을 계산하여 각 프라이머 세트에 대한 PCR 반응의 기하 급수적인 증폭의 선형 단계를 결정합니다. 1. </li><li> 칩 에드의 DNA 및 입력 컨트롤의 CT 값이 CT 가치의 선형 범위 내에있다면, 칩 에드 DNA와 2.4의 입력 컨트롤의 diluting 요인에 따라 칩 에드의 DNA 대 입력의 농축을 계산합니다. </li></ol> 3B. 높은 처리량의 시퀀싱을위한 칩 에드 DNA를 증폭. <ol><li> 칩 에드의 DNA 믹스의 최종 수리 (사용얼음 설정 Epicentre DNA를 최종 수리 키트) : 단계 2.12 (0.1-5 μg) 1-34 μl 게놈의 DNA 5 μl 10X 최종 수리 버퍼 5 μl dNTP 2.5 MM 믹스 5 μl 10 밀리미터 ATP X μl H 2 O 49 μl로 반응 음량을 조절하려면 1 μl 최종 복구 효소 믹스 (T4의 DNA 중합 효소 + T4 폴리 뉴클레오 타이드의 키나제) RT에서 45 분 동안 품어. Qiagen MinElute 반응을 사용하여 반응을 정화 정리 키트. 30 μl 용출 버퍼 (EB)에 Elute. </li><li> 3 &#39;끝에 A-overhangs 추가 : 단계 3b.1에서 eluted DNA 제품의 30 μl 5 μl 10X 코 버퍼 # 2 10 μl 1 ㎜ dATP 2 μl DH 2 O 3 μl 5 U / μl Klenow의 조각 (3 &#39;→ 5&#39;엑소-) 37시 30 분 품어 ° C. MinElute ReactionCleanup 키트를 사용하여 반응을 정화. 10 μl EB에 Elute. </li><li> Solexa 링커 내고 : 단계 3b.2에서 eluted DNA를 10 μl 10 μl ddH 2 O 2.5 &amp;무; 리터 10X T4의 DNA ligase 버퍼 Illumina에서 1 μl 아답터 oligo 믹스 (혈통 1/10-diluted) 2.5 μl T4의 DNA ligase (400 단위 / μl) RT에서 1 시간 동안 알을 품다. MinElute ReactionCleanup 키트를 사용하여 반응을 정화. 20 μl EB에 Elute. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 </li><li> 전자 젤 장치를 사용하여 단계 3b.3에서 eluted DNA 샘플을 실행합니다. 겔에 300-500 BP 밴드를 분리하고 Qiagen 젤 추출 키트 (이 단계는 어댑터 oligo를 내고에서 ~ 125 BP 자체 출혈도 잡았 linkers을 제거)을 사용하여 정화. 12 μl EB에 Elute. </li><li> Illumina에서 라이브러리 이점 엔드를 사용하여 (PE) primers를 증폭 : 단계 3b.4에서 eluted DNA의 10.5 μl 마스터 믹스의 12.5 μl (2X Phusion HF, Finnzymes) PE1 PCR의 프라이머 1 개 중 1 μl PE2 PCR의 프라이머 2 개 중 1 μl PCR 조건 : 98 ° C ~ 30에 해당하는 초 (98 ° C 10 초, 65 ° C 30 초, 72 ° C에서 30 초), 반복 20주기 15 분 72 ° C에서. </li><li> 단계 3b.5의 표본 표준 2퍼센트 아가로 오스 겔을 사용하여 적절한 크기의 DNA (300-500 BP)를 선택한 후 칩 seq 사용할 수 있습니다. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 그것은 오염을 방지하기위한 하나의 겔에서 각 칩 샘플을 분리하는 것이 좋습니다. 샘플은 높은 처리량 시퀀싱을 위해 제출할 수 있습니다. </li></ol> 3C. Solexa 파이프라인 분석 <ol><li> 25-BP 시퀀싱 읽고는 Illumina 게놈 분석기 (GA) 파이프라인에서 얻은되었다. </li><li> 모든 읽기가 참조 시퀀스 두 불일치 최대 있도록 큰 영양 (뉴클레오 티드 데이터의 효율적인 로컬 정렬) 소프트웨어를 사용 Drosophila 게놈 (dm3)으로 정렬되었습니다. </li><li> 유니 클리 매핑 읽기는 스트림 분석을 위해 유지되었다. 여러 개의 동일한 읽기의 경우 최대 3 사본은 PCR 증폭의 편견의 가능성을 줄이기 위해 유지되었다. </li><li> GA의 파이프라인의 출력은 브라우저의 확장 가능한 데이터 (침대) 파일로 변환되었습니다. </li><li> 생성하려면시각화를위한 UCSC 브라우저에 업로드를위한 가발 파일, 우리는 창 크기 등 네 BP와 DNA를 조각 크기로 160 BP로 이전 발행물 3에서 설명한되었습니다 비단뱀 짐보 따리를 사용했습니다. </li><li> 침묵과 표현의 유전자에 Drosophila의 유전자를 분류하기 위해, 우리는 RPKM이라는 디지털 숫자 (kilobase 당 /은 exonic 지역을 병합 / 만 당 매핑된가 읽고 읽습니다) 사용됩니다. RPKM = 0과 유전자 RPKM가 ≥ 1, 낮은 적당한 높은 표현 수준 유전자로 세 subgroups로 나눌 수 표현 그룹으로 분류되었다와 침묵 그룹 및 유전자로 분류하고, 각 그룹에 대해 같은 번호를 가지고 있었다 유전자. </li><li> 히스톤 수정 수준과 유전자 발현을 비교하기 위해, 우리는 이전 게시물 3에서 설명한되었습니다 파이썬 스크립트를 사용했습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 웅을 사용하여 칩 qPCR 결과의 예 (구슬의 가방) 돌연변이<html> testes은 그림 1 4에 표시됩니다. 빵 testes에서 proliferative spermatogonia에서 spermatocytes 5, 6을 차별로의 전환에 실패 있습니다. 우리는이 조직 유형에 풍부하고 undifferentiated 배아 세포에 대한 소스로 빵 testes를 사용합니다. 이러한 남성 특정 전사 인자 87 (mst87F), 돈 주앙 (DJ) 및 퍼지 양파 (fzo)와 같은 정자 분화에 필요한 차별화의 유전자는, 빵 testes로 표현되지 않습니다. 이 유전자는 매우 억압 H3K27me3 히스톤 수정 7 (그림 1A)와 풍부한 있지만 활성 H3K4me3 히스톤 수정 8 (그림 1B), 우리가 &#39;monovalent&#39;일곱이라는 염색질 서명없는 상태입니다. H3K27me3 또는 H3K4me3 중의 농축은 constitutively 표현 Cyclin (CycA) 유전자 4 정규화에 의해 결정됩니다. 빵 돌연변이의 testes은 (그림 2) 그림 1에 표시된 qPCR 결과를 확인. 세 가지 테스트 터미널 차별화의 유전자에 대한 mst87F, DJ와 fzo과 항체의 동일한 집합 (즉 억압 H3K27me3 적극 H3K4me3)를 사용하여 콘텐츠 &quot;&gt; 칩 seq 분석 그들의 게놈 영역은 매우 H3K27me3 있지만 H3K4me3 (그림 2A-2C)로 풍부합니다. 반대로 constitutively 표현 CycA 유전자는 상당한 H3K4me3 있지만 전사 시작 사이트 (TSS) (그림 2D) 근처의 작은 H3K27me3 구속력이 있습니다. 또한, differentially 표현 유전자 네 가지 클래스 TSSs 근처 H3K27me3과 H3K4me3의 칩 프로파일은 각 히스톤 수정의 기능과 일치합니다. 다른 이름으로 그림 3A와 같이 TSSs의 H3K27me3 하류의 농축은 반대 유전자 발현 수준과 서로 관련됩니다. 침묵 유전자 반면에 높은 H3K27me3을 가지고높은 표현 유전자는 더 H3K27me3 구속력이 없습니다. 이러한 데이터는 유전자 발현에 H3K27me3의 억압 역할과 일치합니다. 반대로, TSSs 주위 ​​H3K4me3의 농축은 유전자 발현에 H3K4me3의 적극적인 역할과 일치하는 유전자 발현 수준 (그림 3B)와 반대로 상관 관계를 보여주었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> 어느 억압 H3K27me3 히스톤 변형 (A) 또는 (b) 웅 셀 - 농축 undifferentiated 돌연변 testes에서 활동중인 H3K4me3 히스톤 변형에 대한 항체를 사용하여 칩 에드 DNA의 그림 1. qPCR 분석. () 빵에 testes, 차별화의 유전자는 (Mst87F, DJ, fzo) H3K27me3 억압 히스톤 변형에 풍부합니다. (B) 분화의 유전자는 H3K4me3 활성 마크 소진됩니다. 대상 유전자 (Mst87F, DJ 또는 fzo)에서 칩 DNA의 수준 (칩 DNA / 입력)이 먼저 레바로 정상화되었다<html> 컨트롤 CycA 유전자에 칩 DNA의 엘. 오차 막대는 세 독립적인 생물의 표준 편차가 복제를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> 그림 2. UCSC 게놈 브라우저 H3K27me3의 스냅샷 및 () Mst87F가 (B) DJ와 (C) fzo, (D) CycA의 유전자.는 (D)에서 H3K27me3 강화 지역을 동그라미의 전체 게놈 영역에 걸쳐 H3K4me3 농축도의 염색질 상태를 반영 웅에 미천한 표시됩니다 중복 유전자 CG7264, testes (RPKM = 1)하지만 높은 야생 형 testes로 표현 (RPKM = 130) 8 (7에서 칩 seq 데이터). 그림 1 칩 결과의 정량 PCR 분석에 사용되는 프로브는 각 플롯의 하단에 표시된있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. 칩 seq 프로필 testes 7 웅에 H3K27me3 및 H3K4me3을 사용합니다. 네 가지 유전자 그룹 (7,509 유전자)는 RNA-seq 결과 8 일 기준으로 자신의 유전자 발현 수준에 따라 분류되었다. 유전자의 대표적인 클래스들은 전사 시작 사이트 (TSSs)의 3킬로바이트 상류에 3킬로바이트 스트림의 시퀀스를 사용하여 특정 히스톤 수정의 농축을 위해 꾸몄다됩니다. 이것은 () H3K27me3 (K27)와 각 그룹에서 (B) H3K4me3 (K4) 칩 seq 분석가.의 농축의 프로필을 생성하는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오를</a> .

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

이 프로토콜에서 언급한 칩 분석의 다양성은 생물학적으로 관련 시스템에 염색질 상태를 공부할 수있는 기회를 제공하는 다른 조직에 사용할 수 있습니다. 교양 시스템에서 세포를 이용한 칩 실험은 세포의 대량 쉽게 얻을 수 있기 때문에 수행할 편리합니다. 그러나 교양 전지는 반드시 멀티 셀룰러 환경에서 세포를 반영하지 않습니다. 살아있는 동물의 해부 조직을 이용해이 기술을 개발함으로써 우리는 많은 질문을 해결할 수있는 교양 세포가 안돼요. 이 프로토콜의 유용에도 불구하고, 몇 가지주의 사항이 있습니다. 예를 들어, 해부하는 조직은 여전히​​ 여러 가지 세포 유형과 이기종입니다. 비교적 균일한 세포와 같은 imaginal 디스크, 내장과 같은 다른 조직, testes, 모든 제한된 성인 줄기 세포를 포함하는 이기종 있습니다 난소와 같은 Drosophila 조직에서 얻을 수 있지만. 이러한 합병증은 부분적으로 수강력한 Drosophila 유전자를 사용하여...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 전체 미니 테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 알데히드 (37 %) </td><td> Supelco </td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 시그마 </td><td> 78,830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes 펠릿 유봉 </td><td> 피셔 과학 </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 정화 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,104 </td><td></td></tr><tr><td> 선형 polyacrylamide </td><td> 시그마 </td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td> 글리코겐 </td><td> Qiagen </td><td> 158,930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR 녹색 / ROX qPCR 마스터 믹스 </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> 미니 플레이트 스피너 </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> 실시간 PCR 시스템 </td><td> 응용 Biosystem </td><td> 4,351,101 </td><td></td></tr><tr><td> 작은 볼륨 초음파 프로세서 </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> 모델 중단 </td></tr><tr><td> Dynabeads, 단백질 </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> 자석을 Dynamag </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 : Chlorofrom : IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA를 최종 수리 키트 </td><td> Epicentre의 Biotechnologies </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute ReactioN 정리 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow 조각 (3 &#39;→ 5&#39;엑소-) </td><td> 뉴잉글랜드 Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4의 DNA ligase </td><td> Promega Corporation은 </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> 어댑터 oligonucleotides </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> 이점 엔드 프라이머 1.0 및 2.0 </td><td> Illumina </td><td> 1,001,783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-젤 Electorphoresis 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

사용 염색질 immunoprecipitation (chip) drosophila 조직

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics는 급속히 발전 분야 남아 그 염색질 상태가 서로 다른 개발 단계에서의 서로 다른 세포 유형에서 차동 유전자 발현에 기여하는 방법 연구. Epigenetic 규제는 성인의 배아 발달과 항상성 동안 세포 분화를 포함하여 생물 학적 과정의 광범위한 스펙트럼에 기여한다. epigenetic 연구에 중요한 전략은 다양한 히스톤 수정 및 염색질 요인이 유전자 발현을 조절하는 방법 검토하는 것입니다. 이것을 해결하기 위해, 염색질 Immunoprecipitation (CHIP)이 관심의 세포에있는 DNA와 특정 요인 협회의 스냅샷을 얻기 위해 널리 사용됩니다. 칩 기술은 일반적으로 재현할 데이터를 생성하기 위해 풍부하고 균질성에서 얻을 수 재료를 시작으로 교양 세포를 사용합니다. 그러나 몇 가지주의 사항이 있습니다 : 첫째, 배양 접시에있는 세포를 성장 환경은 따라서 생체내의 그것과는 차이가 있습니다살아있는 유기체의 세포 내생 염색질 상태를 반영하지. 둘째, 세포의 모든 유형은 교양 전직 생체내 될 수 있습니다. 사람들이 칩 분석을위한 충분한 자료를 얻을 수있는 세포 라인의 단지 제한된 수의이 있습니다. 여기 Drosophila 조직을 사용하여 칩 실험을 할 방법을 설명합니다. 시작 자료는 따라서 정확하게 내생 염색질 상태를 반영할 수, 살아있는 동물에서 조직을 해부하고 있습니다. 조직의 다양한 종류가있는이 방법의 적응성은 연구자 더 생물학적으로 많은 생체내 1, 2의 epigenetic 규제에 관한 관련 질문을 해결하실 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq)와 함께이 방법을 결합하면 더욱 연구자 epigenomic 풍경을 얻을 수 있습니다.

최근 높은 처리량 시퀀싱 기술은 크게 염색질 Immunoprecipitation (칩) 실험의 감도를 증가하고 정화 셀 또는 해부 조직을 사용하여 응용 프로그램을하라는 메시지가있다. 여기에 칩 기술을 사용하는 방법을 윤곽을 그리다<em&gt; Drosophila</em잘 특징으로 생물 학적 시스템에서 내생 염색질 상태를 해결할 수&gt; 조직.

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

후성유전학은 염색질 상태가 어떻게 서로 다른 세포 유형에서 차별적인 유전자 발현에 기여하는지를 연구하는 빠르게 발전하고 있는 분야로...

이 절차는 분리된 초파리 조직으로부터 염색질 면역침전 데이터를 생성하여 생체 내 drosophila 조직의 염색질 상태를 정확하게 반영합니다. 이 경우, 수백 개의 정소(testes)를 수작업으로 분리하여 수집합니다. 염색질 면역침전 분석은 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 수행됩니다.정제된 칩 DNA 내 특정 게놈 영역의 농축 정도를 확인하기 위해 정량적 R-T-P-C-R 분석법을 후속으로 수행합니다. 또는, 칩 샘플의 고처리량 시퀀싱을 통해 게놈 전체 프로파일을 생성할 수 있습니다. 궁극적으로, 분리된 조직의 칩 분석은 생리적 조건에 있는 세포의 크로마틴 상태를 나타냅니다.본 프로토콜은 생체에서 직접 분리한 조직의 분석에 최적화되어 있습니다. 실제 생리적 조건에서의 크로마틴 상태 및 후성유전학적 정보를 얻기 위해, 초파리에서 ChIP를 사용하여 크로마틴 상태를 확인하는 방법을 시연하겠습니다. 본 프로토콜은 생쥐나 제브라피시와 같은 다른 생물체에도 적용 가능합니다.칩 사용 또는 고처리량 시퀀싱을 위한 시퀀싱 라이브러리 생성에 필요한 충분한 품질과 양의 DNA를 얻기 위해서는 이 프로토콜의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 프로테아제 억제제와 100 µg/mL PMSF가 포함된 차가운 PBS 내에서 대상 조직(이 경우에는 약 200쌍의 초파리 정소)을 해부합니다. 조직을 두 번 헹군 후, 억제제가 포함된 동일한 PBS 용액 200 µL에 다시 현탁합니다.그런 다음 37% 포름알데히드 5.5 µL를 가해 시료를 고정합니다. 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 5분마다 볼텍싱을 해주며, 조직이 얼음 위에서 가라앉도록 둡니다.억제제가 포함된 450 µL의 PBS로 두 번 헹굽니다. 시료를 -20 °C에서 보관하십시오. 200개의 oph 고환 시료를 1.75 mL 에펜도르프 튜브에 합칩니다.버퍼를 흡입하고 샘플을 재현탁합니다. 200 µL의 lysis buffer에 넣습니다. 블루 균질기로 조직을 완전히 분해하여 응집물이 남지 않도록 하고, 실온에서 10분 동안 배양합니다.그 다음 마이크로칩 초음파 파쇄기로 샘플을 단편화하고, 얼음 위에서 50초 동안 휴지시킵니다. 칩 타겟에 최적화된 단편 크기를 얻기 위해 이 과정을 4~5회 반복합니다. 이후 1.8 milliliters 리퍼 버퍼(ripper buffer)로 희석하여 크로마틴 추출물 스톡을 만듭니다. 성공적인 칩 분석을 위해서는 DNA 단편의 크기를 경험

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

이 비디오 프로토콜은 준비하는 요한센 실험실에서 사용되는 스쿼시 기법을...

항체 라벨링에 대한 Drosophila Polytene의 염색체 Squashes의 준비

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

처프 긴 noncoding RNAs의 게놈에 바인딩 사이트 (lncRNAs)를 매핑하는 소설 및 신속한 기술입니다. 방법은 lncRNA 바인딩된 게놈 사이트의 열거를 허용하는 안티 센스가 원래의 oligonucleotides의 특이성을 이용합니다.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

초파리의 조직은 종종 세포 유형의 이종 혼합물을 포함한다. 특정 조직으로부터 특정 세포 유형에서의 유전자 발현을 조사하기 위해, 핵 유전자 태그이어서 궁합 기반 접근 방식을 사용하여 단리 할 수​​있다. 격리 핵은 유전자 발현 분석 및 면역 침전과 같은 염색질 하류 애플리케이션에 사용될 수있다.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

이 작품 설명 프로토콜 위한 고해상도 제자리에 이 C 라이브러리에서의 세대 단단히 준비 사전 gastrulation 초파리 melanogaster 태아.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

배우세요 Drosophila 조직에서 크로마틴 면역침전(ChIP)을 수행하는 방법을. 이 기술은 생리적 조건에서 염색질 상태를 정확히 분석하여 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

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