사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

이 절차는 박리된 파리 조직으로부터 염색질 면역침전 데이터를 생성하여 염색질 상태를 생체 내 초파리 조직으로 정확하게 반영합니다. 이 경우 수백 개의 고환을 손으로 해부하여 채취합니다. 염색질 면역침전 분석은 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 수행됩니다.

정제된 chipped DNA의 특정 게놈 영역 농축을 위한 후속 정량적 R-T-P-C-R 분석 분석. 또는 칩 샘플의 고처리량 염기서열분석(High Throughput Sequencing)을 통해 게놈 폭의 프로파일을 생성할 수 있습니다. 궁극적으로, 절개된 조직의 칩 분석은 생리학적 조건에서 세포의 염색질 상태를 나타냅니다.

이 프로토콜은 유기체에서 직접 분리된 조직의 분석에 최적화되어 있습니다. 실제 생리학적 조건에서 염색질 상태와 후성유전학적 정보를 얻기 위해 크럼프톤 상태를 살펴보기 위해 초파리에서 칩을 사용하는 방법을 시연할 것입니다. 이제 이 프로토콜은 쥐나 제브라피시와 같은 다른 유기체에 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜의 시각적 시연은 칩에 사용하거나 고처리량 염기서열분석을 위한 염기서열분석 라이브러리 생성에 사용하기 위해 불충분한 DNA의 품질, 품질 및 수량을 얻는 데 중요합니다. 먼저, 이 경우 프로테아제 억제제와 밀리리터 PMSF당 100마이크로그램을 함유한 저온 PBS에서 약 200쌍의 초파리 고환을 해부합니다. 조직을 두 번 헹군 후 억제제로 동일한 PBS 용액 200마이크로리터를 현탁합니다.

그런 다음 5.5 마이크로 리터의 따뜻한 37 % 포름 알데히드에서 샘플을 고정합니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 5분마다 소용돌이치며 조직이 얼음 위에 가라앉도록 합니다.

450마이크로리터의 PBS 함유 억제제로 두 번 헹굽니다. 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 200개의 oph testes 샘플을 1.75ml einor 튜브에 결합합니다.

버퍼를 흡입하고 샘플을 다시 현탁시킵니다. 200 마이크로 리터의 용해 완충액. 파란색 균질화기로 조직을 완전히 분리하여 10분 동안 실온에서 배양하는 응집체가 남아 있지 않도록 합니다.

그런 다음 마이크로칩 소트로 샘플을 조각화하고 50초 동안 얼음 위에 놓습니다. 4-5회 반복하여 칩 타겟에 대한 최적의 프래그먼트 크기를 얻습니다. 그런 다음 염색질 추출물 재고를 위해 1.8ml 리퍼 버퍼로 희석합니다.성공적인 칩 분석을 위해서는 DNA 단편의 크기를 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다.

따라서 칩 실험을 진행하기 위해 겔 전기영동을 수행해야 합니다. 입력 제어 샘플의 경우 50마이크로리터를 제거합니다. 2마이크로리터의 5몰 염화나트륨을 넣고 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다.

역교차결합(reverse-cross-link)을 위해서는 항체를 단백질에 접합하는 과정을 진행하십시오. 1.5ml 펜더 튜브에 담긴 비즈. 40마이크로리터의 단백질 A 비드와 600마이크로리터의 PBS 암석을 섭씨 4도에서 2분 동안 추가합니다.

그런 다음 구슬을 자석에 바르고 supinate를 버립니다. 이제 100마이크로리터의 PBS와 관심 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

자석에 의하여 구슬을 가을걷기 후에, 조직 chromatin 추출물의 1ml를 추가하십시오. 하룻밤 사이에 섭씨 4도 회전합니다. 다음으로, 칩 샘플을 자석에 적용하고 supinate를 제거합니다.

수확한 비드를 4도 SIU에서 10분 동안 1밀리리터 세척으로 진행하고 100마이크로리터의 차 완충액에 비드를 다시 매달립니다. 단백질 DNA 복합체를 역 교차 결합시키려면 10%SDS의 3마이크로리터와 밀리리터당 20밀리그램의 5마이크로리터를 추가합니다. Proteinase K는 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

자석에 구슬을 펠릿으로 만듭니다. DNA를 포함하는 supinate를 새 튜브로 옮깁니다. 비드를 한 번 세척하고 상등액을 함유한 2D NA를 결합합니다.

다음으로, 페놀 클로로포름 추출로 DNA를 정제하고 상부 수성층을 새 튜브로 옮깁니다. DNA를 밀리리터당 20마이크로그램, 선형 아크릴아미드 또는 글리코겐으로 침전시킵니다. 3 몰 나트륨 아세테이트 20 마이크로 리터와 100 % 에탄올 500 마이크로 리터.

잘 섞어 영하 80도에서 10분 동안 배양합니다. 원심분리로 DNA를 파일럿합니다. 상등액을 버리고 공기 건조 후 300 마이크로 리터의 70 % 에탄올로 펠릿을 한 번 씻으십시오.

Resus, 50 마이크로 리터의 TE 완충액에 DNA 펠릿을 현탁시킵니다. 부서진 DNA 샘플은 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 표준 곡선에 대한 게놈 DNA의 연속 희석을 준비합니다.

희석된 게놈 DNA 입력 제어 또는 부서진 DNA의 템플릿을 사용하여 96웰 플레이트에서 20마이크로리터 QPCR을 설정하고 미니 플레이트 스피너에서 96웰 플레이트를 중복 스핀합니다. Realtime PCR 시스템에서 샘플 플레이트를 실행하여 데이터를 검증합니다. 먼저, PCR의 단일 앰플리콘을 나타내는 열 해리 플롯에 단일 피크가 있는지 확인합니다.

다음으로, 표준 곡선을 플로팅합니다. 일련의 희석된 게놈 DNA의 데이터를 사용하여 주기 임계값에 따라 DNA의 양을 분해하는 공식을 계산합니다. Ct.Also는 각 뇌관 세트를 위한 PCR의 지수 확대의 선형 단계를 결정한다.

칩 DNA와 입력 제어 샘플의 CT 값이 CT 값의 선형 범위 내에 있는 경우, 칩 DNA의 농축 대 입력을 고려하여 계산합니다. 희석 인자 말단은 T 4 DNA 중합효소와 T 4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 포함하는 50 마이크로리터 반응에서 0.1 - 5 마이크로그램의 부서진 DNA를 복구합니다. 제조업체의 지침에 따라 실온에서 45분 동안 배양합니다.

그런 다음 MinLu 반응 클린업 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다. DNA 중합효소, 하나의 큰 CLA NOW 단편, DATP를 사용하여 3개의 프라임 말단에 돌출부를 계속 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 다시 말하지만, DNA를 정제하고 농축하기 위해 스핀 컬럼에 반응을 통과시킵니다.

어댑터 올리고로 접합을 진행합니다. T four DNA Ligase를 사용하여 Illumina에서 혼합하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 MinLu 반응 정화 키트를 통해 샘플을 실행합니다.

DNA를 20마이크로리터로 용출. 다음으로, egel 장치를 사용하여 전기 영동으로 DNA 샘플을 분리합니다. 겔에서 200-400 염기쌍 밴드를 분리하고 KYOGEN 겔 추출 키트를 사용하여 정제합니다.

이제 Illumina 프로그램 20 PCR cycles의 쌍을 이루는 말단 프라이머, 융합 HF 및 pH 효소를 사용하여 라이브러리를 증폭하십시오. 그런 다음 표준 2%AOSE 겔에서 200-400개의 염기쌍 DNA 단편을 분리하여 Ellen의 소프트웨어에서 고처리량 염기서열분석을 수행합니다. 모든 판독을 초파리 게놈에 정렬하여 참조 염기서열과 최대 2개의 불일치를 허용합니다.

여러 개의 동일한 판독에 대한 다운스트림 분석을 위해 고유하게 매핑된 판독값을 유지합니다. PCR 증폭으로 인한 바이어스 가능성을 줄이기 위해 최대 3개의 사본을 보존할 수 있습니다. 다음으로, Python 스크립트를 사용하여 GA 파이프라인의 출력을 브라우저 확장 가능한 데이터 파일로 변환합니다.

4개의 염기쌍 창 크기와 160개의 염기쌍 DNA 단편 크기를 설정합니다. 초파리 유전자를 RPKM에 의해 침묵 유전자와 발현 유전자로 분류합니다. 디지털 숫자, RPKM이 0인 유전자를 지정합니다.

침묵 그룹으로, RPKM이 1보다 큰 유전자를 낮음, 중간 및 높은 발현 수준의 3개의 하위 그룹을 가진 발현 그룹으로 분류합니다. 마지막으로, 이전에 basal 2007, the bag of marbles에서 설명한 Python 스크립트를 사용하여 히스톤 변형 및 유전자 발현 수준을 비교합니다. 돌연변이 고환은 증식성 정자(proliferative spermatogonia)에서 분화 편낭(sper cyte)으로의 전환에 실패한다.

이 칩 QPCR 실험은 BAM 고환을 미분화 생식 세포의 원천으로 사용하여 정자 분화, 히스톤 변형의 농축, 그의 스톤 3 라이신 27 메틸 3 또는 히스톤 3, 라이신 4, 메틸 3에 필요한 주요 유전자의 염색질 상태를 쿼리합니다. 분화에서 유전자는 구성적으로 발현된 사이클링 유전자로의 정규화에 의해 결정됩니다. BAM 고환에서 발현되지 않는 분화 유전자 남성 특이적 전사 인자 87 Don Juan 및 퍼지 양파는 억압적인 히스톤 3, 라이신 27 메틸 3 히스톤 변형으로 매우 풍부합니다.

게다가, 그들은 활성 히스톤이 없습니다. 셋, 라이신 4 메틸 3 히스톤 변형. 우리가 monovalent라고 부르는 염색질 서명은 히스톤 3 라이신 형태 메틸 3과 히스톤 3을 모두 가진 원자가와

라이신 27 메틸 3는 배아 줄기 세포에서 분화 유전자를 풍부하게 합니다. 동일한 항체 세트를 사용하는 칩 서열 데이터. 그림 1에 나타난 칩 QPCR 결과를 확인하십시오 시험된 3개의 말단 분화 유전자 모두의 게놈 영역은 3개의 lysine, 27 methyl three로 고도로 농축되어 있지만 histone 3, lysine 4 methyl three는 그렇지 않습니다.

대조적으로, 구성적으로 발현된 cyclin 노화는 높은 히스톤 3 라이신, 4 메틸 3, 그러나 낮은 히스톤 3 라이신 27 메틸 3 그 전사 시작 부위 근처. 이 그림은 4개의 차등적으로 발현된 유전자 클래스의 전사 시작 부위 근처에서 2개의 히스토 변형에 대한 ChIP-seq 데이터를 보여줍니다. 히스톤 3, 라이신 27 메틸 3은 전사 시작 부위의 다운스트림으로 농축되며, 이는 유전자 발현 수준과 반비례 관계가 있습니다.

침묵하는 유전자는 가장 높은 히스톤 3 라이신 27 메틸 3 수준 고도로 발현 된 유전자를 나타내며 히스톤 3 라이신 27 메틸 3 결합이 유전자 발현에 대한 히스톤 3, 라이신 27 메틸 3의 억압적 역할과 일치합니다. 반대로, 전사 시작 부위 주변의 히스톤 3, 라이신 4 메틸 3 변형의 농축은 그의 염색의 활성 역할과 일치하는 유전자 발현 수준과 반대의 상관 관계를 보여주었다. 3, 라이신 4, 메틸 3은 유전자 발현에 있습니다.

이 기법을 숙달하면 2-3일 안에 제대로 수행할 수 있습니다. 필, 클로로포름 및 포름알데히드를 사용할 때 안전 예방 조치를 사용하는 것을 잊지 마십시오. 이 프로토콜이 in vivo 조직에서 염색질 환경을 관찰하기 위해 염색질 면역침전을 사용하는 방법에 대한 충분한 이해를 제공했기를 바랍니다.