사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

이 절차는 분리된 초파리 조직으로부터 염색질 면역침전 데이터를 생성하여 생체 내 drosophila 조직의 염색질 상태를 정확하게 반영합니다. 이 경우, 수백 개의 정소(testes)를 수작업으로 분리하여 수집합니다. 염색질 면역침전 분석은 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 수행됩니다.

정제된 칩 DNA 내 특정 게놈 영역의 농축 정도를 확인하기 위해 정량적 R-T-P-C-R 분석법을 후속으로 수행합니다. 또는, 칩 샘플의 고처리량 시퀀싱을 통해 게놈 전체 프로파일을 생성할 수 있습니다. 궁극적으로, 분리된 조직의 칩 분석은 생리적 조건에 있는 세포의 크로마틴 상태를 나타냅니다.

본 프로토콜은 생체에서 직접 분리한 조직의 분석에 최적화되어 있습니다. 실제 생리적 조건에서의 크로마틴 상태 및 후성유전학적 정보를 얻기 위해, 초파리에서 ChIP를 사용하여 크로마틴 상태를 확인하는 방법을 시연하겠습니다. 본 프로토콜은 생쥐나 제브라피시와 같은 다른 생물체에도 적용 가능합니다.

칩 사용 또는 고처리량 시퀀싱을 위한 시퀀싱 라이브러리 생성에 필요한 충분한 품질과 양의 DNA를 얻기 위해서는 이 프로토콜의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 프로테아제 억제제와 100 µg/mL PMSF가 포함된 차가운 PBS 내에서 대상 조직(이 경우에는 약 200쌍의 초파리 정소)을 해부합니다. 조직을 두 번 헹군 후, 억제제가 포함된 동일한 PBS 용액 200 µL에 다시 현탁합니다.

그런 다음 37% 포름알데히드 5.5 µL를 가해 시료를 고정합니다. 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 5분마다 볼텍싱을 해주며, 조직이 얼음 위에서 가라앉도록 둡니다.

억제제가 포함된 450 µL의 PBS로 두 번 헹굽니다. 시료를 -20 °C에서 보관하십시오. 200개의 oph 고환 시료를 1.75 mL 에펜도르프 튜브에 합칩니다.

버퍼를 흡입하고 샘플을 재현탁합니다. 200 µL의 lysis buffer에 넣습니다. 블루 균질기로 조직을 완전히 분해하여 응집물이 남지 않도록 하고, 실온에서 10분 동안 배양합니다.

그 다음 마이크로칩 초음파 파쇄기로 샘플을 단편화하고, 얼음 위에서 50초 동안 휴지시킵니다. 칩 타겟에 최적화된 단편 크기를 얻기 위해 이 과정을 4~5회 반복합니다. 이후 1.8 milliliters 리퍼 버퍼(ripper buffer)로 희석하여 크로마틴 추출물 스톡을 만듭니다. 성공적인 칩 분석을 위해서는 DNA 단편의 크기를 경험적으로 결정하는 것이 매우 중요합니다.

칩 실험을 진행하기 위해 젤 전기영동을 수행해야 합니다. 입력 대조군 샘플에서 50 µL를 취합니다. 5 M sodium chloride 2 µL를 첨가하고 65 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

역가교를 위해, 항체를 단백질 A 비드에 접합합니다. 1.5 mL 펜도르 튜브에 단백질 A 비드 40 µL와 PBS 600 µL를 넣고 4 °C에서 2분 동안 흔들어 섞어줍니다.

그 다음 비즈를 자석에 적용하고 상층액을 제거합니다. 이제 100 µL의 PBS와 분석 대상 항체를 추가합니다. 이를 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

자석을 이용하여 비즈를 수확한 후, 조직 크로마틴 추출물 1 mL를 첨가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 회전시키십시오. 다음으로, 칩 샘플을 자석에 부착하고 상층액을 제거합니다.

수확한 비드를 4°C에서 각 세척당 1mL씩 세척하고, 비드를 100µL의 tea buffer에 재현탁합니다. 단백질-DNA 복합체의 가교를 해제하기 위해, 10% SDS 3µL와 20mg/mL Proteinase K 5µL를 첨가하여 65°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

자석을 이용해 비드를 펠렛화합니다. DNA가 포함된 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 비드를 한 번 세척하고 DNA가 포함된 상층액들을 합칩니다.

다음으로, 페놀-클로로포름 추출을 통해 DNA를 정제하고 상층의 수성층을 새 튜브로 옮깁니다. 20 µg/mL 농도의 선형 아크릴아미드 또는 글리코겐, 20 µL의 3 M 아세트산 나트륨, 그리고 500 µL의 100% Ethanol을 사용하여 DNA를 침전시킵니다.

잘 섞은 후 -80 °C에서 10분 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 DNA를 침전시킵니다. 상층액을 제거하고 공기 건조 후 300 µL의 70% ethanol로 펠렛을 한 번 세척합니다.

DNA 펠릿을 50 µL의 TE buffer에 현탁하십시오. 칩핑된 DNA 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. 표준 곡선을 위해 게놈 DNA의 단계별 희석액을 준비하십시오.

희석된 genomic DNA 입력 대조군 또는 chipped DNA 템플릿을 사용하는 96-well 플레이트에서 20 µL의 qPCR 반응물을 듀플리케이트(duplicate)로 준비한 후, 미니 플레이트 스피너(mini plate spinner)에서 96-well 플레이트를 스핀합니다. 데이터를 검증하기 위해 실시간 PCR 시스템에서 샘플 플레이트를 가동합니다. 먼저, 열 해리 곡선(thermal dissociation plot)에서 PCR의 단일 앰플리콘(amplicon)을 나타내는 단일 피크가 존재하는지 확인합니다.

다음으로 표준 곡선을 그립니다. 희석된 genomic DNA 시리즈의 데이터를 사용하여, 임계 주기(cycle threshold, Ct)에 따라 DNA 양을 산출하는 공식을 계산하십시오. 또한 각 프라이머 세트에 대해 PCR의 지수 증폭 선형 단계를 결정하십시오.

칩 DNA와 입력 대조군 샘플의 CT 값이 CT 값의 선형 범위 내에 있다면, 입력 대조군 대비 칩 DNA의 농축도를 계산합니다. 희석 배수를 고려하여 T4 DNA 중합효소와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제가 포함된 50 µL 반응액에 0.1에서 5 µg의 칩 DNA의 말단 수선을 수행합니다. 제조사의 지침에 따라 실온에서 45분 동안 배양합니다.

그 다음 MinLu reaction cleanup 키트를 사용하여 DNA를 정제하십시오. DNA polymerase, 대량의 CLA NOW 프래그먼트 및 dATP를 첨가하여 3' 말단에 오버행을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양하십시오. 다시 스핀 컬럼을 통해 반응액을 통과시켜 DNA를 정제하고 농축하십시오.

어댑터 올리고(adapter oligo)를 이용해 라이게이션(ligation)을 진행하십시오. Illumina의 T four DNA Ligase를 사용하여 혼합한 후 실온에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 그 다음 MinLu reaction cleanup kit를 통해 샘플을 정제하십시오.

20 µL의 용액으로 DNA를 용출합니다. 다음으로, egel 장치를 사용하여 전기영동으로 DNA 샘플을 분리합니다. 겔에서 200~400 bp 밴드를 분리하고 KYOGEN 겔 추출 키트를 사용하여 정제합니다.

이제 paired end 프라이머, fusion HF 및 pH 효소를 사용하여 Illumina 프로그램으로 20 PCR 사이클 동안 라이브러리를 증폭합니다. 그런 다음 표준 2% AOSE 겔에서 200~400 base pair DNA 단편을 분리하여 Ellen's 소프트웨어에서 고처리량 시퀀싱을 수행합니다. 모든 리드를 drosophila 게놈에 정렬하며, 참조 서열과 최대 두 개의 미스매치를 허용합니다.

다수의 동일한 리드(read)가 있는 경우, 후속 분석을 위해 고유하게 매핑된 리드만 유지하십시오. PCR 증폭으로 인한 편향 가능성을 줄이기 위해 최대 3개의 복제본까지 유지하십시오. 다음으로, Python 스크립트를 사용하여 GA 파이프라인의 출력물을 브라우저 확장 가능 데이터 파일로 변환하십시오.

윈도우 크기는 4 base pair로, DNA 단편 크기는 160 base pair로 설정하십시오. RPKM에 따라 초파리 유전자를 침묵 유전자와 발현 유전자로 분류하십시오. RPKM이 0인 유전자는 디지털 숫자로 지정하십시오.

RPKM이 1보다 큰 유전자를 발현군으로 분류하고, 이를 다시 저발현, 중발현, 고발현의 세 가지 하위 그룹으로 나누며, 그 외의 유전자는 비발현군으로 분류합니다. 마지막으로, 이전에 basal 2007의 'bag of marbles'에서 설명한 Python 스크립트를 사용하여 히스톤 수정 및 유전자 발현 수준을 비교합니다. 돌연변이 고환에서는 증식성 정조세포에서 분화성 정모세포로의 전환에 실패가 나타납니다.

본 chip QPCR 실험은 미분화 생식 세포의 공급원으로 BAM 고환을 사용하여, 정자 분화에 필요한 핵심 유전자들의 염색질 상태와 히스톤 수정인 histone three lysine 27 methyl three 또는 histone three lysine four methyl three의 농축 정도를 분석합니다. 분화 유전자의 농축도는 상시 발현되는 cycling a 유전자를 통해 정규화하여 결정합니다. BAM 고환에서는 발현되지 않는 분화 유전자인 male specific transcription factor 87 Don Juan 및 fuzzy onion은 억제성 히스톤 수정인 histone three lysine 27 methyl three가 매우 높게 농축되어 있습니다.

또한, 이들은 활성 히스톤인 histone 3 lysine 4 trimethyl histone 수식(histone modification)이 결여되어 있습니다. 이는 histone 3 lysine 4 trimethyl과 histone 3를 모두 가진 가전자(valency)와 대조되는, 우리가 단가(monovalent)라고 부르는 염색질 시그니처입니다.

배아 줄기세포의 분화 유전자에서 Lysine 27 methyl three가 농축되어 있습니다. 동일한 항체 세트를 사용하여 얻은 Chip 시퀀싱 데이터입니다. 그림 1A에 표시된 chip QPCR 결과와 일치함을 확인하십시오. 테스트한 세 가지 최종 분화 유전자의 모든 게놈 영역에서 histone three, lysine four methyl three는 관찰되지 않았으나, three lysine, 27 methyl three는 고도로 농축되어 있습니다.

반면, 지속적으로 발현되는 cyclin aging은 전사 시작 부위 근처에서 histone three lysine 4 methyl 3 수치는 높지만, histone three lysine 27 methyl 3 수치는 낮습니다. 이 그림은 서로 다르게 발현되는 네 가지 유전자 클래스의 전사 시작 부위 근처에서 나타나는 두 가지 히스톤 수정의 ChIP-seq 데이터를 보여줍니다. Histone three lysine 27 methyl 3는 전사 시작 부위의 하류에서 농축되어 있으며, 이는 유전자 발현 수준과 역상관 관계에 있습니다.

침묵 상태의 유전자는 histone three lysine 27 methyl three 수준이 가장 높게 나타났으며, 고발현 유전자는 histone three lysine 27 methyl three 결합이 나타나지 않아, 유전자 발현에 대한 histone three, lysine 27 methyl three의 억제적 역할과 일치하는 결과를 보였습니다. 반대로, 전사 시작 부위 주변의 histone three, lysine four methyl three 수식의 농축은 유전자 발현 수준과 반대 상관관계를 보여, 유전자 발현에 대한 histone three, lysine four, methyl three의 활성 역할과 일치함을 확인하였습니다.

이 기술을 숙달하면 2~3일 이내에 적절히 수행할 수 있습니다. phenol, chloroform 및 formaldehyde를 사용할 때는 반드시 안전 예방 조치를 취하시기 바랍니다. 본 프로토콜이 in vivo 조직의 크로마틴 랜드스케이프를 관찰하기 위한 크로마틴 면역침전법 사용에 대해 충분한 이해를 제공했기를 바랍니다.