방사성 현장에서 하이브리드화

다음 실험의 전체적인 목적은 특정 유전자 발현 영역을 식별하고, 유전자 발현의 시기와 수준을 특성화하여 유전자 기능의 이해에 기여하는 것입니다. 이는 조직의 무결성을 보존하기 위해 실험에 사용될 조직을 신속하게 채취하고 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 리보 프로브(ribo probe)의 배경 결합을 줄이기 위해 조직을 처리합니다.

다음으로, ribo probe를 조직에 하이브리드화하고 RIBA probe의 결합을 시각화합니다. X-ray 필름이나 감광 에멀션을 사용하여 X-ray 이미지 또는 암시야 및 명시야 현미경 관찰 및 분석을 통해 유전자 발현의 위치와 수준을 보여주는 결과를 얻습니다. Image J 소프트웨어를 사용할 때, 많은 사람들이 실수하기 쉬우며 정확하게 수행해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있는데, 그중 하나는 배경 잡음을 방지하는 것입니다.

불충분한 세척이나 적절하지 않은 온도에서의 하이브리다이제이션과 같이 배경 노이즈를 유발할 수 있는 여러 단계가 있습니다. 또 다른 요인은 RNA 프로브를 분해시키는 RNA 오염입니다. 따라서 모든 과정을 RNase-free 상태로 유지하는 데 주의를 기울여야 합니다.

세 번째 주의사항은 슬라이드를 유제에 담글 때 암실 내에 빛 샘 현상이 없도록 하고, 최대 3주까지 지속될 수 있는 모든 공정 단계 동안 유제가 노출되지 않도록 해야 한다는 점입니다. 따라서 이 기술의 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Hun Chen이 진행하겠습니다. 신선한 뇌를 채취하여 1x PBS로 세척한 후, 상온에서 배지가 들어 있는 몰드에 뇌를 담가 OCT 조직 기술 배지에 뇌를 임베딩합니다.

뇌가 절편 제작에 적합한 방향으로 놓였는지 확인하십시오. 그런 다음 드라이아이스에 에탄올을 분사하고, 블록을 에탄올과 드라이아이스 혼합물에 넣어 조직을 동결시킵니다. 에탄올이 블록 내부로 들어가지 않도록 주의하며 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 동결된 조직을 10~12 micron 두께의 절편으로 자르고, 뇌 및 배아 조직용 super plus 슬라이드에 부착하십시오.

최적의 절편 제작 온도는 -18 °C에서 -20 °C 사이입니다. 절편은 -80 °C의 슬라이드 보관함에 보관하십시오. -80 °C 보관함에 있던 슬라이드를 드라이아이스 위에 놓인 금속 랙으로 옮기십시오.

그 다음, 인증된 흄 후드 내에서 랙을 상온보다 3~5°C 높게 예열한 4% 파라포름알데히드 용액에 넣습니다. 상온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 랙을 파라포름알데히드에서 꺼내고, 랙을 PBS에 15회 담가 슬라이드를 세척합니다. 이 세척 단계를 신선한 PBS 용액을 사용하여 두 번 더 반복합니다.

다음으로, RIBA 프로브의 비특이적 결합을 줄이기 위해 슬라이드를 갓 조제한 아세틸화 완충액에 10분 동안 담급니다. 그 후 이전과 같이 슬라이드를 세척하되, 이번에는 2배 SSPE를 세척액으로 사용합니다. 70%, 95%, 100% 에탄올 시리즈에 각각 2분씩 담가 조직을 탈수합니다.

그 다음 흄 후드 내에서 슬라이드를 최소 10분에서 15분 동안 건조합니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 RIBA 프로브를 합성한 후, 모든 슬라이드에 필요한 RIBA 프로브와 하이브리다이제이션 용액의 부피를 계산합니다. Ribo 프로브 하이브리다이제이션 믹스를 65 °C에서 5분 동안 예열합니다.

Ribo probe를 변성시키기 위해 Ribo probe 하이브리다이제이션 용액 100 µL를 피펫으로 분주하여 커버슬립 전체에 고르게 배치합니다. 그런 다음 두 번째 유리 커버슬립을 사용하여 조직과 커버슬립 위에 용액을 고르게 펴 바릅니다. 슬라이드를 금속 랙에 수평으로 똑바로 세워 배치하고, 모든 슬라이드가 준비되면 랙을 65 °C 오일 배스에 천천히 담가 최소 4시간에서 최대 16시간 동안 유지합니다.

오일은 배양 후 커버 슬립 주변에 공기가 통하지 않는 밀봉막을 형성합니다. 슬라이드가 담긴 금속 랙에서 여분의 오일을 닦아내십시오. 그런 다음 흄후드 내의 클로로포름이 담긴 유리 또는 금속 트레이에 랙을 넣으십시오. 신선한 클로로포름이 담긴 두 번째 트레이에서 세척 과정을 반복하십시오.

다음으로, 커버 슬립을 분리하고 과잉의 하이브리디제이션 용액을 용해하기 위해 랙을 0.1% beta-mercaptoethanol과 2× SSPE 용액 혼합액에 담급니다. 그 후 슬라이드를 신선한 0.1% beta-mercaptoethanol과 2× SSPE 용액이 담긴 두 번째 용액으로 옮깁니다. 커버 슬립이 제거된 슬라이드를 0.1% beta-mercaptoethanol과 2× SSPE가 포함된 트레이의 새 랙으로 옮겨, 결합되지 않은 과잉 RNA 프로브를 제거하기 위해 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 슬라이드 랙을 65 °C로 예열하고 최종 농도가 0.1%가 되도록 beta ME와 ethanol이 포함된 2× SSPE plus 50% main wide solution에 옮겨 65 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 이 용액과 이전의 모든 수성 세척 용액 및 커버슬립을 방사성 폐기물로 처리합니다. 다음으로, 65 °C로 예열된 0.1× SSPE에서 슬라이드를 30분씩 두 번 세척합니다.

그런 다음 조직을 70%, 95%, 100% ethanol 시리즈로 각각 2분씩 처리하여 탈수시킵니다. 마지막으로 흄 후드 내에서 슬라이드를 최소 30분 동안 건조합니다. 먼저 조직에 방사성 신호가 존재하는지 확인합니다.

암실에서 안전등을 사용하여 건조된 슬라이드를 필름 카세트에 넣고 슬라이드 위에 X선 필름을 배치합니다. 슬라이드가 필름의 유제면을 향하도록 확인한 후 카세트를 닫습니다. 전사체의 예상 풍부도에 따라 슬라이드를 필름에 1일에서 7일 동안 노출시킵니다.

노출이 완료되면 표준 현상액과 정착액으로 X선 필름을 현상합니다. 하이브리다이제이션 신호는 유제 내 노출된 은 입자로 인해 필름상에 검은 영역으로 나타나며, 이를 통해 세포 해상도를 결정하고 조직 자체의 신호를 확인할 수 있습니다. 슬라이드를 사진 유제에 담근 후 대조 염색을 수행합니다.

슬라이드를 크레실 바이올렛으로 대조 염색하려면, 서면 프로토콜의 지침에 따라 절편을 탈파라핀화해야 합니다. 이때 암실에서 튜브에 증류수를 붓습니다. uc NTB 유제를 덜어내고, 증류수를 사용하여 유제를 1:1 비율로 희석합니다.

42 °C 항온수조에서 20~30분 동안 에멀젼을 녹인 후, 42 °C 항온수조에 놓인 유리 침전 용기에 옮깁니다. 슬라이드를 담갔을 때 희석된 에멀젼의 높이가 슬라이드의 모든 섹션을 덮어야 합니다. 슬라이드 수량이 많을 경우, 추가 에멀젼이 필요할 수 있습니다.

이제 슬라이드를 42 °C 항온 수조 내의 희석된 유탁액에 담근 후, 암실 내의 밀폐된 차광 용기에서 하룻밤 동안 건조하거나, 조명을 끈 상태의 37 °C 오븐에서 2~3시간 동안 건조합니다. 건조 후 슬라이드를 슬라이드 보관함으로 옮깁니다. 가장자리를 검은색 절연 테이프로 밀봉한 다음 알루미늄 호일로 덮습니다.

박스를 4°C에서 수일에서 수주 동안 보관하십시오. 현상 준비가 되면 슬라이드를 실온으로 가온합니다. 그 후 암실에서 슬라이드가 담긴 랙을 박스에서 꺼내 16°C의 Codec D-19 현상액에서 3~5분 동안 현상합니다. 다음으로, 현상된 슬라이드를 실온의 수돗물로 1분 동안 세척합니다.

그 다음, 슬라이드를 19 °C의 고정액에 6분씩 두 번 배양하며, 두 번째 고정액 배양 중에는 실내 조명을 켜도 좋습니다. 이제 상온의 흐르는 물에 슬라이드를 최소 30분 동안 세척합니다. 그런 다음, 슬라이드가 아직 젖어 있는 상태에서 면도날을 사용하여 슬라이드 뒷면의 유제를 긁어냅니다.

마지막으로 0.3% crystal violet으로 대조 염색한 후, 필요한 경우 서면 프로토콜의 지침에 따라 슬라이드를 탈수 및 마운팅합니다. 슬라이드 뒷면에 남은 과잉 에멀션을 물로 적신 후 면도날로 긁어내어 추가로 제거합니다. 슬라이드를 80% ethanol 용액으로 헹구고, 이물질과 먼지를 제거하기 위해 한두 번 부드럽게 닦아냅니다.

암시야 또는 명시야 조명 하에서 사진을 촬영합니다. 해부 현미경의 암시야 상태에서 쉽게 관찰되는 먼지 입자 없이 깨끗한 이미지를 얻기 위해, 긁어내기 및 세척 단계를 2~3회 반복해야 할 수도 있습니다. 다음 이미지들은 X선 필름을 이용한 인시투 하이브리다이제이션(in situ hybridization)의 자기방사법 예시입니다.

이 X선 필름 이미지는 Fox P1에 대한 antisense ribo probe로 하이브리드화한 배아 10일 차 제브라 핀치 송버드의 머리 전체 시상면 절편을 보여줍니다. 필름 상의 검게 노출된 입자들은 mRNA 발현을 나타내며, 뇌 내에서 확인할 수 있듯이 여기서 Fox P1 mRNA는 meso alium stri aum과 dorsal thalamus에 풍부하게 분포해 있습니다. 이 X선 필름 이미지는 Cuper에 대한 antisense RIBA probe로 하이브리드화한 동일한 제브라 핀치 송버드의 절편을 보여줍니다.

TF two Co.TF two는 palam alium 및 더 복측 시상(ventral thalamus)에서 풍부하게 나타납니다. 다음 이미지들은 에멀전 딥 슬라이드의 in situ hybridization 자동 방사선 촬영 예시입니다. 해부 현미경으로 촬영한 이 암시야 이미지(dark field image)는 Fox P one에 대한 antisense RIBA 프로브로 하이브리드화한 부화 후 6일차 zebra finch의 시상면 전체 머리 단면을 보여줍니다.

조직 상단 에멀전 내의 하얗게 노출된 은 입자는 messenger RNA 발현을 나타냅니다. 붉은색은 kressel violet 염색을 나타냅니다. 스케일 바는 1 mm를 나타냅니다.

여기 이미지는 antisense ribo probe를 사용하여 coop TF two에 하이브리드화한 동일한 금화조(zebra finch)의 단면을 보여줍니다. 다음 이미지들은 배아 12일차 금화조의 머리 절편을 X선 필름으로 촬영한 자동 방사법(autoradiography) 결과로, antisense 표지와 sense 표지의 서로 다른 패턴을 비교하여 보여줍니다. 점선은 전체 뇌의 윤곽을 나타내며 C는 소뇌(cerebellum)를 표시합니다.

PAC six의 안티센스 가닥이 뇌의 특히 뇌실구역(ventricular zone)에서 발현되는 것을 확인할 수 있습니다. 이와 인접한 절편을 PAC six의 센스 가닥과 혼성화한 결과, 배아 머리 전체에서는 배경 발현이 나타나지 않았으나, 안티센스 가닥과 마찬가지로 망막의 색소층에서 뚜렷한 발현이 관찰되었습니다. 다음 이미지 C는 배아 후기 단계의 금화조 뇌에서 얻은 유전자 발현의 두 가지 신호와 에멀젼 침전 슬라이드를 명시야 및 암시야 뷰로 촬영하여 보여줍니다.

이 명시야 이미지는 배아 10일 차의 D one B 발현을 보여줍니다. 유제에 정상적으로 노출되었을 때, 검은색으로 나타나는 표지는 이 배율에서 거의 보이지 않습니다. 이 이미지는 이전 이미지와 동일한 단면 및 배율을 보여주지만, 암시야 뷰로 전환하여 선조체와 시상에서 흰색으로 나타나는 표지를 보여줍니다.

이 명시야 이미지는 배아기 12일차의 slit three 발현을 보여줍니다. 유제에 과노출시킨 후, 검은색 라벨을 쉽게 확인할 수 있습니다. SC는 척수의 위치를, CB는 소뇌의 위치를 나타냅니다.

Rostral 방향은 왼쪽을 향하고 있습니다. 여기에 표시된 이미지는 동일한 단면과 배율이며, 명시야 이미지와 일치하는 척수 내의 표지를 흰색으로 보여주는 암시야 뷰로 전환한 모습입니다. 다음 이미지들은 세포 수준에서의 은 입자 해상도를 보여줍니다.

여기 Zebra finch 전뇌의 Fox P1 메신저 RNA 라벨링이 나타나 있습니다. 실버 그레인은 크리스탈 바이올렛으로 염색된 세포 위의 검은색 점으로 보입니다. 이 이미지는 성체 Zebra finch mesoalium의 개별 세포에서 높은 발현량이 나타남을 보여줍니다. 이 이미지는 동일한 절편의 인접한 alium 내 개별 세포에서 낮은 발현량이 나타남을 보여줍니다.

Hi Fox. P1 메신저 RNA 발현은 배아 12일 차 meso alium 세포에서 관찰됩니다.

여기서 보이는 배아 세포는 이전 두 이미지에서 보인 성체 세포에 비해 크기가 더 작고 더 조밀하게 배열되어 있습니다. 마지막으로, 이 이미지는 동일한 절편의 인접한 alium 내 세포들에서 낮은 수준으로 발현되는 모습을 보여줍니다. 이 절차를 따르면, 표적 유전자가 어떤 세포 유형에서 발현되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역화학법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization) 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 방사성 시약을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.