Name: 방사성 현장에서 하이브리드화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: 학습하세요 척추동물 조직에서 mRNA 발현 패턴을 정량적으로 검출하는 원위 하이브리드화 기법을 활용하여 유전자 기능과 발달 생물학을 연구하는 방법을 배우세요.

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저자는 수년 동안 프로토콜을 향상 모든 자비스 실험실 구성원을 감사드립니다.

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

mRNA의 표현의 원위치 하이브리드화의 방사성 널리 지방 조직 조직, 세포 유형과 뇌의 기능적 활동 2-5,10,12-14 공부를 포함하여 여러 용도에 사용됩니다. 나중에 사용할 누구의 mRNA 표현 뇌의 신경 활동이 증가, 종종 불리는 활동 종속적인 유전자 또는 즉각 조기 유전자에 따라 좌우 유전자에 있습니다. hatchlings / neonates, 청소년을 포함한 여러 연령대, 여러 조직에서, 뇌, 피부 및 근육을 포함하여, 이러한 용도로, 우리의 방법은 포유류 (예 : 인간), 생선 및 양서류, 조류를 포함한 여러 종류에 걸쳐 적용되었습니다 , 성인, 그리고 이곳 전체 배아 부분에 2,3,5,15-17. 우리의 프로토콜의 특징은 다음과 같습니다 : (1) 그것은 해부 학적 특이성과 양적 특이성 사이의 균형을 생산하고 있습니다. x-선 필름에서 유전자 발현을 계량하기 위해, 우리는 이미지의 디지털 사진 (. 예 : 그림 1A 및 1B)를 받아, 검사하고 사진에게 사용관심 지역에서 픽셀 밀도를 측정하고 조직 외부 필름에 배경 수준을 빼야하지만 여전히 유리 슬라이드 2,4에서하는 toshop (어도비) 히스토그램 기능. 세포 수준에서 표현을 계량하기 위해, 우리는 높은 배율 (; 그림 4 40-100X)에서 세포를 통해 실버 곡물의 이미지 가져가라. 우리는 다음 유리 슬라이드에 세포가없이 유사한 영역에서 배경 카운트를 뺍니다, 이미지에 은색 알갱이의 수를 계산하기 위해 NIH에서 웨인 Rasband하여 이미지 J의 문턱 및 측정 기능을 이용, 세포의 숫자로 나누면 셀 당 표현. 4,18의 값 (2) 그것은 동시에 100-200 슬라이드 처리를 허용, 미네랄 오일 목욕 만든 긴밀한 coverslip 인감으로 인해 상대적으로 높은 처리량이 될 수 있습니다. 구하는 표준의 원위치 하이브리드화 방법 parafilm, 매니큐어, 그리고 슬라이드는 공간을 많이 차지 다른 방법과 슬라이드를 봉인하는 데 오래 걸립니다 (3) 그것은 아주이다Dextran 황산과 하이브리드화 버퍼 2,13의 Denhardt의 솔루션으로 인해 낮은 풍요의 성적에 대한 민감한 (4) darkfield의 이미징 접근법은 4,5 해부 현미경에 darkfield 조명 아래에서 사진을 찍고으로 인해 높은 명암 이미지를 얻을. 또한,이 같은 활동에 의존 유전자 발현에서와 같이 유전자 발현의 작은 변화의 민감한 검출 19 특정 행동의 인식 및 생산 기간 동안 활성화된 특정 뇌 영역을 식별할 수 있습니다. 비 방사성 프로토콜에 상대적으로 제한 후자는 세포 해상도와 세포 내에서 mRNA의 위치에 명확하다고하며, 유제와 협력하는 것은 조작과 빛을 매우 민감합니다. 이 같은 조직 10,17,20에서 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현에 레이블을 위해 현장 하이브리드화 이러한 비 방사성 등 다른 방식으로 우리의 방법을 결합하는 것이 가능합니다. 그것은 immunocytochemistry와 조합하여 사용할 수 있습니다위해서는 동일한 시료에 RNA와 단백질 표현 모두에 레이블을 특정 세포 유형 10와 mRNA가 공동 집중하다. 이러한 이중 라벨 실험에 필요한 프로토콜 수정은 인용된 참고 문헌에 설명되어 있습니다. 요약하면, 우리의 접근 방법은 지역 조직, 조직 기능적 활동 및 유전자 기능을 이해하기 위해 타이밍과 유전자 발현의 세포 위치의 이해를 용이하게합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Cresyl 보라색 아세트산 </td><td> 시그마 </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> 써모 과학 </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Deionized 포름 아미드 </td><td> 시그마 </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100mM </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> 금형을 포함 </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> 피셔 브랜드 Superfrost 플러스 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 22-034-979 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 포름 알데히드 </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> 시그마 </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEAN 키트 </td><td> Q-바이오 유전자 </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> 코닥 BioMax MR 필름 </td><td> 시그마 </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> 코닥 NTB 에멀젼 </td><td> Carestream 건강 </td><td> 8,895,666 </td><td></td></tr><tr><td> 코닥 프로 페셔널 개발자 D19 </td><td> 코닥 </td><td> 1,462,593 </td><td></td></tr><tr><td> 코닥 전문 해결사 </td><td> 코닥 </td><td> 1,971,746 </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Calbiochem </td><td> 444,203 </td><td></td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> 76,240 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> rATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> 안전 해결 솔루션 </td><td> 안전 연구 제품 국제 해결 </td><td> 111,177 </td><td></td></tr><tr><td> 아세트산 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> 나트륨 인산염 이염 </td><td> 시그마 </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 인산염 일염기의 </td><td> 시그마 </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNA 중합 효소의 </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> 금속 선반을 염색법 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA 중합 효소의 </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 - 테크 10월 </td><td> 사쿠라 </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 5 배 전사 버퍼 </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Triethanolamine </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스-HCL (1 M, 산도 8.0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 로슈 </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> 솔루션 : <ol><li> riboprobes로 만들기위한 시약 : 1.5 μl의 DNA 템플릿 (0.2-0.3 μg / μl), 5 배 최적화된 전송 버퍼의 2 μl, 100mM DTT 1 μl (Promega에서 중합 효소와 함께 제공, 믹스잘 상온에서), RNasin의 0.3 μl (40 대 / μl), AGC ribonucleotide 믹스 솔루션, S 35 UTP 3.5 μl, 1 μl RNA 중합 효소의 1.5 μl. nuclease없는 물을 갖춘 10 μl까지 와요. </li><li> AGC의 ribonucleotide 믹스 솔루션 : 10mM ATP, GTP와 함께 CTP의 동일한 금액을 섞는다. </li><li> 40 μl RNase와 DNase 무료 물, 3M의 아세트산 나트륨 및 100 % EtOH 125 μl의 5 μl : 무료 S 35 UTP를 제거하는 EtOH 침전에 대한 아세트산 나트륨 용액. </li><li> 하이브리드화 버퍼 (10ml 주식) : 100 % deionized 포름 아미드, 5M NaCl 600 μl, 1M 트리스-HCL (산도가 = 8.0)의 5 ML, 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 240 μl (산도 = 8.0), 100x Denhart의 솔루션 100 μl, 1M DTT, 20mg/ml tRNA, 20 밀리그램 / ML 폴리 125 μl, 그리고 나트륨 Dextran 황산의 1g 250 μl의 100 μl. 10 ML에 대한 전체 볼륨을 가지고 DEPC-처리된 물을 추가합니다. 모든 나트륨 dextran 황산이 녹아 때까지 55 ° C에서 부화 후 적극적으로 흔들. 에 하이브리드화 버퍼를 저장~ 6 개월 좋다 -20 ° C,. </li><li> 4 % paraformaldehyde 용액을 버퍼 : paraformaldehyde를 위해 지정, 50 ~ 열이 ° C 따뜻한 접시에 감동하면서 플라스크에 760 ML 증류수에 paraformaldehyde 40 G를 추가합니다. paraformaldehyde를 해산하기 위해 10N NaOH 320 μl를 추가합니다. (~ 10 분) 용해 후, 10X PBS 100 ML을 추가하고 1리터 때까지 증류수로 볼륨을 제기하셨습니다. 저어과 paraformaldehyde가 해소되기 전까지 솔루션을 가열. 산도는 7.4이어야합니다. </li><li> 아세틸화 버퍼 : triethanolamine의 13.6 ML 플러스 증류수 1 리터에 아세트산 무수물의 2.52 ML. </li><li> 20x SSPE 솔루션 : 3M NaCl, 200 MM 아뇨 2 PO 4-H 2 O 및 증류수 200 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 10N NaOH로 pH를 7.4에 대한 해결 방법을 조정합니다. </li><li> 10X PBS 버퍼 : NaCl의 80g, KCl의 2.0g, 나 2 HPO 4 14.4g과 KH 2 2.4g 증류수에 PO 4. 산도 7.0에 대한 솔루션을 조정하고 1 라이트로 전체 볼륨을 가지고R. </li><li> 두번째 세차 솔루션 : 0.1 % β-메르 캅 토 에탄올과 2X SSPE에서 50 %의 포름 아미드 </li><li> Cresyl 바이올렛 아세트산 용액 : 수돗물의 3% cresyl 보라색 아세트산 (증류수 좋은 염색법을 방지), 실온에서 플라스크에 감동과 함께 하룻밤 해산. 1mm 워트 먼지 필터 종이와 Buchner 퍼널을 통해 진공 흡입으로 필터링합니다. </li></ol>

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

유전자가 표현되는 타이밍, 레벨, 세포 현지화 및 세포 유형을 안다는 건 유전자의 기능에 대한 우리의 이해에 기여한다. 이러한 기능을 각각의 세포 내에서 mRNAs에 원위치 하이브리드화에서 함께 수행할 수 있습니다. 여기 클레이튼 외. (1988) 1, 특히 성인 척추 두뇌 2-5 위해, 여러 해 동안 우리가 실험실에서 성공적으로 작동되었습니다에서 수정된 원위치 하이브리드화 방법에 방사성을 제시. 대상 시퀀스로 긴 보완 RNA (cRNA) 프로브는 낮은 풍요의 성적 6,7의 검출을 허용합니다. cRNA 프로브로 방사성 세포핵의 설립이 낮은 풍부한 성적 증명서 및 정량 분석​​에 대한 검출 감도를 허용 역시 가벼운 민감한 X 선 필름이나 조직을 통해 코팅 에멀젼에 의해. 이러한 검색 방법은 타겟 유전자 표현의 장기 기록을 제공합니다. 비 방사능 탐사 필로폰과 비교이러한 쫄지마-라벨 등 ODS, 방사성 프로브 하이브 리다이 제이션 방식은 낮은 풍요로움의 성적 증명서를 감지할 수 HRP-항체 및 / 또는 TSA 키트를 사용하여 여러 증폭 단계를 필요로하지 않습니다. 따라서이 방법은 정량 분석​​을위한 신호 강도와 타겟 mRNA 금액 사이의 선형 관계를 제공합니다. 그것은 동시에 100-200 슬라이드를 처리하실 수 있습니다. 그것은 배아의 여러 발달 단계를 위해 잘 작동합니다. 배아 세포가 어려운 조직 섹션에있는 세포 집단 사이의 경계를 확인하고, 세포 사이에 덜 결합으로, 어른 조직보다 더 깨지기 때문에 유전자 발현의 대부분은 발달 연구 부분에 전체 배아 및 비 - 방사성 방법 8,9를 사용합니다. 반대로 감성의 더 큰 범위로 인해 우리의 방사성 접근은 쉽게 인구 사이의 경계를 확인하고, 조직 지역 간의 유전자 발현의 해상도에서 높은 콘트라스트를 얻을 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 연구자가 속한새로 확인된 유전자의 가능한 의미, 그리고 더 관심이 유전자의 기능을 예측했다.

이 프로토콜이 성공적으로 양적 척추 종의 여러 조직 유형의 수준과 mRNA의 표현의 공간적 패턴을 감지하는 데 사용됩니다. 방법은 낮은 풍요로움의 성적 증명서를 감지하고 동시에 슬라이드 수백 처리 가능합니다. 우리는 예제와 같은 조류 배아 뇌의 형성의 표현 프로파일을 사용하여이 프로토콜을 제시한다.

유전자가 발현되는 시기, 수준, 세포 내 위치 및 세포 유형을 파악하는 것은 해당 유전자의 기능에 대한 이해에 기여합니다. ...

다음 실험의 전반적인 목표는 특정 유전자 발현 영역을 식별하고 유전자 발현의 타이밍과 수준을 특성화하여 유전자 기능에 대한 이해를 돕는 것입니다. 이는 조직의 무결성을 보존하기 위해 절차에 사용될 조직을 신속하게 채취하고 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 리보 프로브(ribo probe)의 배경 결합을 줄이기 위해 조직을 처리합니다.다음으로, 리보 프로브(ribo probe)를 조직에 하이브리드화하여 RIBA 프로브의 결합을 시각화합니다. X선 필름이나 광민감 에멀션을 사용하여 X선 이미지 또는 암시야 및 명시야 현미경 관찰과 분석을 통해 유전자 발현의 위치와 수준을 나타내는 결과를 얻습니다. Image J 소프트웨어를 사용할 때, 많은 사람들이 실수하는 매우 중요한 몇 가지 단계가 있으며, 그중 하나는 배경 노이즈(background)를 방지하는 것입니다.불충분한 포화나 부적절한 온도에서의 하이브리드화와 같이 배경 신호를 유발할 수 있는 여러 단계가 있습니다. 또 다른 원인은 RNA 프로브를 분해하는 RNA 오염입니다. 따라서 모든 과정에서 RNase-free 상태를 유지하는 데 주의해야 합니다.세 번째로, 슬라이드를 에멀젼에 담글 때 암실 내에 빛이 새어 들어오지 않도록 주의해야 하며, 최대 3주까지 소요될 수 있는 전체 과정 동안 에멀젼이 빛에 노출되지 않도록 해야 합니다. 따라서 이 기술의 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Hun Chen이 맡게 되었습니다. 신선한 뇌를 채취하여 1× PBS로 헹군 후, 상온에서 매질이 담긴 몰드에 뇌를 침지시켜 OCT tissue tech 매질에 포매합니다.절편 제작에 필요한 방향으로 뇌의 방향을 맞추십시오. 그 다음 드라이아이스에 에탄올을 분무한 후, 블록을 에탄올과 드라이아이스 혼합물에 넣어 조직을 동결시키십시오. 에탄올이 블록 내부로 들어가지 않도록 주의하며, 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 동결된 조직을 10~12 µm 두께의 절편으로 자르고 뇌 및 배아 조직용 super plus 슬라이드에 부착하십시오.최적의 절편 제작 온도는 -18 °C에서 -20 °C 범위 내입니다. 절편은 슬라이드 보관함에 넣어 -80 °C에서 보관하십시오. -80 °C 보관함에서 꺼낸 슬라이드는 드라이아이스 위에 놓인 금속 랙으로 옮기십시오.그다음 인증된 흄 후드 내에서, 실온보다 3~5°C 높게 예열된 4% para formaldehyde 용액에 랙을 넣습니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 랙을 para formaldehyde에서 꺼내고, 랙을 PBS에 15회 담가 슬라이드를 세척합니다. 매번 신선한 PBS 용액을 사용하여 이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.다음으로, RIBA 프로브의 비특이적 결합을 줄이기 위해 슬라이드를 갓 준비한 아세틸화 완충액에 10분 동안 담급니다. 그 후 이전과 동일하게 슬라이드를 세척하되, 이번에는 세척액으로 2배 SSPE를 사용합니다. 70%, 95%, 100% 에탄올 시리즈를 사용하여 각 용액에서 2분씩 조직을 탈수시킵니다.그런 다음 흄 후드 내에서 슬라이드를 최소 10~15분 동안 건조합니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 RIBA 프로브를 합성한 후, 모든 슬라이드에 필요한 RIBA 프로브와 하이브리다이제이션 용액의 부피를 계산합니다. Ribo 프로브 하이브리다이제이션 믹스를 65 °C에서 5분 동안 예열합니다.Ribo probe를 변성시키기 위해 Ribo probe hybridization solution 100 µL를 피펫으로 분주하여 커버슬립 전체에 정렬합니다. 그다음 두 번째 유리 커버슬립을 사용하여 조직과 커버슬립 위에 용액을 고르게 펴 바릅니다. 슬라이드를 금속 랙에 수평으로 세워 배치하고, 모든 슬라이드가 준비되면 랙을 65 °C 오일 배스에 천천히 담가 최소 4시간에서 최대 16시간 동안 유지합니다.오일은 배양 후 커버슬립 주변에 기밀 씰을 형성합니다. 슬라이드가 담긴 금속 랙에서 과잉 오일을 닦아냅니다. 그다음 흄 후드 내의 클로로포름이 담긴 유리 또는 금속 트레이에 랙을 넣습니다. 신선한 클로로포름이 담긴 두 번째 트레이에서 세척 과정을 반복합니다.다음으로, 커버슬립을 느슨하게 하고 과잉 하이브리다이제이션 용액을 용해시키기 위해 랙을 0.1% beta-mercaptoethanol과 2× SSPE 용액 혼합물에 담급니다. 그 후 슬라이드를 신선한 0.1% beta-mercaptoethanol 및 2× SSPE 용액이 담긴 두 번째 용액으로 옮깁니다. 커버슬립이 제거된 슬라이드를 0.1% beta-mercaptoethanol과 2× SSPE가 포함된 트레이 내의 새 랙으로 옮기고, 결합되지 않은 과잉 RNA 프로브를 제거하기 위해 실온에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 슬라이드 랙을 65°C로 예열된 2× SSPE 및 50% 폼아마이드(formamide) 용액(최종 농도 0.1%의 beta ME와 에탄올 포함)으로 옮겨 65°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 이 용액과 이전의 모든 수성 세척 용액 및 커버슬립을 방사성 폐기물로 폐기합니다. 다음으로, 65°C로 예열된 0.1× SSPE에서 슬라이드를 각각 30분씩 2회 세척합니다.그 후 조직을 70%, 95%, 100% ethanol 시리즈로 각각 2분씩 처리하여 탈수시킵니다. 마지막으로 슬라이드를 흄 후드 내에서 최소 30분 동안 건조합니다. 먼저 조직 내에 방사성 신호가 존재하는지 확인합니다.건조된 슬라이드를 필름 카세트에 넣고, 안전등을 사용하는 암실에서 슬라이드 위에 X선 필름을 배치하십시오. 슬라이드가 필름의 유제면을 향하고 있는지 확인한 후 카세트를 닫으십시오. 전사체의 예상 풍부도에 따라 슬라이드를 필름에 1일에서 7일 동안 노출시키십시오.노광이 완료되면, 표준 현상액과 정착액을 사용하여 X선 필름을 현상합니다. 하이브리다이제이션 신호는 유제 내의 노출된 은 입자로 인해 필름 상에 검은 영역으로 나타나며, 이를 통해 세포 해상도를 결정하고 조직 자체의 신호를 확인할 수 있습니다. 슬라이드를 사진용 유제에 담근 후 대조 염색을 수행합니다.슬라이드를 크리스탈 바이올렛으로 대조 염색하려는 경우, 서면 프로토콜의 지침에 따라 섹션을 탈파라핀화해야 합니다. 이때 암실에서 튜브에 증류수를 붓습니다. NTB 에멀젼을 덜어낸 후, 증류수와 1:1 비율로 에멀젼을 희석합니다.에멀젼을 42 °C 항온수조에서 20~30분 동안 녹인 후, 42 °C 항온수조에 놓인 유리 침지 용기에 옮깁니다. 슬라이드를 담갔을 때 희석된 에멀젼의 높이가 슬라이드의 모든 섹션을 덮어야 합니다. 슬라이드 수가 많을 경우, 에멀젼이 추가로 필요할 수 있습니다.이제 슬라이드를 42 °C 항온수조에 담긴 희석된 에멀젼에 담근 후, 암실 내 밀폐된 차광 용기에서 하룻밤 동안 건조하거나, 조명을 끈 37 °C 오븐에서 2~3시간 동안 건조합니다. 건조 후 슬라이드를 슬라이드 보관함으로 옮깁니다. 가장자리를 검은색 전기 테이프로 밀봉한 다음 알루미늄 호일로 덮습니다.박스를 4 °C에서 수일에서 수주 동안 보관하고, 현상 준비가 되면 슬라이드를 상온으로 가온합니다. 그런 다음 암실에서 슬라이드가 담긴 랙을 박스에서 꺼내 16 °C의 codec D 19 현상액에서 3~5분 동안 현상합니다. 다음으로, 현상된 슬라이드를 상온의 수돗물로 1분 동안 세척합니다.그 다음, 슬라이드를 19 °C의 고정액에 6분씩 두 번 배양합니다. 두 번째 고정액 배양 중에는 실내 조명을 켜도 됩니다. 이제 실온의 흐르는 물에 슬라이드를 최소 30분 동안 세척하십시오. 그런 다음, 슬라이드가 아직 젖어 있는 상태에서 면도날을 사용하여 슬라이드 뒷면의 에멀션을 긁어냅니다.마지막으로 0.3% crystal violet로 대조 염색을 한 후, 필요한 경우 서면 프로토콜의 지침에 따라 슬라이드를 탈수 및 마운트합니다. 슬라이드 뒷면에 남은 과잉 에멀젼은 물로 적신 후 면도날로 긁어내어 추가로 제거합니다. 슬라이드를 80% ethanol 용액으로 헹구고, 이물질과 먼지를 제거하기 위해 한두 번 부드럽게 닦아냅니다.암시야 또는 명시야 조명 하에서 사진을 촬영하십시오. 해부 현미경의 암시야 상태에서 쉽게 관찰되는 먼지 입자 없이 깨끗한 이미지를 얻기 위해서는 긁어내기와 세척 단계를 2~3회 반복해야 할 수도 있습니다. 다음 이미지들은 X선 필름을 이용한 in situ hybridization의 자기방사법 예시입니다.이 X선 필름 이미지는 Fox P1에 대한 antisense ribo probe로 하이브리드화한 배아 10일차 금화조(zebra Finch) 송버드의 머리 전체 시상면 절편을 보여줍니다. 필름 위의 검은색 노출 입자들은 messenger RNA 발현을 나타내며, 뇌 내부에서 확인할 수 있듯이 Fox P1 messenger RNA는 여기서 meso alium stri aum과 dorsal thalamus에 풍부하게 분포되어 있습니다. 이 X선 필름 이미지는 Cuper에 대한 antisense RIBA probe로 하이브리드화한 동일한 금화조 송버드의 절편을 보여줍니다.TF two Co. TF two는 palam alium과 더 복측 시상(ventral thalamus)의 필요 영역에서 농축되어 있습니다. 다음 이미지들은 에멀젼 딥 슬라이드의 in situ hybridization 자동 방사선 촬영 예시입니다. 해부 현미경으로 촬영한 이 암시야 이미지는 Fox P one에 대한 antisense RIBA 프로브로 하이브리드화된 부화 후 6일차 금화조의 머리 전체 시상면 절편을 보여줍니다.조직 위 에멀션 내에 하얗게 노출된 은 입자는 messenger RNA 발현을 나타냅니다. 붉은색은 kressel violet 염색을 나타냅니다. 스케일 바는 1 mm를 나타냅니다.여기 이미지는 antisense ribo probe를 사용하여 coop TF two를 하이브리드화한 동일한 금화조(zebra finch)의 단면을 보여줍니다. 다음 이미지들은 배아 12일 차 금화조의 머리 절편 X선 필름 자동방사법(autoradiography)에서 나타나는 antisense 및 sense 표지의 서로 다른 패턴을 비교하여 보여줍니다. 점선은 뇌 전체의 윤곽을 나타내며, C는 소뇌(cerebellum)를 표시합니다.PAC six의 안티센스 가닥이 뇌, 특히 뇌실구역에서 발현되는 것을 확인할 수 있습니다. 이와 인접한 절편을 PAC six의 센스 가닥과 혼성화시킨 결과, 배아 머리 전체에서는 배경 발현이 나타나지 않았으나 안티센스 가닥과 마찬가지로 망막의 색소층에서는 뚜렷한 발현이 관찰되었습니다. 다음 이미지 C는 배아 후기 단계의 금화조 뇌에서 채취한 슬라이드에 대해 명시야 및 암시야 뷰로 관찰한 두 가지 유전자 발현 신호와 에멀전 디핑(emulsion dipped) 결과를 보여줍니다.이 명시야 이미지는 배아 10일차의 D one B 발현을 보여줍니다. 에멀전에 정상적으로 노출시켰을 때, 검은색으로 나타나는 라벨은 이 배율에서 거의 보이지 않습니다. 이 이미지는 이전 이미지와 동일한 절편 및 배율을 보여주지만, 암시야 뷰로 전환하여 선조체와 시상에서 흰색으로 나타나는 라벨링을 보여줍니다.이 명시야 이미지는 배아 12일차의 slit three 발현을 보여줍니다. 에멀젼에 과노출시킨 후, 검은색 라벨을 쉽게 확인할 수 있습니다. SC는 척수의 위치를 나타내며, CB는 소뇌의 위치를 나타냅니다.吻측(Rostral)은 왼쪽을 향하고 있습니다. 여기에 제시된 이미지는 동일한 절편과 배율에서 촬영되었으나 암시야(dark field) 뷰로 전환한 것으로, 명시야 이미지와 일치하는 척수 내의 표지가 흰색으로 나타납니다. 이어지는 이미지들은 세포 수준에서의 은 입자 해상도를 보여줍니다.여기에는 금화조 전뇌의 Fox P1 messenger RNA 표지가 나타나 있으며, 크레실 바이올렛으로 염색된 세포 위에 은 입자가 검은 점으로 보입니다. 이 이미지는 성체 금화조 mesoalium의 개별 세포에서 높은 발현량이 나타남을 보여줍니다. 이 이미지는 동일한 절편의 인접한 alium에 있는 개별 세포에서 낮은 발현량이 나타남을 보여줍니다.Hi Fox. P1 messenger RNA의 세포 발현이 배아 12일차 중배엽 상피에서 관찰됩니다.여기서 보이는 배아 세포들은 이전 두 이미지에서 보인 성체 세포들에 비해 크기가 더 작고 더 조밀하게 밀집되어 있습니다. 마지막으로, 이 이미지는 동일한 절편의 인접한 alium 내 세포들에서 발현량이 낮게 나타나는 것을 보여줍니다. 이 절차를 따른 후에는, 표적 유전자가 어떤 세포 유형에서 발현되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역화학법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 기관 하이브리다이제이션(institute hybridization) 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 방사성 시약을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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